O Modelo de Rato de 6-hidroxidopamina da Doença de Parkinson

As principais características neuropatológicas da DP são a neurodegeneração progressiva crônica de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNc) e a presença de corpos de Lewy contendo proteína α-sinucleína1. À medida que os neurônios dopaminérgicos projetam seus axônios no estriado através da via nigrostriatal, a neurodegeneração dos neurônios na SNc resulta em um déficit dopaminérgico no estriado2. A ausência de dopamina no estriado causa desequilíbrio nas atividades das vias de controle motor direto e indireto, responsável pelos principais sintomas motores da DP: akinesia (movimento lento), bradiquinesia (dificuldade em iniciar movimentos), rigidez muscular e tremor no ^repouso3,4,5.

Como os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos no início da DP ainda não são totalmente compreendidos, os tratamentos principais disponíveis atualmente buscam aliviar os sintomas motores através de farmacoterapias, estimulação cerebral ^profunda6,7, terapias ^genéticas8 e transplante de ^células9. Portanto, a pesquisa pré-clínica é fundamental para elucidar os mecanismos envolvidos no surgimento da DP e descobrir novas metodologias para o diagnóstico precoce e novas terapias para prevenir ou parar a degeneração dos neurônios afetados pelo ^PD10.

Modelos animais têm sido amplamente utilizados para simular a patologia humana em laboratório, contribuindo para o avanço da medicina e da ciência11,12,13,14. No entanto, é essencial ressaltar que a escolha correta do modelo animal é fundamental para o sucesso do estudo. Portanto, o modelo animal deve ser validado em três aspectos principais: i) validade facial, na qual o modelo animal deve ter as características da patologia humana; ii) validade construtiva, na qual o modelo animal deve ter uma base teórica sólida; e iii) validade preditiva, na qual os modelos animais devem responder aos tratamentos de forma semelhante ao tratamento clínico.

Atualmente, vários animais são usados como modelos animais para DP. Os principais grupos incluem mamíferos, como roedores, primatas, miniporcos, cães e gatos, e outros grupos como drosophila e zebrafish. Roedores são o modelo animal mais clássico para DP e o mais usado devido à sua facilidade de manuseio e manutenção. Além disso, a anatomia e os mecanismos moleculares, celulares e farmacológicos da DP são semelhantes em roedores e ^humanos15.

Uma revisão publicada por Kin e colegas em 2019 analisou as principais metodologias de modelo animal utilizadas para DP nos anos 2000 e descobriu que o modelo animal mais utilizado envolvia neurotoxinas como 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropydineri (MPTP). Ambas as neurotoxinas causam a desregulação mitocondrial em neurônios dopaminérgicos na via nigrostriatal, levando à morte ^celular16. Outro modelo amplamente utilizado envolve a manipulação genética através da mutação em genes específicos envolvidos no início da DP, causando a desregulação ^{mitocondrial17}. Modelos de neurotoxinas são comumente utilizados para avaliar e comparar terapêuticas, enquanto modelos genéticos são usados para estudar o desenvolvimento de terapias preventivas e ^PD15 idiopático.

A neurotoxina MPTP foi descoberta para causar parkinsonismo em meados da década de 1980 depois que sete pacientes usaram a substância e apresentaram sintomas graves de DP. Além dos sintomas, os pacientes responderam ao tratamento com L-DOPA, o que fez com que os pesquisadores ligassem a molécula diretamente à DP. Após a publicação do caso, em 1986, vários pesquisadores começaram a usar MPTP em pesquisas pré-clínicas de ^PD18. Pesquisadores descobriram que sendo uma molécula lipofílica, o MPTP pode atravessar a barreira hemencefálica (BBB) e ser convertido em MPP⁺¹⁹. Esta substância tóxica se acumula dentro dos neurônios e causa danos ao complexo 1 da cadeia respiratória mitocondrial, levando à morte de neurônios dopaminérgicos20.

O modelo de neurotoxina 6-OHDA foi usado pela primeira vez para induzir a degeneração de neurônios monoaminas da via nigrostriatal em ¹⁹⁶⁸²¹. O modelo 6-OHDA é comumente usado para causar neurodegeneração na via nigrostriatal, pois é um análogo de dopamina e tóxico para células contendo catecolamina. Depois que 6-OHDA entra no cérebro, ele pode ser tomado pelo transportador de dopamina (DAT) em neurônios dopaminérgicos, levando à degeneração da via nigrostriatal22. Como o 6-OHDA não penetra no BBB, deve ser administrado diretamente através da injeção estereotaxal ^{intracerebral23}. Um inibidor de recaptação de noradrenalina é frequentemente combinado com microinjeção 6-OHDA para preservar fibras noradrenérgicas e fornecer uma degeneração mais seletiva de neurônios dopaminérgicos24.

