JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית ראשונית (PMU) כמודל לאובאיטיס פוסט-זיהומית

Published: December 17, 2021
doi:
10.3791/62925
, , , ,
1Department of Ophthalmology,University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences,University of Bristol

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לגרימת דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית (PMU) בעכברים. שיטה זו מתארת את השלבים שיעזרו לייצר דלקת עיניים אמינה וחזקה במערכת מודל העכבר. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו עיניים אוביטיות ועיניים של עמיתים לא מודלקים מחיות בודדות לצורך הערכה נוספת עם מבחנים אימונולוגיים, תעתיקיים ופרוטאומיים.

Abstract

המונח ‘אובאיטיס’ מתאר קבוצה הטרוגנית של מצבים שכולם כוללים דלקת תוך עינית. באופן כללי, אובאיטיס מוגדרת על ידי אטיולוגיה: זיהום או אוטואימוניות. אובאיטיס זיהומית דורשת טיפול עם החומרים האנטי מיקרוביאליים המתאימים, בעוד אובאיטיס אוטואימונית דורשת טיפול עם סטרואידים או חומרים מדכאי חיסון אחרים. אובאיטיס פוסט-זיהומית היא צורה של אובאיטיס כרונית הדורשת סטרואידים כדי לשלוט בדלקת החיסונית לאחר ההדבקה הראשונית. אובאיטיס הקשורה לזיהום בשחפת Mycobacterium (Mtb) היא צורה מוכרת היטב של אובאיטיס פוסט-זיהומית, אך מנגנוני המחלה אינם מובנים במלואם. כדי להבין את התפקיד שממלאים אנטיגנים מיקובקטריאליים וליגנדות מולדות בגירוי דלקת עיניים כרונית בעקבות זיהום בשחפת, פותח המודל Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) לשימוש בעכברים. כתב יד זה מתאר את השיטות ליצירת PMU ולניטור המהלך הקליני של דלקת באמצעות פונדוס צבע והדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). PMU מושרה על ידי חיסון עם תמצית מיקובקטריאלית שנהרגה בחום ואחריה הזרקה תוך-גופית של אותה תמצית לעין אחת שבעה ימים לאחר מכן. דלקת עיניים מנוטרת לאורך באמצעות הדמיית in vivo ולאחר מכן איסוף דגימות למגוון רחב של בדיקות, כולל היסטולוגיה, ציטומטריה של זרימה, ניתוח ציטוקינים, qPCR או ריצוף mRNA. מודל העכבר של PMU הוא כלי חדש ושימושי לחקר תגובות העיניים ל- mTB, המנגנון של אובאיטיס כרונית, ולבדיקות יעילות פרה-קליניות של טיפולים אנטי דלקתיים חדשים.

Introduction

המונח ‘אובאיטיס’ מתאר קבוצה הטרוגנית של מצבים שכולם כוללים דלקת תוך עינית1. מודלים של אובאיטיס בבעלי חיים חשובים להבנת מנגנוני המחלה ולניסויים פרה-קליניים של טיפולים חדשים. מספר מודלים של בעלי חיים של אובאיטיס הוקמו2. השניים שנחקרו בהרחבה הם אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (או uveoretinitis; EAU) ואובאיטיס המושרה על ידי אנדוטוקסין (EIU). EAU נוצר בדרך כלל על ידי חיסון עם אנטיגנים עיניים או יכול להתרחש באופן ספונטני כאשר סובלנות מרכזית מופרעת בהיעדר הגן AIRE 3,4. גרסאות אחרות של המודל פותחו מאז 5,6,7 כדי לכלול פפטידים אובאיטוגניים שונים; אלה נבדקו בהרחבה 8,9,10. EAU הוא המודל העיקרי לצורות של אובאיטיס אוטואימונית תלוית תאי T כגון מחלת ווגט-קויאנאגי-הראדה וכוריורטיניטיס ציפורים בבני אדם. EIU נוצר על ידי הזרקה מערכתית או מקומית של ליפופוליסכריד חיידקי (LPS)10,11. EIU שימש כמודל של אובאיטיס חריפה הנוצרת על ידי הפעלת מסלולי איתות מולדים של מערכת החיסון12. שני המודלים סייעו להבנה הנוכחית של אימונולוגיה של העין, אך שניהם אינם מודלים יעילים לאובאיטיס כרונית פוסט-זיהומית. מודל Primed Mycobacterial Uveitis (PMU), שהוקם לאחרונה בעכברים, מספק כעת גישה לחקור ולהעריך היבטים קליניים ותאיים של צורה זו של אובאיטיס13.

קיימת שכיחות גבוהה של זיהום מיקובקטריאלי ברחבי העולם, עם למעלה מ-10 מיליון מקרים חדשים ויותר מ-1.4 מיליון מקרי מוות שדווחו על ידי ארגון הבריאות העולמי בשנת 201914. ביטוי אקסטרפולמונרי של זיהום שחפת פעיל (שחפת) כולל אובאיטיס והוא גורם מוכר היטב של אובאיטיס זיהומית15,16. הביטויים של אובאיטיס הקשורה לשחפת הם פרוטאן, אשר ככל הנראה משקף מספר מנגנונים שונים של המחלה הכוללים זיהום ישיר בעיניים, כמו גם דלקת פחות מובנת בתיווך מערכת החיסון17,18,19. המנגנונים המוצעים עבור sequelae פוסט-זיהומיות אלה כוללים תגובה דלקתית כרונית המתעוררת על ידי התמדה של זיהום פאוצ’י-בצילארי באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), תגובה דלקתית כרונית המתעוררת על ידי נוכחות של דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs) כתוצאה מזיהום עיניים שפונה בהצלחה, והפעלה לא הולמת של התגובה החיסונית הנרכשת נגד אנטיגנים עיניים בתהליך של חיקוי מולקולרי או אנטיגן התפשטות הנגרמת על ידי זיהום שחפת מערכתי20,21,22,23.

