إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل
Summary
هنا، نقدم بروتوكول مفصل لإعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات نقية بالكامل في البروتيوليبوسومات المحددة.
Abstract
كمركز للفوسفور التأكسدي والتنظيم المبرمج، تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في صحة الإنسان. تعتمد وظيفة الميتوكوندريا المناسبة على نظام مراقبة جودة قوي للحفاظ على التوازن البروتيني (داء البروتيستاسيس). وقد تم ربط الانخفاض في البروتيستاسيس الميتوكوندريا للسرطان, الشيخوخة, تنكس الأعصاب, والعديد من الأمراض الأخرى. Msp1 هو AAA + ATPase الراسية في الغشاء الميتوكوندريا الخارجي الذي يحافظ على البروتيوستاسيس عن طريق إزالة البروتينات التي ترتكز على الذيل معكوسة بشكل خاطئ. باستخدام المكونات المنقى المعاد تشكيلها في البروتيوليبوسومات، أظهرنا أن Msp1 ضروري وكافية لاستخراج بروتين نموذجي يرتكز على الذيل من طبقة ثنائية الدهون. لدينا نظام مبسط إعادة تشكيلها يتغلب على العديد من الحواجز التقنية التي أعاقت دراسة مفصلة لاستخراج البروتين الغشاء. هنا، ونحن نقدم أساليب مفصلة لتوليد الليبوسومات، وإعادة تشكيل البروتين الغشاء، واستخراج Msp1 المقايسة.
Introduction
تعتمد الوظيفة الخلوية المناسبة على عملية تسمى البروتيوستازي ، والتي تضمن أن البروتينات الوظيفية هي في التركيز الصحيح والموقع الخلوي1. الفشل في البروتيوستاسيس يؤدي إلى ضعف وظيفة العضيات وترتبط مع العديد من الأمراض العصبية2,3,4. البروتينات الغشاء تمثل تحديات فريدة من نوعها لشبكة البروتيوستازي كما يجب أن تكون موجهة إلى الغشاء الصحيح مع تجنب التجميع من المجالات transmembrane الكاره للماء (TMDs)5. وبالتالي، تطورت الآلات المتخصصة لحماية TMD الكاره للماء من السيتوسول وتسهيل الاستهداف والإدخال في الغشاء الخلوي المناسب6و7و8و9و10و11و12و13و14و15.
الميتوكوندريا هي محور الأيض للخلية وتشارك في العديد من العمليات الخلوية الأساسية مثل: الفوسفور التأكسدي، وتوليد كتلة الحديد والكبريت، وتنظيم أبوتوبوتيك16،17. تحتوي هذه العضيات التكافلية على غشاءين، يشار إليهما باسم غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) والغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM). أكثر من 99٪ من بروتينات الميتوكوندريا البشرية 1500 مشفرة في الجينوم النووي وتحتاج إلى نقلها عبر واحد أو اثنين من أغشية مختلفة18،19. وبالتالي تعتمد وظيفة الميتوكوندريا المناسبة على شبكة بروتيوستاستاس قوية لتصحيح أي أخطاء في استهداف البروتين أو نقله.
يركز مختبرنا على مجموعة فرعية من بروتينات الغشاء الميتوكوندريا تسمى بروتينات الذيل الراسية (TA) ، والتي لها مجال واحد عبر الميمبران في C-terminus20و21و22و23و24. وتشارك بروتينات TA في عدد من العمليات الأساسية، مثل موت الخلايا المبرمج، ونقل الحوييل، ونقل البروتين25. طوبولوجيا فريدة من نوعها من البروتينات TA يتطلب الإدراج بعد الترجمة، والذي يحدث في reticulum endoplasmic (ER) من قبل دخول الموجه من الذيل الراسية (GET) أو مسارات بروتين الغشاء الشبكي الإنتوبلازمي (EMC) أو في OMM من قبل مسار سيئة الخصائص20،26،27،28. الخصائص الفيزيائية الحيوية للMMD ضرورية وكافية لتوجيه بروتينات TA إلى الغشاء الصحيح29. الاعتراف بالخصائص الفيزيائية الحيوية بدلا من عزر تسلسل محدد يحد من إخلاص مسارات الاستهداف5. وبالتالي ، فإن سوء تقدير بروتينات TA هو إجهاد شائع لشبكات البروتيوستاسي. الإجهاد الخلوي، مثل تثبيط مسار GET، يسبب زيادة في سوء حساب البروتين إلى OMM والخلل الوظيفي الميتوكوندريا ما لم تتم إزالة هذه البروتينات على الفور30،31.
