感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)

実行されたすべての手順は、ワシントン大学の動物管理および使用委員会(動物研究プロトコル#4481-02)によって、または英国内務省ライセンス(PPL 30/3281)およびブリストル大学倫理レビューグループに準拠して、ローカルで承認されました。両機関で実施された実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明と一致していました。PMUは6〜10週齢のC57BL / 6Jマウスで生成されました。ブドウ膜炎誘発時のマウスの体重は全て18g以上であり、Crb1遺伝子29のrd8変異については陰性が確認された。マウスは、特定の病原体のない条件下で、標準的な飼料と薬用水(アセトアミノフェン200〜300 mg / kg /日)を 自由に 維持しました。.動物の安楽死は、標準的な二酸化炭素吸入方法30を用いて行った。 1.皮下注射用抗原製剤 Mtb H37Raパウダーとの吸入または皮膚接触を防ぐために、化学ヒュームフード内でこのセクションのすべての手順を実行してください。完全なフロイントアジュバント(通常はBSL-1)の制度的方針に従って処理してください。これには、耐薬品性手袋、安全メガネ、防護作業服(白衣)の使用が含まれます。 実験動物に導入される試薬の汚染を防ぐために、優れた滅菌技術を使用してください。 5 mLの微量遠心チューブで5 mgの凍結乾燥され、熱死した 結核菌 H37Ra粉末と2.5 mLの冷たいPBSを混合することにより、PBS中のMtb懸濁液を作ります。30秒間一度渦を流してから、氷の上に置きます。 PBS中のH37Raの微細懸濁液を生成するには、氷上で懸濁液を5分間超音波処理する。アンプを外しますampコンバーターユニットの本体と、70%(v / v)アルコール綿棒でプローブを清掃します。 超音波処理器の電源を入れ、電源制御ノブを回して電力設定を4に調整し、プローブの先端をPBS含有マイコバクテリア粉末に浸します。プローブの先端がサンプルの少なくとも半分の深さまで浸されていること、およびプローブの先端がマイクロ遠心チューブの壁に触れていないことを確認してください。 氷上で混合物を30秒間超音波処理し、30秒間一時停止し、合計5分間繰り返して、液体を加熱せずに粉末を均一な懸濁液に完全に分散させる。 フロイントの不完全なアジュバントの2.5mLを混合物に加え、エマルジョンが練り歯磨きのような粘稠度を形成するまで氷上で超音波処理プロセスを繰り返します。 コントロールノブを使用して電源を0に設定し、ユニットの電源を切って超音波処理を終了します。懸濁液からチップを取り外し、アルコール綿棒でプローブを拭きます。 抗原エマルジョンは4°Cで保存する。 エマルジョンのバッチを作成することは、実験間の一貫性を確保するのに役立ちます。エマルジョンは4°Cで最大3ヶ月間保存できます。 2.皮下注射 硝子体内注射の1週間前に皮下注射を行います(-7日目として指定)。. 1 mLシリンジ(針は付いていません)にマイコバクテリアエマルジョンをロードします。.エマルジョンの粘度と不透明度のために、見えにくい気泡がシリンジを満たす可能性があります。シリンジ内の気泡を防ぐために、0.2〜0.3 mLのエマルジョンをロードした後、シリンジを反転させ(先端を上に向けて)、カウンターの端でシリンジを繰り返し軽くたたき、気泡を表面に持ってきます。 シリンジから空気を排出し、シリンジの充填を続けます。反転し、いっぱいになるまで断続的にタップします。 シリンジに25 Gの針を置き、エマルジョンを進めて針を満たします。使用するまでシリンジを氷上に保管してください。 皮下注射を安全に行うには、マウスを麻酔するか、または動物の後肢31に容易にアクセスできるようにする人道的拘束方法を利用する。 皮下注射のために麻酔をかけるには、動物をイソフルラン誘導チャンバー(誘導用に3%〜4%、維持用に1%〜3%)に入れる。麻酔をかけたら、マウスの呼吸数が遅く、呼吸困難の兆候がないことを確認します。. 皮下注射を腰の背側表面、または鼠径リンパ節の領域に近い脚の腹側表面のいずれかに配置します。筋肉への注入を防ぐために慎重に針を挿入します。0.05 mLのMtbエマルジョンを皮下腔に注入します。濃厚なエマルジョンを完全に注入するために、すぐに針を取り外さないでください。 左側と右側の両方で注射を繰り返し、動物あたり合計0.1 mLにします。. 麻酔をかけた場合は、完全に回復するまでマウスを温かい加熱パッドに置きます。