על מנת להשיג הבנה מכניסטית טובה יותר של אובאיטיס כרונית פוסט-זיהומית ולחקור את תפקידם של אנטיגנים מיקובקטריאליים בייזום מחלות, פותח מודל PMU לשימוש בעכברים13,24. בהתאם לכך, כדי לעורר דלקת, העכבר מקבל תחילה זריקה תת-עורית של אנטיגן מזן השחפת H37Ra המומת בחום כדי לחקות זיהום מערכתי, ולאחר מכן שבעה ימים לאחר מכן הזרקה תוך-גופית של אותו אנטיגן הניתן לעין שמאל או ימין כדי לחקות זיהום מקומי בעיניים. העוצמה והמשך של האובאיטיס הנובעת מכך מנוטרים על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית in vivo אורכית (OCT) והדמיה כספית של העין25. PMU מאופיין בדלקת פאנובאיטיס חריפה ודומיננטית מיאלואידית המתפתחת לאובאיטיס אחורית כרונית דומיננטית של תאי T עם ויטריטיס, דלקת רשתית פריווסקולרית ואזורים מוקדיים של נזק חיצוני לרשתית26. נוכחות של דלקת גרנולומטוס בקטע האחורי של העין מצביעה על כך שניתן להשתמש במודל PMU כדי לחקור כמה צורות של אובאיטיס קדמית (גרנולומטוס ולא גרנולומטוסית) ודלקת ביניים, שנראתה בחולים עם ראיות אימונולוגיות לזיהום Mtb בעבר27. בנוסף, הוצע כי המרכיבים של Mtb המומת בחום המשמשים במודל PMU מעוררים תגובות חיסוניות העומדות בבסיס ההיבטים של אובאיטיס חוזרת בחולים עם שחפת עיניים המגיבים לטיפול נגד שחפת (ATT)28. בשל ההבדלים בהתחלת המחלה ובמסלול הדלקתי בהשוואה ל- EAU ו- EIU, PMU מייצג מודל חייתי חדש של אובאיטיס שאינו תלוי בחיסון עם אנטיגנים עיניים ועשוי לסייע בהבהרת מנגנוני המחלה בחולים עם אובאיטיס כרונית. פרוטוקול זה מתווה את השיטות ליצירת PMU, ניטור המהלך הקליני של דלקת ואיסוף דגימות עיניים לניתוח לאחר המוות עם ציטומטריה של זרימה.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו אושרו באופן מקומי על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון (פרוטוקול מחקר בבעלי חיים # 4481-02) או בקונקורדנציה עם רישיון משרד הפנים של בריטניה (PPL 30/3281) וקבוצת הביקורת האתית של אוניברסיטת בריסטול. הניסויים שנערכו בשני המוסדות עלו בקנה אחד עם הצהרת האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. PMU נוצר בעכברי C57BL/6J בני 6-10 שבועות; כל העכברים שקלו לפחות 18 גרם בזמן אינדוקציה של אובאיטיס ואושרו כשליליים למוטציה RD8 של הגן Crb129. העכברים הוחזקו עם צ’או סטנדרטי ומים תרופתיים (פרצטמול 200-300 מ”ג/ק”ג/יום) עד ליביטום בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים. המתת חסד של בעלי חיים בוצעה בשיטה סטנדרטית של שאיפת פחמן דו חמצני30. 1. הכנת אנטיגן להזרקה תת עורית בצע את כל ההליכים בחלק זה בתוך מכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה או מגע של העור עם אבקת Mtb H37Ra. טפל בהתאם למדיניות המוסדית שלך עבור Adjuvant של פרוינד מלאה (בדרך כלל BSL-1). זה כולל שימוש בכפפות עמידות בפני כימיקלים, משקפי בטיחות וביגוד עבודה מגן (מעיל מעבדה). השתמש בטכניקה סטרילית טובה כדי למנוע זיהום של ריאגנטים כי יוכנסו לבעלי חיים ניסיוניים. הפוך את תרחיף Mtb ב- PBS על ידי ערבוב 5 מ”ג של אבקת M. שחפת H37Ra שהומתה בחום עם 2.5 מ”ל של PBS קר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ”ל. מערבולת פעם אחת במשך 30 שניות ואז מניחים על קרח. כדי ליצור השעיה עדינה של H37Ra ב-PBS, סונו את המתלים על קרח למשך 5 דקות.פתח את גוף יחידת הממיר ונקה את הבדיקה עם ספוגית אלכוהול של 70% (v/v). הפעל את הסוניקטור, כוונן את הגדרת צריכת החשמל ל-4 על-ידי סיבוב ידית בקרת החשמל וטבל את קצה הבדיקה באבקת המיקובקטריאליות המכילה PBS. ודא שקצה הבדיקה שקוע לפחות למחצית מעומק הדגימה ושקצה הבדיקה אינו נוגע בדופן צינור המיקרוצנטריפוגה. מנקים את התערובת על קרח למשך 30 שניות, משהים 30 שניות וחוזרים על הפעולה במשך 5 דקות בסך הכל כדי לפזר את האבקה במלואה לתרחיף אחיד מבלי לחמם את הנוזל. מוסיפים לתערובת 2.5 מ”ל של אדג’ובנט לא שלם של פרוינד וחוזרים על תהליך הסוניקציה על הקרח עד שהתחליב יוצר מרקם דמוי משחת שיניים. הגדר את הכוח ל- 0 באמצעות ידית הבקרה וכבה את היחידה כדי לסיים את הסוניקציה. הסר את הקצה מהמתלה ונגב את הבדיקה עם ספוגית אלכוהול. אחסן את תחליב האנטיגן ב 4 מעלות צלזיוס. יצירת אצוות של תחליב תסייע להבטיח עקביות בניסויים שונים. ניתן לאחסן את האמולסיה ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. 2. הזרקה תת עורית יש לבצע הזרקה תת עורית שבוע לפני ההזרקה התוך-גופית (המוגדרת כיום -7). טען מזרק 1 מ”ל (ללא מחט מחוברת) עם תחליב mycobacteria. בשל צמיגות ואטימות של תחליב, בועות אוויר קשה לראות יכול למלא את המזרק.כדי למנוע בועות אוויר במזרק, לאחר טעינת 0.2-0.3 מ”ל של תחליב, הפוך את המזרק (קצה פונה כלפי מעלה) והקש בעדינות על המזרק שוב ושוב על קצה הדלפק כדי להביא את הבועות אל פני השטח. מוציאים את האוויר מהמזרק וממשיכים למלא את המזרק. הפוך והקש לסירוגין עד למילוי. מניחים מחט של 25 גרם על המזרק ומקדמים את התחליב למילוי המחט. אחסנו את המזרק על קרח עד לשימוש. כדי לבצע את ההזרקה התת עורית בבטחה, יש להרדים את העכבר או להשתמש בשיטות ריסון הומאניות המאפשרות גישה נוחה לאחורי בעלי החיים31. כדי להרדים להזרקה תת עורית, יש למקם את החיה בתא אינדוקציה איזופלורן (3%-4% לאינדוקציה ו-1%-3% לתחזוקה). לאחר ההרדמה, ודא כי העכבר הוא בעל קצב נשימה איטי ואינו מציג סימנים של מצוקה נשימתית. מניחים את הזריקות התת עוריות על המשטח הגבי של הירכיים, או על פני השטח הגחוניים של הרגליים פרוקסימליות לאזור בלוטות הלימפה המפשעות.הכנס בזהירות את המחט כדי למנוע הזרקה לתוך השריר. להזריק 0.05 מ”ל של תחליב Mtb לתוך החלל התת עורי. אין להסיר את המחט באופן מיידי על מנת לאפשר הזרקה מלאה של האמולסיה. חזור על ההזרקה בצד שמאל ובצד ימין עבור סך של 0.1 מ”ל לכל חיה. אם הוא מורדם, הנח את העכבר על כרית חימום חמה עד להחלמה מלאה. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משענת עצם החזה. החזירו את העכבר לכלוב שלו עם החלמה מלאה ותייגו את כרטיס הכלוב עם תאריך ההזרקה התת עורית. לספק משכך כאבים עם פרצטמול פומי (200 מ”ג / ק”ג / יום), אבל לא NSAIDs כמו חומרים אנטי דלקתיים יכול להשפיע על אינדוקציה של אובאיטיס. 3. הכנת מלאי אנטיגן להזרקה תוך-גופית בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאים סטריליים מתאימים כדי למנוע זיהום של ההשעיה Mtb intravitreal. הפוך את ההשעיות intravitreal.להשראת דלקת פנובאיטיס קלה עד בינונית, יש לבצע את התרחיף התוך-ורידי בריכוז של 5 מ”ג/מ”ל על-ידי הוספת 5 מ”ג של תמצית המיקובקטריה ל-1 מ”ל של PBS אחד. להשראת דלקת פנובאיטיס בינונית עד חמורה, יש לבצע את התרחיף התוך-ורידי בריכוז של 10 מ”ג/מ”ל על-ידי הוספת 10 מ”ג של תמצית המיקובקטריה ל-1 מ”ל של PBS אחד. מערבולת פעם אחת במשך 30 שניות ואז מניחים על קרח. כדי ליצור השעיה עדינה של H37Ra ב-PBS, ניתן לנתק את המתלים על קרח למשך 10 דקות כמתואר בשלב 1.4. Aliquot פתרון מלאי זה בנפחים של 100 μL ולאחסן ב -20 °C. לפני השימוש, יש להפשיר בטמפרטורת החדר ולערבב בעוצמה גבוהה למשך דקה. שמור את aliquots על קרח בעת הובלה למתקן בעלי חיים. 4. הליך הזרקה תוך ויטרי ביום 0 הכנת בעלי חייםללבוש כפפות בדיקה מותאמות, להניח את העכבר על איזון שקילה כדי לקבל את משקלו בגרמים. תן זריקה תוך צפקית של 0.02 מ”ל/גרם משקל גוף של תמיסה המכילה 100 מ”ג/מ”ל קטמין ו-20 מ”ג/מ”ל קסילזין מעורבב עם מים סטריליים כדי להרדים את החיה. גישה חלופית כוללת אינדוקציה באמצעות ~1.5% איזופלוראן (בשאיפה). המתן כ-2 דקות עד שהעכבר יירדם, ולאחר מכן הנח את העכבר בקופסת חימום וכסה את המכסה. בצע בדיקות רפלקס כאב כמו צביטה באוזן, בוהן וזנב כדי להעריך את עומק ההרדמה להליך32. לאחר השינה, להרדים את הקרנית עם טיפה אחת של 0.5% (v / v) tetracaine. הימנע מקבל tetracaine ליד האף או הפה של העכבר. לאחר 10 שניות, יש לטפוח את עודפי הנוזלים.הערה: נצפה כי התרחבות הקשתית וההדמיה של התא הקדמי (AC) משופרות כאשר ניתנת הרדמה מקומית, אולי בשל דיכוי רפלקס הקרנית המשופר עם ההרדמה המערכתית והאקטואלית המשולבת. עם זאת, ניתן להשמיט שלב זה אם תרצה בכך. להרחיב את האישון עם ירידה אחת של 2.5% (v/v) פנילפרין. יש להיזהר כדי למנוע טיפות עודפות שעלולות להיכנס לאף או לפה. לאחר 2-3 דקות, יש לטפוח את עודפי הנוזלים. כדי להקטין את הסיכון לאנדופתלמיטיס, יש להוסיף טיפה אחת של 5% בטאדין לפני השטח של העיניים ולשיער שמסביב. להשאיר על העין למשך 2-3 דקות.