Werking van laboratoriumfotobioreactoren met online groeimetingen en aanpasbare lichtregimes

Hier is de zuurstofstroomsnelheid een maat voor de fotosynthetische snelheid van de cultuur. Hogere snelheden van fotosynthese, en dus koolstoffixatie, vertalen zich in hogere groeisnelheden. Dit betekent dat de gebruiker zuurstofstroomsnelheden tussen verschillende behandelingen en operationele dagen kan vergelijken als een proxy voor groei. In het kort werkt de gassensor door gasbellen in een meetcel met twee kamers op te vangen en vrij te geven (figuur 4B). Gasbellen van de inlaat aan de basis van de sensor reizen omhoog door de verpakkingsvloeistof. Bubbels hopen zich op in één kamer van de meetcel tot een volume van ~ 3,2 ml. Zodra deze drempel is bereikt, worden de meetcelpunten gegeven. Hierdoor komt het gas vrij en wordt het systeem gereset. Elke tip wordt vastgelegd door de data-acquisitiesoftware. In de voorbeeldgegevens werd de groeisnelheid van drie behandelingen met variërende lichtintensiteiten overdag en initiële biomassaconcentraties (IBC’s) vergeleken. Deze behandelingen werden willekeurig gekozen voor demonstratieve doeleinden. Het waren (A) 300 μmolfotonen m-2 s-1 en 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en 0,13 gAFDW L-1, en (C) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en 0,40 gAFDW L-1. Deze instralingen werden gemeten met een bolvormige sonde in het midden van de PVC-buis voordat flessen op de platforms werden geplaatst. Cultuurdiepte en -dichtheid beïnvloeden de verzwakking van het licht. Vandaar dat de werkelijke lichtintensiteit die door microalgen wordt ervaren, kan verschillen van de gerapporteerde. Elke behandeling werd uitgevoerd in drievoud – binnen één PBR met drie flessen. Hier werd een succesvol experiment gekenmerkt door nauw gerepliceerde dagactieve patronen van gasproductie (figuur 7A-C). Tijdens verlichte uren (dag) nam de gasproductie gestaag toe en tijdens niet-verlichte uren (nacht) stopte de gasproductie (figuur 7A-C). Twee gassen worden geproduceerd door microalgen, zuurstof uit fotosynthese en koolstofdioxide uit ademhaling28. Fotosynthese is beperkt tot verlichte uren, terwijl de ademhaling continu plaatsvindt, maar het meest actief is ‘s nachts28. Fotosynthese bouwt zich op, terwijl ademhaling biomassa kataboliseert28. Aanvankelijk is de samenstelling van headspace gas identiek aan die van de atmosfeer. Bij elke omslag van de meetcel verplaatst O2 atmosferisch gas. Daarom werden gassensormetingen toegeschreven aan de productie van O2, zelfs als het uitgaande gas niet zuiver O2 was. De minimale gasinlaatdruk voor de gassensor is extreem laag, 8-9 mbar, waardoor de druk van de kopruimte van de fles slechts iets boven de atmosfeer ligt (1,01 bar op zeeniveau). Vandaar dat de metingen van de gassensor beginnen kort nadat O2-bellen het medium hebben verlaten. CO2 die vrijkomt bij de ademhaling draagt om twee redenen niet bij aan de metingen van gassensoren. Ten eerste reageert CO2 in het alkalische medium op bicarbonaat, waardoor de pH afneemt (figuur 8). Ten tweede, als CO2 ontsnapt, lost de gassensorverpakkingsvloeistof, Silox, CO2-bellen op voordat ze de meetcel kunnen bereiken, waardoor CO2 aan het vloeistofoppervlak wordt ontgast29. Dit wordt ondersteund door het ontbreken van nachtelijke gassensormetingen. Degenen die wel optraden, werden geregistreerd kort nadat de lichten waren uitgeschakeld, wat aangeeft dat de metingen de resterende zuurstofafgifte overdag vertegenwoordigden (figuur 7). In de experimentele