وهناك موضوع مشترك في بروتيوستسيس الغشاء هو استخدام AAA + (ATPase Aالمرتبطة الخلوية Activities) البروتينات لإزالة البروتينات القديمة، التالفة، أو مغلوطة من طبقة الدهون1،32،33،34،35،36،37،38 . البروتينات AAA + هي المحركات الجزيئية التي تشكل حلقات سداسية وتخضع لحركات تعتمد على ATP لإعادة تشكيل الركيزة ، وغالبا عن طريق النقل من خلال المسام المحورية الضيقة39،40. على الرغم من أن جهدا كبيرا قد كرس لدراسة استخراج البروتينات الغشاء من قبل AAA + ATPases، وإعادة تشكيل معقدة أو تنطوي على خليط من الدهون والمنظفات41،42، مما يحد من القوة التجريبية لفحص آلية استخراج الركيزة من طبقة ثنائية الدهون.
Msp1 هو AAA + ATPase المحفوظة للغاية الراسية في OMM والبيروكسيسومات التي تلعب دورا حاسما في بروتيوستاسي الغشاء عن طريق إزالة بروتينات TAمغلوطة 43،44،45،46،47. Msp1 كما تبين مؤخرا لتخفيف التوتر استيراد البروتين الميتوكوندريا عن طريق إزالة البروتينات الغشاء التي المماطلة أثناء النقل عبر OMM48. فقدان Msp1 أو الإنسان homolog ATAD1 النتائج في تجزئة الميتوكوندريا، والفشل في الفوسفور التأكسدي، والمضبوطات، وزيادة الإصابة بعد السكتة الدماغية، والموت المبكر31،49،50،51،52،53،54،55،56.
لقد أظهرنا أنه من الممكن إعادة تشكيل بروتينات TA مع Msp1 والكشف عن الاستخراج من طبقة ثنائية الدهون57. يستخدم هذا النظام المبسط بروتينات نقية بالكامل أعيد تشكيلها في ليبوسومات محددة تحاكي OMM (الشكل 1)58،59. يمكن لهذا المستوى من التحكم التجريبي معالجة الأسئلة الميكانيكية التفصيلية لاستخراج الركيزة التي هي مستعصية تجريبيا مع إعادة تشكيل أكثر تعقيدا تنطوي على بروتينات AAA + أخرى. هنا، نقدم بروتوكولات تجريبية تفصل أساليبنا لإعداد الليبوسوم، وإعادة تشكيل بروتين الغشاء، ومقايسة الاستخراج. ونأمل أن تسهل هذه التفاصيل التجريبية إجراء مزيد من الدراسة لعملية البروتيستاسيس الغشائية الأساسية ولكن غير المفهومة جيدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد وظيفة الميتوكوندريا المناسبة على نظام قوي لمراقبة جودة البروتين. نظرا للحدود المتأصلة في إخلاص مسارات استهداف بروتين TA ، فإن بروتينات TA غير المعايرة هي مصدر ثابت للإجهاد للميتوكوندريا. أحد المكونات الرئيسية لشبكة البروتيوستازي الميتوكوندريا هو Msp1 ، وهو غشاء راسي AAA + ATPase يزيل بروتي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد طور MLW جزءا من هذا البروتوكول خلال دراساته بعد الدكتوراه مع الدكتور روبرت كينان في جامعة شيكاغو.
يتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة 1R35GM137904-01 إلى MLW.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
References
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
- Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
- McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
- Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
- Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
- Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
- Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
- Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
- Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
- Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
- Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
- Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
- Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
- Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
- Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
- Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
- Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
- Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
- Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
- Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
- Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
- Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
- McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
- Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
- Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
- Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
- Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
- van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
- Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
- Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
- Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
- Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
- Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
- Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
- Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
- Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
- Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
- Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
- Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
- Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
- Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
- Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
- Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
- Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
- Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
- Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
- Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
- Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
- Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
- Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
- Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
- Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).