הערה: בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאים סטריליים מתאימים כדי למנוע אנדופתלמיטיס. יש להסיר את כמות הבטאדין ולכסות את העין בהיפרומלוז (0.3%) או בג’ל קרבומר לעיניים 0.2% w/w) למניעת יובש בהרדמה. זה גם יעזור למנוע היווצרות קטרקט. הגדרת מערכת המיקרו-הזרקותבצעו את ההזרקה התוך-גופית באמצעות מיקרו-משאבה המחוברת לבקר משאבת מיקרו-מזרק ולמזרק הזרקה (איור 1A-C). לחלופין, יש להזריק מחט של 33 גרם המחוברת למזרק המילטון כמתואר בסעיף קטן 4.4. חבר מחט 34 גרם למחזיק ההזרקה כדי להרכיב את המזרק. שחררו את מכסה הבורג הכסוף בקצה הקדמי של מחזיק ההזרקה והחליקו את המחט לתוך גופו של המחזיק בערך באמצע הדרך. הדקו היטב את מכסה הבורג הכסוף. חבר את הצינור למחזיק ההזרקה כאמור בשלבים 4.2.4-4.2.5. כדי להכניס את הצינור על מחזיק ההזרקה, שחררו את בורג הפלסטיק בקצה האחורי של המחזיק, החליקו את הצינורות דרך האטם שבפנים והדקו את הבורג. שמרו על מרווח קל עם קצה הצינור כדי למנוע נזק לצינורות במהלך ההזרקה. עיין באיור 1C. הפשרה של 100 μL aliquot של מתלה מלאי mycobacterium. הוסף 3 μL של תמיסת נתרן פלואורסצין 1% (AK-פלואור) ומערבלת היטב. טען מזרק 10 μL עם תערובת אנטיגן ופלואורסצין מבלי לכלול בועות אוויר. הסר את מחט ההעמסה מהמזרק, והחלק את הצינורות דרך אטם מכסה הבורג הכסוף עד שהקצה מגיע לסימן האפס בגוף המזרק. לאחר שקצה הצינור מיושר כראוי למיקום הרצוי, הדקו את אצבע מכסה הבורג בחוזקה. שטפו את התמיסה במזרק דרך צינורות ההזרקה כדי לטעון את המערכת במלואה. לאחר מכן חזור על שלבים 4.2.8-4.2.11 כדי לטעון מחדש את המזרק להזרקה. כדי להתקין את המזרק הטעון על המיקרו-משאבה, לחץ על לחצן שחרור המהדק בקצה המיקרו-משאבה כדי לפתוח את מהדקי המזרק. מקם את מכסה הבוכנה במחזיק מכסה הבוכנה בקצה האחורי של המיקרו-משאבה. לאחר מכן החליקו את צווארון המזרק על מעצור הצווארון ואת גוף המזרק לתוך מהדק המזרק. שחררו את כפתור המהדק והדקו את בורג הבוכנה. עיין באיור 1D. החלק את מחזיק ההזרקה ואת המחט דרך מהדק ה- o במנגנון ההזרקה הסטריאוטקטי. זוהי פלטפורמה מותאמת אישית; לחלופין, ניתן להחזיק את המזרק ולמקם אותו באופן ידני. הגדר את נפח העירוי ואת קצב נפח העירוי בבקר משאבת המיקרו-מזרק להזרקת 500 nL למחזור בקצב של 40 nL/s, בהתאמה.הערה: ניתן להשתמש בקצב הזרקה מהיר יותר, עם זאת, ניתן לחוות יותר ריפלוקס לפני שניתן יהיה להשיג מיקום מחדש של המחטים. בדוק את המערכת כדי להבטיח תפקוד תקין לפני ביצוע הזרקה תוך ויטרלית.הערה: כאשר מערכת ההזרקה פועלת כראוי, הפעלה של מחזור הזרקה באמצעות דוושת כף הרגל או כרית הבקרה תיצור תנועה נראית לעין של מחזיק מכסה הבוכנה וטיפה קטנה של נוזל ירקרק תיראה בקצה המחט. במקרה שלא מופק נוזל, הפעל מחזורים נוספים או שטף וטען מחדש את המזרק. לפני הזרקת העין, נגב בעדינות את המחט עם כרית אתנול 95%. הליך הזרקה תוך-ורידיהעכבר ממוקם על מנגנון סטריאוטקסי כדי לבצע את הליך ההזרקה. שמור על הבמה / הפלטפורמה שעליה העכבר נחמם על ידי חיבור 2-3 מגבות נייר על פני השטח שלו. הנח את העכבר במצב נוטה על הרציף. השתמש במוטות האוזן הימנית והשמאלית כדי לקבע בעדינות את ראש החיה. עיין באיור 1E. מקם את העכבר והתכוון מתחת להיקף כך שהיבט האף העליון של עין ימין יהיה גלוי. השתמש במחט של 30 גרם כדי לעקור את הריסים ולחשוף את הסקלרה. דמיינו את הלימבוס ואת כלי הדם הרדיאלי. השתמש במחט סטרילית של 30 G כדי ליצור חור מנחה בסקלרה 1-2 מ”מ אחורית ללימבוס. הכנס את מחט 34 G המחוברת למחזיק ההזרקה לתוך העין דרך חור ההנחיה בזווית שתמנע את העדשה, אך תכניס את קצה המחט לחלל הזגוגית. באמצעות בקר משאבת microsyringe, בזהירות להזריק 1 μL של תמצית Mtb לתוך חלל הזגוגית. במקרה של ריפלוקס עקבי, הגדל את נפח ההזרקה ל -1.5 μL כדי להבטיח מתן מינון הולם.הערה: עבור פקדי בושה, יש להזריק 1 μL של PBS לעין החיה. אמת את המיקום התוך-ורידי על-ידי הדמיה של רפלקס ירקרק בעין. עיין באיור 1F. לאחר 10 שניות, למשוך את המחט מן העין. שימו לב לכל ריפלוקס. הסירו את העכבר מהפלטפורמה, הניחו 0.3% היפרומלוז או 0.2% משחת עיניים עם קרבומר על שתי העיניים להגנה על הקרנית, ועברו לתיבת חימום ההתאוששות. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משענת עצם החזה. אין לחזור לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. כשהעכבר ער לגמרי, חוזרים לכלוב ומוסיפים פרצטמול (200-300 מ”ג/ק”ג/יום) לבקבוק מים תרופתיים. תייג את כרטיס הכלוב עם תאריך הזרקת IVT. זריקות intravitreal הם בדרך כלל נסבלים היטב. סימנים קליניים שעשויים להצביע על כאב ועל הצורך בהסרה מהמחקר כוללים התקרחות פריוקולרית (המעידה על טראומה עצמית), כיב בקרנית, ירידה במשקל ותנוחה מחובקת. שיטה חלופית להזרקה תוך-גופיתהערה: הליך זה מבוצע באמצעות מיקרוסקופ הפעלה ומחט של 33 גרם על מיקרו-מזרק.העמידו את העין והחזיקו אותה במקומה בעזרת זוג מלקחיים. לאחר מכן יש למרוח ג’ל עיניים קרבומר 0.2% w/w או 0.3% ג’ל עיניים היפרומלוז ולהניח כיסוי עגול (קוטר 7 מ”מ) על העין. הרכיבו מחט היפודרמית של 33 G על מזרק המילטון 5 μL והכניסו אותה בערך 2 מ”מ להיקף הלימבוס הקרנית עם זווית הזרקה של ~45°. מנחים את שיקוע המחט לתוך הזגוגית, עוצרים בין העדשה לדיסק האופטי (מנקודת המבט היחסית של המנתח, זה מעל/מכסה את הדיסק האופטי – כ-1.5 מ”מ ממקום ההחדרה), ומזריקים 2 μL של Mtb (ב-2.5 ug/μL ב-PBS) באיטיות. החזיקו את המחט במקומה לזמן קצר (כדי להפחית את כמות הרפלוקס של ההזרקה) ולאחר מכן הסירו אותה. לאחר ההזרקה, אחסן את כדור הארץ על ידי שחרור המלקחיים. ירידה של 1% עם משחה כלורמפניקול יכולה להינתן לעין בשלב זה כדי לספק הגנה נוספת מפני אנדופתלמיטיס לאחר ההזרקה. לאחר ההזרקה יש לעבור לתיבת החימום להתאוששות כאמור בשלבים 4.3.11-4.3.13. 5. הדמיית OCT לזיהוי וכימות אובאיטיס הכנת בעלי חייםהרדמת העכבר כמתואר בשלבים 4.1.2-4.1.4 להרחיב את האישון עם ירידה אחת של 2.5% פנילפרין. יש להיזהר כדי למנוע טיפות עודפות שעלולות להיכנס לאף או לפה. לאחר 2-3 דקות, יש לטפוח את הנוזל העודף. יש להניח 0.3% היפרומלוז או 0.2% עם ג’ל קרבומר על העין כדי למנוע יובש תחת הרדמה. זה גם יעזור למנוע היווצרות קטרקט. לעטוף את העכבר בשכבה של גזה כירורגית כדי לשמור על חום הגוף ולהניח אותו על קלטת החיה. מקמו את הראש עם מוט הנשיכה. לרכוש את תמונות OCT של התאים הקדמיים והאחוריים.הערה: אם אתם מקבלים תמונות של התא הקדמי והאחורי, השיגו תחילה את תמונות התא האחורי (PC) כדי למנוע ירידה באיכות התמונה לאחר היווצרות קטרקט. ניתן למנוע היווצרות קטרקט באמצעות שימון תכוף ומריחת 0.3% היפרומלוז או 0.2% עם ג’ל עיניים קרבומר. להדמיה ממושכת (>10 דקות), שמירה על חום העכבר (באמצעות פד חום) מסייעת גם היא.לאחר הפעלת מערכת הדמיית OCT, אבטח את עדשת ההדמיה הנכונה והתאם את מיקום זרוע הייחוס לפי הצורך. פתח את תוכנת ההדמיה, צור את מזהה העכבר הייחודי והתחל בהדמיה לפי פרוטוקול יצרן OCT. באמצעות האפשרות Free Run עם פרוטוקול הסריקה המהירה, מקם את העין עם עצב הראייה שבמרכזו תמונות התא האחורי או עם נקודת השיא של הקרנית על תמונות התא הקדמי.הערה: טבלה 1 מכילה פרמטרים של פרוטוקול הדמיה עבור שתי מערכות הדמיה מסחריות של בעלי חיים קטנים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרטי מוצר. להדמיית תא אחורי, קרבו את ה-OCT לפני השטח של העין. יש להיזהר כדי להימנע מהבאת פני השטח של העדשה במגע עם העין. לאחר שהעין ממוקמת כראוי, הפסק את הסריקה המהירה ובחר את פרוטוקול סריקת עוצמת הקול, והפעל את הסריקה באמצעות האפשרות כוון . עבור תמונות מקטע אחורי, התאם עד שעצב הראייה ממורכז בתמונת יישור B-Scan אופקי ושהרשתית מיושרת עם ציר היישור האנכי לתמונות מקטע קדמי, התאימו את המיקום למרכז החלק העליון של הקרנית הן בתמונה ‘יישור B-סריקה אופקי’ והן בתמונת ‘יישור B-סריקה אנכית’. נוכחותו של חפץ השתקפות בשתי התמונות תאשר יישור תקין. לאחר מכן הזיזו את התמונה האופקית מספיק כדי להסיר את חפץ ההשתקפות. עיין באיור 2. לחץ על Snapshot כדי ללכוד את תמונת סריקת עוצמת הקול ולאחר מכן לחץ על שמור. לאחר מכן, קבל את סריקת הקו המרכזי הממוצעת. פתח את פרוטוקול הסריקה ולחץ על המטרה ואחריה Snapshot. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אותו לוח ולאחר מכן לחץ על ממוצע. חזור על שלבים 5.2.1-5.2.9 עבור כל עין עם שתי העדשות. לאחר איסוף כל התמונות, הסר את העכבר מהקסטה וספק הגנה על הקרנית במהלך ההתאוששות כמפורט בשלבים 4.3.11-4.3.13. 6. ניקוד דלקת על ידי OCT ציון תמונות OCT בעזרת תלמידי כיתה אשר מוסווים למצב הטיפול.הערה: עבור PMU במודל העכבר, מומלצת מערכת הניקוד המופיעה בטבלה 2 . אם התקבלו תמונות של תא קדמי (AC) ותא אחורי (PC), שלב ציונים אלה כדי לקבל את הציון הסופי עבור כל עין.הערה: דלקת בתא הקדמי נפתרת לפני דלקת בתא האחורי. 7. ניקוד דלקת על ידי היסטולוגיה שלאחר המוות בסוף הניסוי, אספו עיניים בודדות על ידי אנוקלציה, תיקנו 4% פורמלדהיד בן לילה, והמשיכו להטמעת פרפין, חתך והכתמת H&E33.הערה: מומלץ לבצע מספר חתכים של 4-8 מיקרומטר לאורך ציר עצב האישון האופטי.הערה: שלושה חלקים בכל עין מקבלים ניקוד על ידי תלמיד עם מסיכה באמצעות שיטת הניקוד המופיעה בטבלה 3, והציון הממוצע של שלושת הפרקים מדווח כציון הדלקת ההיסטולוגית הסופי.