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。. 完全に回復したらマウスをケージに戻し、ケージカードに皮下注射の日付をラベル付けします。 鎮痛剤に経口アセトアミノフェン(200 mg / kg /日)を提供しますが、抗炎症剤はブドウ膜炎の誘発に影響を与える可能性があるため、NSAIDは提供しません。. 3.硝子体内注射のための抗原ストック製剤 硝子体内Mtb懸濁液の汚染を防ぐために、適切な無菌条件下でこのセクションのすべての手順を実行してください。 硝子体内懸濁液を作ります。軽度から中等度の汎ブドウ膜炎の誘発のために、5 mgのマイコバクテリア抽出物を1 mLの1x PBSに加えることにより、硝子体内懸濁液を5 mg / mLの濃度で作ります。. 中等度から重度の汎ブドウ膜炎の誘発のために、10 mgのマイコバクテリア抽出物を1 mLの1x PBSに加えることにより、硝子体内懸濁液を10 mg / mLの濃度で作ります。. 30秒間一度渦を流してから、氷の上に置きます。 PBS中のH37Raの微細懸濁液を生成するには、ステップ1.4に記載されているように、氷上で10分間懸濁液を超音波処理します。このストック溶液を100 μLの容量で分注し、-20°Cで保存します。 使用前に、室温で解凍し、1分間強気でボルテックスします。動物施設に輸送している間、アリコートを氷上に保管してください。 4.0日目の硝子体内注射手順 動物の準備装着された検査用手袋を着用し、マウスを計量天秤の上に置き、グラム単位で重量を取得します。 100 mg / mLのケタミンと20 mg / mLのキシラジンを含む溶液を0.02 mL / g体重の腹腔内注射を滅菌水と混合して動物に麻酔をかけます。.別のアプローチには、~1.5%イソフルラン(吸入)を使用した誘導が含まれます。 マウスが眠りにつくまで約2分待ってから、マウスを保温ボックスに入れて蓋をします。耳、つま先、尾のつまみなどの痛み反射テストを実行して、手順32の麻酔の深さを評価します。 眠ったら、0.5%(v / v)テトラカインを1滴で角膜に麻酔します。マウスの鼻や口の近くにテトラカインが入らないようにしてください。10秒後、余分な液体を軽くたたきます。注:局所麻酔を投与すると、虹彩拡張と前房(AC)の視覚化が改善されることが観察されており、おそらく全身麻酔と局所麻酔の組み合わせによる角膜反射抑制の改善によるものです。.ただし、必要に応じてこの手順を省略できます。 2.5%(v / v)フェニレフリンを1滴垂らして瞳孔を拡張します。鼻や口に入る可能性のある過剰な飛沫を避けるために注意してください。2〜3分後、余分な液体を軽くたたきます。 眼内炎のリスクを減らすには、目の表面と周囲の髪に5%ベタジンを1滴加えます。2〜3分間目につけたままにします。注意: 眼内炎を防ぐために、適切な無菌条件下でこのセクションのすべての手順を実行してください。 ベタジンを除去し、麻酔下での乾燥を防ぐために、ヒプロメロース(0.3%)またはカルボマーアイジェル0.2%w / w)で目を覆います。.これは白内障の形成を防ぐのにも役立ちます。 マイクロインジェクションシステムのセットアップマイクロシリンジポンプコントローラーと注射シリンジに接続されたマイクロポンプを使用して硝子体内注射を実行します(図1A-C)。または、サブセクション33で説明されているように、ハミルトンシリンジに取り付けられた4.4G針を注入します。 34Gの針をインジェクションホルダーに接続して、インジェクターを組み立てます。注射ホルダーの前端にある銀色のスクリューキャップを緩め、針をホルダー本体に半分ほどスライドさせます。銀色のスクリューキャップの指をしっかりと締めます。 手順4.2.4〜4.2.5で説明されているように、チューブを射出ホルダーに接続します。 インジェクションホルダーにチューブを挿入するには、ホルダーの後端にあるプラスチックネジを緩め、チューブを内側のガスケットに通してネジを締めます。 注入中のチューブの損傷を防ぐために、チューブの端とわずかな隙間を空けてください。 図1Cを参照してください。 100 μLのアリコートのマイコバクテリウムストック懸濁液を解凍します。 3 μLの1%フルオレセインナトリウム(AK-Fluor)溶液を加え、ボルテックスウェルを加えます。 10 μLのシリンジに、気泡を含まない抗原とフルオレセインの混合物を入れます。 シリンジからローディングニードルを取り外し、先端がシリンジ本体のゼロマークに達するまで、チューブを銀色のスクリューキャップガスケットに通します。 