opstelling (met behulp van lokale temperatuur- en drukgegevens) had een kopruimte van 80 ml bij omgevingsdruk 340 ml exsolved O2 nodig om een O2 partiële druk van 99% vast te stellen. Hier varieerde het totale zuurstofvolume geproduceerd gedurende 4 dagen van 316 (SEM ± 11) ml in behandeling A tot 902 (SEM ± 51) ml in behandeling C (tabel 1). Daarom zou tegen het einde van het experiment de headspace van alle flessen voornamelijk O2 bevatten. De verhoogde concentratie van headspace O2, en dus de verlaagde concentratie van N2, zou de partiële druk en verzadiging van deze gassen hebben beïnvloed. Met een 99% O2 headspace werd een 5x toename in DO berekend. Voor de 1,1 L-culturen vertaalde dit zich in een extra 23 ml DO. Omgekeerd werd geschat dat de verschuiving naar een N 2-hoofdruimte van 1% ervoor zou hebben gezorgd dat 15 ml N2 zou zijn verdwenen. Dit betekent dat onder een bijna zuivere zuurstofkopruimte meer O2 opgelost was dan N2 werd verplaatst. Omdat er dus meer O2 in het medium overblijft, zou dit effect hebben geleid tot lichte onderschattingen van de hoeveelheid geproduceerde fotosynthetische zuurstof. De belangrijkste uitdaging van deze methode ontstond toen culturen dicht werden. Met meer biomassa, en dus meer ademhaling, nam de vraag naar O2 toe. Het nachtelijke O2-verbruik genereerde een hoofdruimte onder druk. Dit zorgde ervoor dat gassensorverpakkingsvloeistof door de gasleiding omhoog reisde. Toen de productie van O2 werd hervat, moest verpakkingsvloeistof terug in de gassensoren worden gereden. Dit veroorzaakte een vertraging in de eerste gassensormeting. Op de vierde nacht zorgde de omvang van deze onderdruk er echter voor dat verpakkingsvloeistof twee van de drie replica’s van behandeling B bereikte en indruppelde, waardoor een oppervlakteolievlek ontstond. Door het verlaagde vloeistofniveau van de pakking zijn de gassensoren kortgesloten, waardoor ongemeten O2 rechtstreeks in de atmosfeer wordt vrijgegeven. Hierdoor werd de gegevensverzameling afgevlakt (figuur 7B). Onderdruk kan ook worden veroorzaakt door een temperatuurgeïnduceerde samentrekking van het headspace-volume. Het effect was hier echter minimaal. Koellichaamkanalen en luchtstroom voerden overtollige warmte voldoende af. Van de twee geteste lichtregimes verminderde de maximale temperatuurverandering het volume van de headspace met 1% of minder, wat overeenkomt met een verplaatsing van 800 μL verpakkingsvloeistof in een headspace van 80 ml. De maximale dagelijkse temperatuurschommeling was 1,4 °C voor de 300 μmolfotonen m-2 s-1 regimes (figuur 6) en 3,2 °C voor de 600 μmolfotonen m-2 s-1 regimes. De gemiddelde temperatuurstijging overdag voor de 300 en 600 μmolfotonen m-2 s-1 regimes was respectievelijk 0,7 en 1,8 °C. De cultuurtemperaturen keerden ‘s nachts terug naar de basislijn (figuur 6). Gegevens over de groeisnelheid met een hoge resolutie kunnen trends onthullen die anders onopgemerkt zouden kunnen blijven. Denk aan behandelingen B en C. Ondanks hun verschillende IBC’s genereerden beide dezelfde hoeveelheid totale biomassa (gAFDW), wat een identieke verschuiving in de gemiddelde pH veroorzaakte (tabel 1). Gegeven alleen start- en eindgegevenspunten, kan een individu terecht aannemen dat er geen verschil is in de gemiddelde groeisnelheid tussen de twee behandelingen (tabel 1). Uit online zuurstofstroomgegevens bleek echter dat elke behandeling verschillende dagelijkse groeisnelheden had. Deze variaties kwamen ook tot uiting in tweemaal daagse pH-metingen (figuur 8). Op de eerste dag was de