Representative Results

פרוטוקול זה מדגים את האינדוקציה של אובאיטיס בעכברים באמצעות מודל אובאיטיס מיקובקטריאלי ראשוני (PMU). הבטחת עקביות בהזרקה התת-עורית ודיוק ההזרקה התוך-גופית הם שלבים מרכזיים בפיתוח מודל אובאיטיס מיקובקטריאלי ראשוני (PMU). איור 1 מדגים את הליך ההזרקה התוך-גופית של העכבר באמצעות מנגנון סטריאוטקסי. מוטות אוזניים עוזרים למקם בעדינות את הראש באותו מיקום מתחת למיקרוסקופ (איור 1E). הם גם שומרים על הראש יציב במהלך הליך ההזרקה intravitreal, אשר מקטין את הסיכון של טראומה הזרקה. לאחר הזרקה מוצלחת, פלואורסצין בתמיסת ההזרקה מייצר השתקפות ירקרקה מתוך העין שניתן לראות מתחת למיקרוסקופ או ממבט מהצד כפי שמוצג באיור 1F. כאשר הוא מבוצע כמתואר, הפרוטוקול מייצר אובאיטיס חריפה חזקה שניתן לזהות באמצעות OCT והדמיית פונדוס כבר 10 שעות לאחר הזרקה תוך-גופית. איור 2 מדגים את היישור הנכון של העין להדמיית OCT. טבלה 1A מפרטת את הפרמטרים המשמשים בפרוטוקול OCT. גישה שיטתית להשגת תמונות תספק תמונות באיכות גבוהה שניתן להשוות לאורך זמן. תמונות של תאים קדמיים ממורכזות בקצה הקרנית באמצעות תמונת SLO בפנים (איור 2A) כאשר הקשתית מיושרת במקביל למישור האופקי והאנכי (איור 2B,C). סריקות נפח וסריקות קו נלכדות עם יישור אנכי כך שניתן להציג בו זמנית אזורים נחותים ומעולים. תמונות המקטעים האחוריים מרוכזות בעצב הראייה באמצעות תמונת ה-SLO בפנים (איור 2D), והפס הבהיר של ה-RPE משמש ליישור הרשתית במקביל למישור האופקי והאנכי (איור 2E,F). איור 3 מראה ממצאים אופייניים של דלקת עיניים מסוג PMU באמצעות הדמיית OCT. עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה התוך-גופית, תאי דלקת נראים בזגוגית המימית ובזגוגית (איור 3B). בנוכחות דלקת מתונה או חמורה, hypopyon ייראה בזווית נחותה AC. ניתן להבקיע את מידת הדלקת בעיניים בתמונות OCT אלה באמצעות הקריטריונים המפורטים בטבלה 2. דוגמאות מייצגות לתמונות המדגימות את המאפיינים הדלקתיים האופייניים לכל ציון מוצגות באיור 4. ניתן להוסיף יחד ציוני AC ו-PC כדי ליצור את ציון ה-OCT המשולב. ציונים משולבים >0 אך ≤2.5 מייצגים דלקת קלה. דלקת מתונה נקבעת על ידי ציונים >2.5 אבל ≤4.5. ציוני >4.5 מזהים דלקת חמורה. הדלקת מגיעה לשיאה בדרך כלל 48 שעות לאחר הזרקה תוך-גופית, עם ציוני OCT ב-AC ובמחשב האישי בין 1 ל-3 (ציונים משולבים בין 2 ל-6). ציוני AC ו-PC של 0.5 או 4 נפוצים פחות. במקרה שבו נתקלים לעתים קרובות בציונים מחוץ לטווח הטיפוסי, ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות כדי לזהות את הגורמים התורמים לציונים חריגים יותר (ראה סעיף דיון). ציוני הדלקת בתא הקדמי נוטים לחזור לאפס תוך שבוע לאחר ההזרקה התוך-גופית. לעומת זאת, הציונים האחוריים אינם חוזרים לאפס; במקום זאת, דלקת כרונית ברמה נמוכה נמשכת בצורה של ויטריטיס, ולימפוציטים perivascular לחדור ברשתית במשך 1-2 חודשים לאחר הזרקה intravitreal. ציון דלקת ב- PMU יכול להיקבע גם באמצעות היסטולוגיה. איור 5 מציג מקטעי H&E מייצגים לשימוש בניקוד חומרת PMU על ידי היסטולוגיה. מספר תאי הדלקת בזגוגית המימית והזגוגית נספרים ומשמשים לקביעת חומרתם באמצעות קריטריוני הציון המפורטים בטבלה 3. חדירת תאי דלקת לגוף הציליארי נראית בדרך כלל בצד אחד של החלק ההיסטולוגי (מעורבות חד צדדית) בדלקת קלה או בינונית. כאשר הדלקת חמורה, הדבר בא לידי ביטוי בנוכחות של חדירת תאי דלקת לגוף הסיליארי משני צידי העדשה (המכונה מעורבות דו-צדדית). במהלך נקודות זמן מאוחרות יותר לאחר הזרקה intravitreal, ביטויי דלקת כרונית, כולל נוכחות של לויקוציטים perivascular ו intraretinal וקפלי הרשתית החיצונית, ניתן גם לזהות. היסטולוגיה יכולה גם לעזור בזיהוי עיניים המושפעות מטכניקות הזרקה לקויות. ניתן לזהות טראומה לעדשה במהלך ההזרקה התוך-גופית על ידי נוכחות של חלבוני עדשה אמורפיים מוכתמים באאוזין (ורוד) מחוץ לקפסולת העדשה הסמוכה לאזור הטראומה. ריפלוקס של mTB intravitreal לתוך החלל subconjunctival תיצור דלקת מחוץ לעין כי ניתן לזהות על ידי סקירה זהירה של מבנים periocular נוכח על החלקים. בשל הכישלון לשמור על תמצית mTB בתוך העיניים, עיניים אלה בדרך כלל יהיו עם ציוני OCT נמוכים של דלקת. ניתן להשתמש בהדמיית פונדוס של ברייטפילד גם כדי לזהות היבטים רלוונטיים מבחינה קלינית של PMU, כולל התפתחות של היפופיון, ויטריטיס וחדירת תאי דלקת ברשתית או בכלי הדם. איור 6 מראה שתי דוגמאות שבהן ניתן לראות דלקת ברשתית ובכלי הדם בתמונות פונדוס. שתי העיניים האלה גם מראות את טווח הדלקת הנפוץ במודל PMU. טבלה 1B מפרטת את הפרמטרים המשמשים במערכת ההדמיה של פונדוס/רשתית OCT. שימו לב להשפעה שיש לדלקת חמורה על איכות התמונה (איור 6, יום 2, OCT ותמונות פונדוס בשורה העליונה) ולהיקף המחלה הקיימת ביום ה-21. בצקת הקרנית יכולה גם להפחית את איכות התמונה במהלך דלקת חריפה; עם זאת, אין זה נדיר שבצקת הקרנית חמורה מדלקת בלבד. בדרך כלל, איכות התמונה תיפגע כתוצאה מנזקי אפיתל הנובעים מהגנה לא שלמה על פני השטח במהלך אירועי הדמיה והרדמה. מודל PMU יכול לשמש כדי לגרום uveitis בכל גזע עכבר או גנוטיפ. בעיניים לבקניות, OCT עדיין יכול לשמש לציון דלקת, אך היעדר פיגמנט פונדוס הופך את ההדמיה של דלקת למאתגרת על ידי הדמיה שלשדה בהיר 13,34. ניתן לבצע מחקרים לאחר המוות על רקמות עיניים, בלוטות לימפה אזוריות או הטחול. כמה דוגמאות כוללות בדיקות לנוכחות של תאים חיסוניים כגון ציטומטריה זרימה ואימונוהיסטוכימיה ומדידה של ציטוקינים דלקתיים. בכל נקודות הזמן שנבדקו לאחר תחילת דלקת עם PMU (יום 1 עד יום 56), יש מספיק תאים דלקתיים CD45+ נוכחים בעיניים בודדות כדי לזהות אוכלוסיות לויקוציטים גדולות רבות בעין על ידי ניתוח זרימה מרובת פרמטרים12,35. ניתן לאסוף הומור מימי (2-5 μL) וזגוגי (5-10 μL) מעיניים מודלקות לצורך קביעת ריכוז חלבונים, מחקרים פרוטאומיים או קביעת ריכוז ציטוקינים36. איור 1: מערך הזרקה תוך-גופית של עכבר. ההזרקה התוך-גופית מתבצעת בעין העכבר באמצעות (A) בקר משאבת מיקרו-מזרק המחובר למיקרו-משאבה (B) ו-(C) מזרק הזרקה. המזרק נטען ומותקן על המיקרו-משאבה (D). ראש העכבר ממוקם באמצעות מוטות אוזניים (E) כדי להבטיח יציבות ועקביות במהלך הליך ההזרקה התוך-ורידית. (F) פלואורסצין בתמיסת ההזרקה מייצר השתקפות ירקרקה מתוך העין לאחר הליך מוצלח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: יישור נכון של העין להדמיית OCT . (A) באמצעות תמונת אופתלמוסקופ לייזר סורקת פנים (SLO), העין ממורכזת להדמיית החדר הקדמי. הקו הירוק מציין את מיקום סריקת הקו האופקי המוצגת בחלונית (B). שים לב כי הקרנית המרכזית נמנעת כדי להקטין את חפץ ההשתקפות. (C) סריקת B אנכית דרך התא הקדמי הפארא-מרכזי. סריקה זו מתקבלת ב-90° מהסריקה