Após o DAT assumir o 6-OHDA, ele se acumulará no citosol dos neurônios, produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e levando à morte ^celular15. Três modelos diferentes de lesões de 6-OHDA são frequentemente utilizados: i) lesões ao ^SNc25,26; ii) lesões ao estriado27,28; iii) lesões ao ^MFB29,30. Lesões causadas no estriado resultam em uma lenta e retrógrada degeneração de neurônios dopaminérgicos no SNpc. Em contraste, lesões causadas no SNpc e MFB resultam em degeneração rápida e total dos neurônios, levando a sintomas parkinsonianos mais ^avançados31.

A injeção unilateral ou bilateral de 6-OHDA pode causar neurodegeneração em neurônios dopaminérgicos. 6-OHDA nem sempre causa danos graves aos neurônios; às vezes, a injeção resulta em danos parciais, que também é usado para simular os estágios iniciais do ^PD32. A injeção unilateral é mais comumente usada devido à capacidade do modelo de avaliar os déficits motores do animal e prever a perda celular através de testes como a rotação induzida pela anfetamina/apomorfina e o teste de ^pisada29. As injeções bilaterais são mais utilizadas para avaliar a memória espacial e o ^{reconhecimento33}.

O teste de rotação induzido pela anfetamina/apomorfina é um teste comportamental comumente usado para prever a perda celular na via nigrostriatal. É definido como um processo no qual a administração repetida de agonistas de dopamina leva a uma intensificação do comportamento rotacional em animais 6-OHDA-lesionados34. O comportamento rotacional consiste em quantificar a rotação ipsilateral induzida pela anfetamina ou as voltas contralaterais induzidas pela apomorfina em roedores unilateralmente lesados. O comportamento rotacional induzido por drogas tem sido criticado porque a rotação não corresponde aos sintomas da DP em humanos e pode ser afetada por variáveis como tolerância, sensibilização e “priming”³⁵.

O escorraça é um dos fatores mais críticos nesses testes comportamentais. Alguns casos foram relatados em que uma única dose de L-DOPA levou a uma falha nos comportamentos ^{rotacionais36}. Além disso, outro fator crítico relacionado à aplicação combinada do teste induzido pela anfetamina e do teste induzido pela apomorfina para uso paralelo é que eles medem diferentes pontos finais devido a diferentes mecanismos de ação, refletindo a inativação de diferentes mecanismos de sinalização e caminhos. Além disso, o teste induzido pela anfetamina é mais preciso para medir lesões nigrostriais acima de 50-60%, enquanto o teste induzido pela apomorfina é mais preciso para lesões acima de 80%³⁷.

O teste de pisada surgiu como um teste comportamental que indica déficits relacionados à degeneração do neurônio dopaminérgico e efeitos terapêuticos. Permite a análise da akinesia causada por uma lesão 6-OHDA em neurônios dopaminérgicos sem um procedimento induzido por drogas. Além disso, o teste tem sido bem estabelecido e comumente utilizado desde 1995, quando foi descrito pela primeira vez por Olsson et ^al.35. Em 1999, Chang et ^al.38 também analisaram e compararam o desempenho dos ratos no teste de pisada com o nível de degeneração causado pelo 6-OHDA e descobriram que os animais que tiveram pior desempenho no teste de pisada também tiveram uma degeneração mais significativa dos neurônios dopaminérgicos.

O teste de pisada é um excelente método para prever danos nigrostriais dopaminérgicos graves em ratos com lesões de 6 OHDA. Evidências sugerem que os déficits motores aparecem no membro dianteiro contralateral da infusão 6-OHDA durante o teste de pisada quando o grau de perda dopaminérgica em SNc é >90%³⁹. Este artigo descreve os protocolos, metodologias e materiais utilizados para realizar cirurgia estereotaxica para a infusão unilateral de 6-OHDA no MFB de ratos e como prever as lesões dopaminérgicas causadas pela toxina através do teste de pisada.