groeisnelheid van behandeling B lager dan die van behandeling C. Op dag drie keerde dit om met de groeisnelheid van behandeling B die die van behandeling C overtrof (figuur 7B,C). Gegevens over het zuurstofdebiet gaven aan dat de hoogste groeisnelheid optrad op dag drie bij behandeling B (figuur 7B). Het totale zuurstofvolume dat door elke fles in de drie behandelingen werd gegenereerd, werd gebruikt om hun respectieve verandering in totale biomassa (gAFDW) te schatten. Dit werd bereikt met behulp van een generieke vergelijking voor fotosynthetische biomassasynthese: CO2 + 0,2 NH3 + 0,6 H2O = CH1,8 O0,5 N0,2 + 1,05 O2. De toename van de headspace O2 partiële druk en de daaropvolgende stijging van de DO-verzadiging zouden naar verwachting een lichte onderschatting van de biomassagroei veroorzaken. Dit gold voor vijf van de zeven voorbeelden (tabel 2). Gemiddeld lag de geschatte biomassagroei binnen 10% van de gemeten biomassagroei. Sommige schattingen verschilden slechts 1-3 mg van de gemeten groei. Twee voorbeelden overschatten de groei, d.w.z. er werd meer zuurstof geproduceerd dan de biomassagroei kon verklaren. Elke O2 die ‘s nachts door ademhaling wordt geconsumeerd, moet de volgende dag worden weerspiegeld in de vertraging in de O2-productie . Hier werden experimenten aan het einde van de nacht beëindigd. Op deze manier wordt nachtelijk biomassakatabolisme tijdens de laatste 8 uur van elk experiment niet gemeten. Dit kan leiden tot overschattingen van de groei van biomassa, vooral in dichte culturen. Als zodanig wordt aanbevolen dat experimenten aan het einde van verlichte uren worden beëindigd. Figuur 1: Reactorstandaardbasis. (A) Afmetingen van basiscomponenten in mm. (B) Oriëntatie van metalen hoeksteunen die de twee verticale steunen beveiligen. (C) Een van de vier korte staallengtes verbindt de achterste helft van de PVC-buis met de reactorstandaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Elektrische componenten. (A) Achteruitkijkspiegel van de PBR met bovenbalk en configuratie van elektrische componenten. (B) Vooraanzicht van PBR na installatie bij licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Details van het flessenplatform. (A) Afmetingen van de bovenste en onderste laag in mm. (B) Uitsparing van boutkoppen in beide lagen. (C) Beugels verbinden de onderste laag rechtstreeks met de achterste helft van de PVC-buis. (D) Vijf korte stukken stijve buizen die over smalle bouten zijn aangebracht, houden de bovenste en onderste lagen uit elkaar. (E) Wanneer het flessenplatform compleet is, moet het oppervlak vlak zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Gasleiding en optionele bemonsteringspoort. (A) Gasleidingen verbinden elke fleskopruimte met externe gassensoren. Als de bemonsteringspoort vereist is, moeten gasleidingen een eenrichtingsklep direct na de naald bevatten. (B) Volumetrische gassensor. Het vloeistofverpakkingsniveau moet de traceerschroef raken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Standaardcurve met betrekking tot led-besturingssoftware-instellingen voor interne lichtintensiteit. Witte cirkels en grijze driehoeken vertegenwoordigen elk een individuele PBR. Voor elke lichtinstelling werden alle vier de armaturen op een identieke waarde ingesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Cultuurtemperatuurverandering voor de 300 μmolfotonen m-2 s-1 lichtregimes. Tijdens het dagprogramma van 24 uur, 16:8 uur verhoogden LED’s de dagcultuurtemperatuur. De blauwe pijl geeft het verschil aan tussen de minimum- en