האופקית. שים לב שהיישור של מקטעי הקשתית בכל צד של העדשה הוא מאוזן בסריקה האופקית (לוח B) ומסודר אחד מעל השני בסריקה האנכית (לוח C). (D) באמצעות תמונת SLO, תמונת התא האחורי מרוכזת בעצב הראייה. (E) יישור B-Scan אופקי, (F) יישור B-Scan אנכי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: אינדוקציה של PMU יוצרת פנובאיטיס שניתן לנטר על ידי הדמיית OCT אורכית. השורה העליונה מציגה תא קדמי (AC); השורה התחתונה מציגה תמונות OCT של החדר האחורי (PC) כדי להדגיש שינויים פתולוגיים במהלך המחלה. (A) תמונת OCT בסיסית של AC (למעלה) ומחשב אישי (למטה) לפני השראת אובאיטיס, שניהם ציון 0. (B) יום 1 לאחר הזרקה תוך-גופית המציגה נוכחות של בצקת הקרנית (חץ שחור), היפופיון (*) מספר תאי דלקת צפים חופשיים ב-AC (חיצים לבנים) ו-vitritis (ראשי חץ לבנים) במחשב. (C) יום 7 לאחר הזרקה תוך-גופית עם מעט תאי AC על כמוסת העדשה הקדמית (חץ לבן) וירידה בדלקת ויטריטיס (ראש חץ לבן). (D) יום 28 לאחר הזרקה תוך-גופית של החדר הקדמי עם דלקת AC פתורה ודלקת ויטריטיס קלה. קיצורים: C- קרנית, L – עדשה, I – איריס, Aq – מימי, V זגוגית, RGC – תאי גנגליון רשתית, PR – פוטורצפטורים, Ch- כורואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: דוגמאות לציון OCT. ציון OCT בין 0 ל-4 מוקצה לכל תמונת AC ותמונת מחשב באמצעות המערכת הקטגוריאלית המוצגת בטבלה 2. ציוני AC ו-PC משולבים עבור ציון OCT הסופי לעין. (א,ד) דוגמאות לציון אפס. (ב,ה) דוגמאות לציון 0.5. (ג,ו) דוגמאות לציון 1. (ז,י) דוגמאות לציון 2. (ח,ק) דוגמאות לציון 3. (א,ל) דוגמאות לציון 4 מוצגות בפאנלים I ו-L. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: דוגמאות לציון בהיסטולוגיה. הציון בהיסטולוגיה נקבע על סמך חמישה מאפיינים הנראים במקטעי H&E: צפיפות חלבון התא הקדמי, מספר התא הקדמי, חדירת תאי מערכת החיסון לגוף הציליארי, צפיפות תאי הזגוגית, דלקת בכלי הדם ברשתית ושינויים מבניים ברשתית. ציון של 0-2 מוקצה עבור כל מאפיין. התיאור של כל ציון נמצא בלוח 3. ציון לדוגמה מייצג של 0-2 עבור כל מאפיין מוצג באיור זה. העמודה השמאלית מדגימה את ציון האפס. העמודה המרכזית מציגה דוגמאות לציון 1. העמודה השמאלית מציגה דוגמאות לציון 2. ציון של 2 עבור ציון הגוף הציליארי מוקצה אם הגוף הציליארי משני צדי העדשה באותו מקטע מדגים דלקת תאית. הציון הסופי בהיסטולוגיה הוא סכום הציון עבור כל אחד מחמשת הקריטריונים (ציון מקסימלי 10). החץ בלוח הימני התחתון מציין לויקוציטים פריווסקולריים הקשורים לכלי רשתית שטחי. סרגל קנה מידה שחור מציין 500 מיקרומטר. פסי קנה מידה ציליאריים מציינים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: הדמיית פונדוס אורכית ב-PMU זיהתה טווח של חומרת מחלה . (A) עיניים מודלקות קשות מדגימות חדירות לבנות מרובות ברשתית ובטורטואוזיות כלי הדם בהדמיית פונדוס צבע (שורה עליונה) וכן דלקת ויטריטיס צפופה ובצקת רשתית ב-OCT (שורה תחתונה) ביום השני. התקדמות במספר נגעים ברשתית ניתן לראות לאורך זמן בעוד vitritis משתפר. הקו הירוק מציין את מיקום תמונת ה-OCT. (B) עיניים מודלקות קלות מדגימות פחות ויותר נגעים ליניאריים בדידים בפונדוס ומספר תאים חודרים בחלל הזגוגית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. A תא קדמי של עכבר סריקה מהירה סריקת עוצמת קול סריקה ליניארית אורך X רוחב 4.0 מ”מ × 4.0 מ”מ 3.6 מ”מ × 3.6 מ”מ 3.6 מ”מ פינה 0 90 90 סריקה A/סריקת B 800 1000 1000 # סריקות B 50 400 1 מסגרות/ סריקת B 1 3 20 תא אחורי לעכבר סריקה מהירה סריקת עוצמת קול סריקה ליניארית אורך X רוחב 1.6 מ”מ × 1.6 מ”מ 1.6 מ”מ × 1.6 מ”מ 1.6 מ”מ פינה 0 0 0 סריקה A/סריקת B 800 1000 1000 # סריקות B 50 200 1 מסגרות/ סריקת B 1 3 20 B תא אחורי לעכבר סריקת עוצמת קול סריקה ליניארית אורך X רוחב 0.9 מ”מ × 0.9 מ”מ 1.8 מ”מ פינה 0 כל (בדרך כלל 0 או 90) סריקה A/סריקת B 1024 1024 # סריקות B 512 1 מסגרות/ סריקת B 1 30 טבלה 1: סריקת פרמטרים. (A) פרמטרי סריקת OCT. (B) פרמטרים של סריקת OCT של פונדוס/רשתית תיאורי ציוני OCT הציון תא קדמי חדר אחורי נה אין נוף מעבר לקרנית הקדמית אין תצוגה של קטע אחורי 0 ללא דלקת ללא דלקת 0.5 1-5 תאים במים תאים מעטים התופסים פחות מ -10% משטח הזגוגית או בצקת בקרנית ללא חדירות תת-רשתיות או תוך-רשתיות או הפרעה בארכיטקטורת הרשתית 1 6-20 תאים במימיים תאים מפוזרים (ללא גושים צפופים) התופסים בין 10 ל -50% משטח הזגוגית. או שכבה אחת של תאים על קפסולת העדשה הקדמית ללא חדירות תת-רשתיות או תוך-רשתיות או הפרעה בארכיטקטורת הרשתית 2 20-100 תאים במים תאים מפוזרים (ללא גושים צפופים) התופסים >-50% משטח הזגוגית או פחות מ-20 תאים והיפופיון קיים ללא חדירות תת-רשתיות או תוך-רשתיות או הפרעה בארכיטקטורת הרשתית 3 20-100 תאים במים תאים מפוזרים השווים לדרגה 2 ו-1 והיפופיון או קרום אישון ולפחות אטימות זגוגית צפופה אחת התופסת 10%-20% משטח הזגוגית או נוכחות של תאים זגוגיים השווה לדרגה 2 ואטימות תת-עורית או נטרטינלית נדירה (≤ 2) 4 כל מספר של תאים מימיים אטימות זגוגית צפופה התופסת > 20% משטח הזגוגית. וכן היפופיון גדול וממברנה אישונים או אובדן מבנה קדמי עקב דלקת חמורה או תאים זגוגיים מפוזרים עם אטימות תת-רשתית או תוך-רשתית גדולה טבלה 2: קריטריונים לציון PMU OCT: תמונות OCT מקבלות ניקוד בהתאם לקריטריונים המפורטים בטבלה. ציוני AC ו- PC מתווספים כדי לקבל את הציון הסופי של העין. במקרים שבהם לא נרכשה ראייה ברורה של העין, הוקצה ציון של NA לתמונות, ואלה לא נכללו במחקר. תיאור הציון בהיסטולוגיה תכונה 0 1 2 חלבון תא קדמי (AC) חלקיקים תאיים זעירים מכתימים באוזין ב-AC מכתים אאוזין חוץ-תאיים מתונים, אך לא מתמזגים, בכל מקום ב-AC מפגש או קרוב למפגש אאוזין חוץ-תאי מכתים ברחבי זרם החילופין תא תא קדמי (AC) ללא תאים 1-100 תאים, אך ללא צבירות צפופות של תאים >100 תאים, או צבירות צפופות של תאים דלקת בגוף הציליארי ללא חדירת לויקוציטים לגוף הציליארי או לזגוגית הסובבת אותו נוכחות חד-צדדית של לויקוציטים החודרים לגוף הסילארי ו/או לזגוגית הסובבת אותו. נוכחות דו-צדדית של לויקוציטים החודרים לגוף הסילארי ו/או לזגוגית הסובבת אותו. דלקת כלי דם ברשתית אין כלי רשתית עם לויקוציטים פריווסקולריים כלי אחד לכל קטע עם לויקוציטים פריווסקולריים >1 כלי לכל סעיף עם לויקוציטים perivascular קיפול רשתית או נזק ללא נזק לרשתית 1-3 קיפולי רשתית לכל מקטע >3 קפלי רשתית לכל מקטע, או כל הרס אחר של שכבת הרשתית או דימום תוך-רשתית טבלה 3: קריטריונים לציון היסטולוגיה של PMU: מקטעי H&E של העין קיבלו ניקוד על סמך הקריטריונים המפורטים בטבלה. שלושה חלקים מאותה עין קיבלו ניקוד וממוצע כדי לקבל את הציון ההיסטולוגי הסופי של העין.