チューブの先端が目的の位置に正しく位置合わせされたら、スクリューキャップの指をしっかりと締めます。 注射管を通してシリンジ内の溶液を洗い流し、システムを完全にロードします。次に、手順4.2.8〜4.2.11を繰り返して、注射用のシリンジをリロードします。 ロードされたシリンジをマイクロポンプに取り付けるには、clを押しますamp マイクロポンプの端にあるリリースボタンを押して、シリンジclを開きますamps。 プランジャーのキャップをマイクロポンプの後端にあるプランジャーキャップホルダーに配置します。 次に、シリンジカラーをカラーストップにスライドさせ、シリンジ本体をシリンジクランプにスライドさせます。 clを放しますamp ボタンとプランジャー固定ネジを締めます。 図1Dを参照してください。 注射ホルダーと針を定位注入装置のOクランプに通します。これはカスタムプラットフォームです。あるいは、シリンジを手動で保持して配置することもできます。 マイクロシリンジポンプコントローラーの注入量と注入速度を、それぞれ40 nL/sの速度でサイクルあたり500 nLを注入するように設定します。注意: より速い注入速度を使用できますが、針の再配置を達成する前に、より多くの逆流が発生する可能性があります。 硝子体内注射を実行する前に、システムをテストして正しく機能していることを確認します。.注意: 噴射システムが正常に機能している場合、フットペダルまたはコントロールパッドを使用して噴射サイクルをアクティブにすると、プランジャーキャップホルダーが目に見える動きをし、針の先端に緑がかった液体の小さな液滴が見られます。液体が生成されない場合は、追加のサイクルをアクティブにするか、シリンジをフラッシュしてリロードします。 目を注入する前に、95%エタノールパッドで針をそっと拭きます。 硝子体内注射手順マウスを定位固定装置に置き、注射手順を実行する。 マウスが置かれているステージ/プラットフォームの表面に2〜3枚のペーパータオルを取り付けて、暖かく保ちます。 マウスをプラットフォーム上で腹臥位に置きます。左右のイヤーバーを使用して、動物の頭をそっと固定します。 図1Eを参照してください。 マウスを置き、右目の上鼻面が見えるようにスコープの下に向きを変えます。 30 Gの針を使用してまつげを移動させ、強膜を露出させます。辺縁と橈骨血管を視覚化します。 滅菌した30 Gの針を使用して、四肢の後方1〜2 mmの強膜にガイド穴を開けます。 注射ホルダーに取り付けられた34Gの針を、レンズを避ける角度でガイド穴から目に挿入しますが、針先を硝子体腔に入れます。 マイクロシリンジポンプコントローラーを使用して、1 μLのMtb抽出物を硝子体腔に注意深く注入します。一貫した逆流の場合は、適切な用量送達を確保するために、注入量を1.5μLに増やします。.注:偽コントロールの場合は、1μLのPBSを動物の目に注入します。 目の緑がかった反射を視覚化することにより、硝子体内配置を確認します。 図1Fを参照してください。 10秒後、針を目から引き抜きます。逆流に注意してください。 プラットフォームからマウスを取り外し、角膜保護のために0.3%ヒプロメロースまたは0.2%w / wカルボマー眼軟膏を両眼に配置し、回復加温ボックスに移動します。 胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。.完全に回復するまで他の動物の会社に戻らないでください。 マウスが完全に目覚めたら、ケージに戻り、アセトアミノフェン(200-300 mg / kg /日)薬用ウォーターボトルを追加します。.ケージカードにIVT注射の日付をラベル付けします。 硝子体内注射は一般的に忍容性が良好です。.痛みと研究からの除去の必要性を示す可能性のある臨床徴候には、眼周囲脱毛症(自己外傷を示す)、角膜潰瘍、体重減少、および猫背姿勢が含まれます。 硝子体内注射の代替方法注:この手順は、手術顕微鏡とマイクロシリンジの33G針を使用して実行されます。目を支え、鉗子で所定の位置に保持します。 次に、カルボマーアイジェル0.2%w / wまたは0.3%ヒプロメロースアイジェルを塗布し、円形のカバーガラス(直径7 mm)を目の上に置きます。 33 Gの皮下注射針を5 μLのハミルトンシリンジに取り付け、角膜の縁に対して約2 mmの円周方向に~45°の注入角度で挿入します。 針の斜角を硝子体に導き、レンズと視神経乳頭の間で停止し(外科医の相対的な観点から、これは視神経乳頭の上/カバー-挿入部位から約1.5 mm)、2 μLのMtb(PBSで2.5 ug / μL)をゆっくりと注入します。 