maximumtemperatuur. Een lichte programmafout veroorzaakte de temperatuurdip voor de schemering; dit werd gecorrigeerd voordat het experiment begon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Zuurstofproductie voor drie unieke experimentele omstandigheden. Elke reactor kreeg een andere combinatie van lichtintensiteit en initiële biomassaconcentratie (IBC); (A) 300 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,13 gAFDW L-1, (C) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,40 gAFDW L-1. Topgrafieken tonen de cumulatieve zuurstofproductie (ml) en het gasdebiet (ml / h). Effen zwarte lijnen, onderbroken blauwe lijnen en gestippelde rode lijnen zijn replicaties. De looptijd voor elk experiment was 104 uur, inclusief vier volledige dag-nachtcycli van 16:8 uur. Donkeroranje schaduw staat voor nachtelijke uren en lichtoranje overdag. Merk op dat bij behandeling B de zuurstofproductie op dag 4 voor twee van de drie repliceert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: pH-respons. Elke reactor kreeg een andere combinatie van lichtintensiteit en IBC; (groene diamanten) 300 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,03 gAFDW L-1, (rode driehoeken) 600 μmolfotonen m2 s-1 en IBC 0,13 gAFDW L-1, (paarse cirkels) 600 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC 0,40 gAFDW L-1 . Donkeroranje schaduw staat voor nachtelijke uren en lichtoranje overdag. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Behandeling Lichtintensiteit (μmol fotonen m-2 s-1) IBC (gAFDW L-1) Δ totale biomassa (gAFDW) Δ pH Totaal geproduceerde zuurstof (ml) Een 300 0.031 0,289 (± 0,01) 0,15 (± 0,01) 316,2 (±11,4) B 600 0.130 0,674 (± 0,02) 0,52 (± 0,27) 834.6* C 600 0.400 0,675 (± 0,02) 0,55 (± 0,03) 902,2 (±50,5) * Slechts één van de drie replica’s was succesvol Tabel 1: Groeimetrische verschuiving van uur 0 naar 104. Haakjes vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Behandeling Lichtintensiteit (μmolfotonen m-2 s-1) IBC (gAFDW L-1) Biomassagroei gemeten (gAFDW) Biomassagroei voorspeld (gAFDW) Onderschatten (%) Een 300 0.031 0.289 0.288 0.5 Een 300 0.031 0.311 0.270 13.1 Een 300 0.031 0.268 0.247 7.9 B 600 0.13 0.708 0.705 0.4 C 600 0.4 0.718 0.796 -10.9 C 600 0.4 0.640 0.830 -29.7 C 600 0.4 0.668 0.659 1.3 Tabel 2: Groeischattingen op basis van totaal gemeten zuurstof. Slechts één replica van de 300 μmolfotonen m-2 s-1 en IBC = 0,13 gAFDW L-1 behandeling liep tot voltooiing. Aanvullende figuur 1: Screenshot van LED-besturingssoftware. Elk van de vier verlichtingsarmaturen kan onafhankelijk van elkaar worden bediend door de dimmerknoppen te verschuiven of een numerieke waarde in het tekstvak in te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur 2: Schermafbeelding van het configuratievenster van de software voor gegevensverzameling. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur 3: Schermafbeelding van het logboekvenster van de data-acquisitiesoftware. Heldergroene rechthoeken geven online gassensoren aan. Gegevens worden in realtime weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel 1: Voorbeeld 24 uur lichtregime. Voor een dagprogramma van 16:8 uur zijn er 48 sets van elk 30 minuten. Sterretjes geven de voorgestelde bemonsteringstijden aan. Klik hier om deze tabel te downloaden. Aanvullende tabel 2: Hoge alkaliteit hoge pH-gemiddelde samenstelling. Klik hier om deze tabel te downloaden. Aanvullende tabel 3: Trace element oplossing. Voeg toe aan een eindconcentratie van 1 ml/l aan het basismedium. Klik hier om deze tabel te downloaden.