Discussion

מודלים חייתיים של אובאיטיס סייעו בהבנת המנגנונים של דלקת עיניים והומאוסטזיס, כמו גם אפשרו הערכה פרה-קלינית של טיפולים רפואיים וכירורגיים לחולים עם אובאיטיס37. הן גרסאות ארנב והן חולדה של מודל PMU הוכיחו את ערכן בטיפול פרה-קליני באמצעות מחקרי הוכחת היתכנות38,39,40. בשל הזמינות של מגוון רחב של זנים מהונדסים בעכברים, הקמת מערכת מודל PMU של העכבר מאפשרת כעת מחקרים מכניסטיים מפורטים יותר כדי לזהות סוגי תאים, מסלולים וגנים ספציפיים התורמים לפתולוגיה של מחלה זו.

מודלים חייתיים של אובאיטיס יכולים להדגים שונות בין בעלי חיים לבעלי חיים בשכיחות ובעוצמה של דלקת41. בזן העכבר C57BL/6, PMU נוצר באופן אמין באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. דווח על שינויים ספציפיים לזן במסלול ובעוצמה של אובאיטיס הן עבור EAU והן עבור EIU42,43. בעוד שהשפעות ספציפיות לזן על חומרתו ומסלולו של PMU לא נמדדו בניסוי, מודל זה שימש ב-C57BL/6J מסוג פרא, כמו גם בעכברים לבקנים (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) והפיק תגובות דלקתיות דומות. ביצירת מודל PMU, שליטה בשיקולים המפורטים להלן יכולה לסייע לחוקרים חדשים להגביל את השונות ולייצר את האובאיטיס העקבית והניתנת לשחזור ביותר.