針を短時間所定の位置に保持してから(注射液の逆流量を減らすため)、取り外します。 注射後、鉗子を解放して地球を置きます。注射後の眼内炎からのさらなる保護を提供するために、この時点で1%w / wクロラムフェニコール軟膏の滴を眼に投与することができる。 注射後、手順4.3.11〜4.3.13で説明されているように、回復加温ボックスに移動します。 5.ブドウ膜炎を検出および定量するためのOCTイメージング 動物の準備手順4.1.2-4.1.4の説明に従ってマウスを麻酔します 1滴の2.5%フェニレフリンで瞳孔を拡張します。鼻や口に入る可能性のある過剰な飛沫を避けるために注意してください。2〜3分後、余分な液体を軽くたたきます。 麻酔下での乾燥を防ぐために、0.3%ヒプロメロースまたは0.2%w / wカルボマーゲルを目に置きます。これは白内障の形成を防ぐのにも役立ちます。 体の暖かさを維持するために外科用ガーゼの層でマウスを包み、動物カセットの上に置きます。バイトバーで頭を配置します。 前房と後房のOCT画像を取得します。注:前房と後房の画像を取得する場合は、白内障形成後の画像の劣化を防ぐために、最初に後房(PC)画像を取得してください。白内障の形成は、頻繁な潤滑と0.3%ヒプロメロースまたは0.2%w / wカルボマーアイジェルの塗布で防ぐことができます。長時間のイメージング(>10分)の場合、(ヒートパッドを使用して)マウスを暖かく保つことも役立ちます。OCTイメージングシステムの電源を入れた後、正しいイメージングレンズを固定し、必要に応じて基準アームの位置を調整します。 イメージングソフトウェアを開き、一意のマウスIDを作成して、OCTメーカーのプロトコルに従ってイメージングを開始します。 高速スキャンプロトコルで フリーラン オプションを使用して、視神経を後房画像の中心に置くか、角膜の頂点を前房画像に配置します。注: 表1 には、市販の2つの小動物イメージングシステムのイメージングプロトコルパラメータが含まれています。製品仕様については、材料表 を参照してください。 後房イメージングの場合は、OCTを目の表面に近づけます。レンズの表面を目に接触させないように注意してください。 目が正しく配置されたら、高速スキャンを停止してボリュームスキャンプロトコルを選択し、[ 照準 ]オプションでスキャンをアクティブにします。 後部セグメント画像の場合は、視神経が水平B-スキャンアライメント画像の中心にくるように調整し、網膜が垂直アライメント軸に整列するように調整します。 前眼部画像の場合は、水平B-スキャンアライメント画像と垂直アライメントB-スキャンアライメント画像の両方で角膜の頂点を中央に配置する位置を調整します。両方の画像に反射アーティファクトが存在すると、適切な位置合わせが確認されます。次に、反射アーティファクトを取り除くのに十分なほど水平画像をシフトします。 図2を参照してください。 [ スナップショット ]をクリックしてボリュームスキャンイメージをキャプチャし、[ 保存]をクリックします。 次に、平均化された中心線スキャンを取得します。スキャンプロトコルを開き、[ 目的 ]、[ スナップショット]の順にクリックします。同じパネルを右クリックし、[ 平均]をクリックします。 両方のレンズで各目に対して手順5.2.1〜5.2.9を繰り返します。 すべての画像が収集されたら、マウスをカセットから取り外し、手順4.3.11〜4.3.13にリストされているように、回復中に角膜を保護します。 6.OCTによる炎症のスコアリング 治療条件にマスクされている採点者の助けを借りてOCT画像をスコアリングします。注: マウス モデルの PMU では、 表 2 に示すスコアリング システムをお勧めします。 前房(AC)と後房(PC)の両方の画像が得られた場合は、これらのスコアを組み合わせて、各眼の最終スコアを取得します。注:前房の炎症は、後房の炎症の前に解消します。 7.死後組織学による炎症のスコアリング 実験の最後に、除核によって個々の眼を採取し、4%ホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィン包埋、切片化、およびH&E染色に進みます33。注:瞳孔視神経軸に沿った複数の4〜8μmセクションが推奨されます。注:表3に記載されているスコアリングシステムを使用して、マスクされたグレーダーによって片目の3つのセクションがスコアリングされ、 3つのセクションの平均スコアが最終的な組織学的炎症スコアとして報告されます。