הקפידו על עקביות בזריקות התת עוריות:
כדי לספק הזרקה תת עורית עקבית, ודא שכל בועות האוויר מוסרות מהתחליב. השיקולים כוללים צנטריפוגה קצרה (30 שניות ב-400 x גרם) של התחליב המוכן מראש לפני טעינת המזרק. פעולה זו תסיר אוויר כלוא בתחליב. כמו כן, בעת טעינת המזרק, הפוך מעת לעת (טיפ-אפ) והקש על המזרק כדי להסיר בועות אוויר. בזמן ההזרקה, אין למקם את המזרק עמוק מדי על מנת למנוע הזרקה תוך שרירית. לעומת זאת, זריקה רדודה (לא טריידלית) עלולה לגרום לשחיקה של התחליב דרך העור. זכרו להשהות לזמן קצר לפני הסרת המזרק ממקום ההזרקה כדי להבטיח הזרקה מלאה של התחליב הצמיג הסמיך ולמנוע ריפלוקס מהעור.

שבעה ימים לאחר הצבת הזריקה תת עורית, לאשר את נוכחותם של גושים מוחשיים משני צדי הרגליים האחוריות. אם לא ניתן לזהות גושים, ייתכן כי האוויר הוזרק ולא תחליב. במקרה זה, דלקת חריפה עשויה להיות פחות חזקה, ודלקת כרונית עשויה שלא להתפתח.

מניעת התפתחות של אנדופתלמיטיס זיהומיות:
אנדופתלמיטיס חיידקית או פטרייתית תיצור משתנה מבלבל אם לא תימנע44. על מנת למנוע אנדופתלמיטיס חיידקית, תמיד לתרגל טכניקה אספטית טובה בעת ביצוע ההשעיה intravitreal, טיפול, וניקוי כל הכלים לשימוש חוזר כי יבוא במגע עם העין. חשוב להשתמש בפריטים סטריליים לשימוש חד-פעמי, לטאטא או לנקות עם 95% אלכוהול לשטוף או למגבון. שימוש נכון בבטאדין המיושם על משטח העין, העפעפיים והפרווה הפרעינית יעזור גם הוא למנוע אנדופתלמיטיס45. זה פשוט לזהות עין עם זיהום כמו מבנים עיניים ייעלמו על ידי דלקת קיצונית במהלך המסלול שלאחר ההזרקה. זה לא אופייני ל-PMU. נוכחות של דימום תוך עיני יכול גם להציע אנדופתלמיטיס או טראומה מן הזריקה. במקרים כאלה, להוציא את בעלי החיים האלה מהמחקר.

ודא עקביות בהזרקה intravitreal:
ההזרקה התוך-גופית היא שלב קריטי בהשראת דלקת אמינה וניתנת לשחזור ב-PMU. מתן כמות עקבית של תרחיף Mtb עם כל זריקה, הימנעות מטראומה ומניעת ריפלוקס של המתלה הם כולם גורמים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הזריקות. כדי להבטיח השעיה עקבית, מערבבים את מתלה המלאי ביסודיות עם הפשרה ולפני העמסתו במזרק. מכיוון שתמצית Mtb זו המשמשת אינה מהווה פתרון, ההשעיה יכולה לעבור שקיעה לאורך זמן. כדי להבטיח ריכוז אחיד של תמצית ה-Mtb בכל הזרקה, השתמש או גרש וטען מחדש את המזרק תוך 15 דקות מההעמסה. פנילפרין משמש להתרחבות כדי לספק שדה ראייה גדול יותר לעין האחורית ולהפחית את הסיכון לטראומה לעין במהלך ההזרקה. ירידה זו יוצרת נסיגת עפעפיים טבעית ופרופטוזה קלה של כדור הארץ, ומאפשרת הדמיה טובה של שטח 1-2 מ”מ אחורי ללימבוס ללא צורך לתפוס את העין עם מלקחיים. שימוש במלקחיים לריסון העין עלול לגרום לטראומה פוטנציאלית ולהגביר באופן זמני את הלחץ התוך עיני ואת הסיכון לרפלוקס של מתלה ה-Mtb. טראומה יכולה להיגרם גם על ידי ניסיון להזריק יותר מדי נפח לתוך העין. נפח ההזרקה מוגבל ל-2 μL כדי למנוע עלייה משמעותית וממושכת של לחץ תוך עיני וטראומה לעין. בנוסף, לבעלי חיים צעירים יותר יהיו עיניים קטנות יותר מעכברים בוגרים. בדרך כלל עכברים של 6-8 שבועות (20-25 גרם) מספקים גודל עיניים אחיד ומבטיחים עקביות רבה יותר בדלקת לאחר הזרקת Mtb. תדירות גבוהה יותר של רפלוקס לאחר ההזרקה של ההשעיה המיקובקטריאלית נצפתה בעכברים קטנים יותר. זה, בתורו, מוביל דלקת חריפה פחות מהצפוי. תמיסת פלואורסצין מדוללת משמשת כדי לספק למזרק המתחיל משוב חזותי על הצלחת טכניקת ההזרקה שלהם. התרחבות בזמן ההזרקה תאפשר הדמיה ישירה של החומר המוזרק בחלל הזגוגית והזדמנות לציין כל עדות לטראומה בעדשה. במקרה של טראומה בעדשה, זה יכול לגרום לשינוי בבהירות העדשה שיגרום לקטרקט אשר ניתן לדמיין על OCT. במקרה של טראומה עינית, העיניים צריכות להיות מחוץ למחקר בשל האפשרות של אובאיטיס המושרה על ידי עדשה46. מומלץ להשהות למשך 10 שניות לפני הסרת המזרק מהעין כדי לאפשר פיזור של מתלה ה-Mtb בתוך העין ולהפחית את הרפלוקס.

ניתן לשנות את מודל PMU כדי לשנות את עוצמת הדלקת החריפה על ידי שינוי ריכוז ה- Mtb בזריקה התוך-גופית. מינונים שונים הנעים בין 2.5 מיקרוגרם/מיקרון ל-15 מיקרוגרם/מיקרול נבדקו בעבר במעבדה שלנו. עם זאת, מינונים גבוהים מ-10 מיקרוגרם/μL נמצאו כגורמים נזק חמור לעיניים, כולל קרע ספונטני בעדשה, בצקת וצלקות קשות בקרנית, ומקף. דרגה זו של חומרה אינה אופיינית בחולים אנושיים עם אובאיטיס לאחר זיהומיות, ולכן, ריכוזים אלה אינם מומלצים. נמצא כי מינון של 5 מיקרוגרם/μL מייצר באופן אמין דלקת חריפה קלה עד בינונית ואובאיטיס כרונית קלה; המינון של 10 מיקרוגרם/μL מייצר מחלה חריפה בינונית עד חמורה באופן אמין ומחלה כרונית בולטת יותר. לפיכך, שינוי הריכוז התוך-ורידי יכול לספק חומרת מחלה חלופית לשימוש לפי הצורך בהתבסס על שאלת הניסוי. יש לבחור בקרות כדי להבטיח שהתוצאות נובעות מהתגובה ל- mTB ולא מטראומה הקשורה לזריקות תת עוריות או תוך-ורידיות. בפקדי הזרקת הבושה, ניתן להשתמש ב- PBS במקום תמצית ה- mTB. לצורך השוואה לבעלי חיים שלא נחשפו, יש להתייחס לדגימות נאיביות אמיתיות שכן עיניים אחרות אינן תמיד שקולות.

בשל גודלה הקטן של עין העכבר, OCT יכול להיות בדיקה רגישה יותר לזיהוי דלקת בתא הקדמי מאשר הדמיה ישירה או צילום שדה בהיר מיקרוסקופי. עבודה קודמת עם PMU בחולדות25 קבעה כי ניתן לזהות יותר תאים על ידי היסטולוגיה מאשר על ידי OCT, אך יש מתאם טוב בין שני האופנים. ל-OCT יש יתרון נוסף בכך שניתן להשתמש בו כדי לנטר את הדלקת לאורך אותה חיה. מודלים עכבריים גדולים אחרים של אובאיטיס, כגון EAU ו- EIU, השתמשו גם הם ב- OCT לניתוח כמותי 12,47,48. במודל PMU של עכברים, תאי החדר הקדמיים נראים רק ב- OCT ולא ניתן לראותם בבדיקות קליניות אלא אם כן קיים היפופיון גדול. דלקת זגוגית (vitrititis) ניתן לראות עם הדמיית פונדוס צבע, אבל זיהוי שינוי כמותי אפשרי רק עם הדמיה OCT. היבטים אחרים של המודל, כגון דלקת בכלי הדם ברשתית ופגיעה ברשתית, ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות OCT וצילום מיקרוסקופי של פונדוס ברייטפילד.

בעת שימוש ב- OCT, חשוב לשקול כיצד הדמיה מקומית יכולה להיות מושפעת מהבדלים אזוריים במידת הדלקת. דיווחים קודמים זיהו התפלגות לא אחידה של תאים בחדר הקדמי של בני אדם, כאשר יותר תאים ממוקמים נחותים49. בעכברים, נטייה דומה נפוצה. לפיכך, סריקות אנכיות או רדיאליות דרך זרם החילופין יסייעו להבטיח תמונות הלוכדות את טווח הדלקת. בנוסף, ביצוע הדמיה באותו מקום יספק גם עקביות לתמונות שנאספו באותה עין לאורך זמן. כדי לקבל תמונות באותו חלק של העין, השתמש בציוני דרך יציבים ובגישה שיטתית. עבור תמונות תא קדמיות, התמונה ממורכזת מיד בסמוך לפסגת הקרנית ומכוונת אנכית, כך שניתן לזהות נוכחות של היפופיון בזווית הנחותה. עבור תמונות מקטע אחורי, התמונה מרוכזת בעצב הראייה. מומלץ לשקול שימוש בלפחות 3 סריקות קו לצורך ניקוד כדי להבטיח לכידת שונות אזורית. במקרים שבהם הדלקת מוגבלת למיקומים היקפיים, רכישת סריקות נפח יכולה להיות מועילה. אוסף סריקות אמצעי האחסון יכול גם לסייע בלכידת וריאציות אזוריות, אך יגדיל את דרישות אחסון הנתונים.

בדיקות in vivo אחרות שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין דלקת במודל עכבר PMU כוללות הדמיה ביולומינסנציה13,35. ניתן לבצע בדיקות פוסט-מורטם כמו ניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים כדי לזהות ולכמת אוכלוסיות מסוג תאי חיסון מסתננים בחדר מימי ואחורי של העין12,26. במודל PMU, דלקת חריפה מאופיינת בתגובה מולדת עם חדירת נויטרופילים דומיננטית, ואחריה תגובה כרונית ומתמשכת של תאי T דומיננטיים שנמשכים למעלה מחודש35. בדיקות אחרות של תפקוד מערכת החיסון שניתן לבצע על רקמות שלאחר המוות כוללות ניתוח ציטוקינים של נוזל העין. בנוסף, ניתן להשתמש במבחנים אחרים במורד הזרם, כגון ריצוף mRNA והדמיית אימונופלואורסצנציה כדי להעריך דפוסי ביטוי של גנים וחלבונים של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון ברשתיתב-50,51 אובאיטיס.

ניתן לשכפל את מודל PMU במערכות מכרסמים אחרות באמצעות התאמות המתאימות למינים השונים. מודל PMU שימש בעבר חולדות וארנבות38,39,40. בחולדות, דלקת פנובאיטיס חריפה מתפתחת לאחר הזרקה תוך-גופית שפותרת באופן ספונטני במשך 14 יום מבלי לפתח סימנים של דלקת כרונית על ידי היסטולוגיה24. בארנבים, אינדוקציה של אובאיטיס משתמשת בשני סבבים של הזרקה תת עורית לפני הזרקה תוך-גופית, אך גם יוצרת פנובאיטיס חזקה. אחד היתרונות של שימוש במודל העכבר הוא הזמינות המוכנה של זנים מהונדסים ונוקאאוט רבים שיכולים לעזור להבין את המנגנון הבסיסי של אובאיטיס52. כל דגמי המכרסמים יכולים לשמש לבדיקות טיפול פרה-קליניות אם הסוכן מנוהל באופן מערכתי או כטיפה מקומית. עם זאת, בשל גודלם הגדול יותר, עיני חולדה וארנב הם מודלים טובים יותר לשימוש במחקרים פרה-קליניים של אפשרויות טיפול מושתלות או מקומיות בהזרקה עבור אובאיטיס.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק לחוקרים המעוניינים לחקור את המנגנונים של דלקת עיניים כרונית כלי חדש שאינו תלוי בחיסון קודם עם אנטיגנים עיניים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות, בת’סדה, מרילנד, ארצות הברית (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, מענק ליבת מחקר ראייה של UW (NEI P30EY01730), מתנות מקרן המחקר מארק דיילי, MD וקרן המחקר של כריסטופר ואלידה לת’ם, מענק מחלקתי בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ופרס פיתוח קריירה ממחקר למניעת עיוורון (KP). העבודה שנערכה בבריסטול נתמכה על ידי מימון נוסף של Sight Research UK וקרן אנדרווד.

Materials

AK-FLUOR Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial
AnaSed Akorn Animal Health, IL, USA NDC 59399-110-20 Xylazine 20 mg/mL
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution Alcon, TX, USA 8007-1
B-D Precision Glide Needles -25 G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305122
B-D Precision Glide needle -30-G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305106
Bond MAX, Bond Rx Leica Biosystems, IL,USA Automated IHC staining system
Chloramphenicol ointment Martindale Pharma, Romford, UK 1% w/w Chloramphenicol
EG1150H Leica Biosystems, IL,USA Tissue Embedding
Envisu R2300 Bioptigen/Leica OCT Machine
Freund's Incomplete Adjuvant BD Difco, NJ, USA 263910
GenTeal lubricant eye ointment Alcon, TX, USA —
GenTeal lubricant eye gel Alcon, TX, USA —
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract BD Difco, NJ, USA 231141
Hamilton RN Needle (33/12/2)S Hamilton, Reno, NV 7803-05(33/12/2) 33 G
Hamilton syringe Hamilton, Reno, NV CAL7633-01 5 µL
Insulin needle Exel International, USA 26029 1 mL
Isoflurane
Ketaset Zoetis, USA 377341 Ketamine HCL 100 mg/mL
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller World Precision Instruments, FL, USA UMP3
Micron IV Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA Alternative Imaging/OCT Machine
Nanofil 10 µL syringe World Precision Instruments, FL, USA NANOFIL
Nanofil Intraocular Injection Kit World Precision Instruments, FL, USA IO-KIT
Olympus SZX10 Olympus Dissection scope
PBS Gibco 14190
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 17478020115
RM2255 Leica Biosystems, IL,USA Tissue Sectioning
TB Syringe Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 309602 1 mL
Tetracaine 0.5% Alcon, TX, USA 1041544
Tissue Tek VIP series Sakura Finetek USA, Inc.,CA. Histology Tissue Processing
Tropicamide 1% Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK Minims
Tylenol Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA NDC 50580-614-01 Acetaminophen
Viscotears Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK Carbomer eye gel 0.2% w/w
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
  2. Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
  3. DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
  4. Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
  5. Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -. B., Chan, C. -. C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
  6. Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
  7. Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
  8. Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
  9. Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
  10. Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
  11. Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
  12. Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
  13. Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
  14. World Health Organization. Global tuberculosis report 2019. World Health Organization. , (2019).
  15. Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
  16. Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
  17. El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S. Tuberculous uveitis. Middle East African Journal of Ophthalmology. 16 (4), 188-201 (2009).
  18. Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
  19. Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M. Post-infectious uveitis. Ocular Immunology and Inflammation. 24 (6), 603-606 (2016).
  20. Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
  21. Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K. Update on ocular tuberculosis. Current Opinion in Ophthalmology. 23 (6), 551-556 (2012).
  22. Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
  23. Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018 (2021).
  24. Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
  25. Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
  26. Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
  27. Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961 (2020).
  28. Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
  29. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
  30. Underwood, W., Anthony, R. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
  31. Donovan, J., Brown, P., Coligan, J. E. Handling and restraint. Current protocols in immunology. , (2006).
  32. Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44 (2012).
  33. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  34. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  35. John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377 (2020).
  36. Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978 (2017).
  37. Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
  38. Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
  39. Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
  40. Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11 (2019).
  41. Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
  42. Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
  43. Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
  44. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  45. Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912 (2018).
  46. Nche, E. N., Amer, R. Lens-induced uveitis: an update. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 258 (7), 1359-1365 (2020).
  47. Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002 (2013).
  48. Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
  49. Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
  50. Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033 (2019).
  51. Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106 (2020).
  52. Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R., Perl, A. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 443-469 (2012).

Tags

Primed Mycobacterial UveitisPMU ModelOcular InflammationChronic UveitisMycobacterial InfectionTransgenic MiceImmune PrivilegeHeat-killed MycobacteriaFreund’s Incomplete AdjuvantC57BL/6J MiceSubcutaneous Injection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
John, S., Bell, O. H., Wilson, L., Copland, D. A., Pepple, K. L. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis. J. Vis. Exp. (178), e62925, doi:10.3791/62925 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image