Burada, kollajen seçici kontrast artırımı ile sağlıklı ve patolojik büyük memeli tüm kalplerinin yüksek çözünürlüklü mikro bilgisayarlı tomografi görüntülerini elde etmek için bir protokol sunuyoruz.
Yapısal yeniden yapılanma, kalbe uygulanan kronik patolojik streslerin ortak bir sonucudur. Hastalıklı dokunun mimari ve kompozisyonel özelliklerini anlamak, aritmik davranışla etkileşimlerini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Klinik reversiyonun altında mikro ölçekli doku yeniden şekillenmesi, genç erişkinlerde yüksek prevalansı olan önemli bir ölümcül aritmi kaynağı olarak ortaya çıkmaktadır. Büyük memeli tüm kalpleri gibi klinik öncesi modeller için yeterli mikro ölçekli çözünürlükte yüksek görüntüleme kontrastı elde etmede zorluklar devam etmektedir. Ayrıca, üç boyutlu yüksek çözünürlüklü görüntüleme için doku bileşimi seçici kontrast iyileştirme hala eksiktir. Mikrobilgisayarlı tomografi ile tahribatsız görüntüleme, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için umut vaat etmektedir. Amaç, büyük biyolojik örneklerde zayıflama nedeniyle X-ışınından kaynaklanan acıyı hafifletmekti. Kalpler, sağlıklı domuzlardan (N = 2) ve koyunlardan (N = 2) ya kronik miyokard enfarktüsü ve fibrotik skar oluşumu ya da indüklenmiş kronik atriyal fibrilasyon ile ekstrakte edildi. Eksize edilmiş kalpler şunlarla perfüze edildi: bir kalsiyum iyonu söndürme ajanı ve bir vazodilatör ile desteklenmiş bir tuzlu su çözeltisi, seri dehidrasyonda etanol ve vakum altında hekzametildisilizan. İkincisi, 1 hafta boyunca hava ile kurutma sırasında kalp yapısını güçlendirdi. Kollajen dominant doku, X-ışını kontrastını arttırıcı bir ajan olan fosfomolibdik asit tarafından seçici olarak bağlandı. Doku konformasyonu havada stabildi ve uzun süreli mikrobilgisayarlı tomografi alımlarının yüksek çözünürlüklü (izotropik 20.7 μm) görüntüler elde etmesine izin verdi. Difüzyon yoluyla optimal kontrast madde yüklemesi, sağlıklı domuz ventriküllerinde epitel tabakasının ve subendokardiyal Purkinje liflerinin seçici kontrast artışı gösterdi. Atriyal fibrilasyon (AF) kalpleri, daha büyük kollajen içeriğine atfedilen atriyumun arka duvarlarında ve uzantılarında artmış kontrast birikimi gösterdi. Miyokard enfarktüsü kalpleri, kardiyak fibroz bölgelerinde seçici olarak artmış kontrast gösterdi ve bu da hayatta kalan miyokard kas liflerinin iç içe geçmesini sağladı. Kontrastlı hava ile kurutulmuş doku preparatları, bozulmamış büyük memeli kalbinin mikro ölçekte görüntülenmesini ve altta yatan hastalık bileşenlerinin seçici kontrast arttırılmasını sağlamıştır.
Yapısal kalp hastalığı tüm dünyada kardiyak ilişkili mortalitenin çoğunluğunu oluşturmaktadır1. Kardiyak yapının yeniden şekillendirilmesi miyokard ortamını ve interstisyel boşluğu etkiler. Hem kardiyak elektriksel hem de mekanik fonksiyon miyosit organizasyonuna bağlı olduğundan, bozulma dayanılmaz kardiyak aritmi, bozulmuş kan pompalama eylemleri ve kalp yetmezliği 2,3,4,5,6,7,8,9’a yol açabilir. Yapısal kalp hastalıklarına yönelik küratif tedavilerdeki gelişmeler, hastalık prevalansı 2,5 ile çok daha ağır basmaktadır. Bu nedenle, kardiyak aritmilerin anatomo-morfolojik profillerini ve bunun sonucunda ortaya çıkan patogenezi daha iyi anlamak için yapısal kalp hastalıklarının klinik öncesi modellerinin sayısı giderek artmaktadır 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Yapısal hastalık spektrumunda gözlenen, interstisyel fibrozisin upregülasyonudur ve daha yaygın olarak iskemi ile ilişkili vakalarda, fibroz ve yağ dokusu ile miyokard replasmanıdır18. Patolojik hücre dışı bileşenlerin morfolojik olarak anlaşılması, aritminin potansiyel substratlarının tanımlanmasını sağlayabilir. Hastalığın dağılımı ve derecesi, aritmojenik riskin güçlü göstergelerini sağlar. Yine de, sağlam kalpteki makro ve mikro ölçekleri entegre ederek hastalık profillerini kapsamlı bir şekilde görüntülemek için zorluklar devam etmektedir.
X-ışınlarına dayanan mikro-bilgisayarlı tomografi (mikroBT), kontrast maddeler kullanarak yumuşak biyolojik doku mikroyapısını sorgulamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Küçük kemirgenlerden kalpler için son derece ayrıntılı anatomik haritalar 24,25,26 ve büyük memeli kalplerinden27,28 küçük disseke örnekler elde edilmiştir. Bununla birlikte, büyük memeli kalplerinin tüm organ seviyesindeki görüntüleme, geleneksel doku hazırlama teknikleri kullanılarak X-ışını fotonlarının zayıflatıldığı aşırı yol uzunlukları gösterir. Bu, dokunun kontrast yüklenmesini ve elde etme sırasında numunenin bir kontrast madde çözücüsüne daldırılmasını içerir. Örneklem büyüklüğünün ve çözünürlüğünün arttırılması, toplam edinme süresinin uzamasını zorunlu kılar. Bu nedenle, doku stabilitesi kullanılabilir görüntü rekonstrüksiyonu için çok önemli hale gelir, bu da kurumadan kaynaklanan doku deformasyonunun önlenmesi gerektiği anlamına gelir. Bununla birlikte, bir daldırma sıvısının kullanımının dezavantajları vardır: (i) genel arka plan sinyal yoğunluğu ihmal edilemez hale gelir ve (ii) dokuya bağlı kontrast moleküllerinin seyreltilmesini teşvik eder. Bu faktörlerin her ikisi de görüntü kontrastının düşürülmesine katkıda bulunur.
Bu çalışma, arka plan foton zayıflamasını hafifletmek ve kontrast arttırıcı ajanların sağladığı dinamik aralığı optimize etmek için yeni bir doku işleme boru hattını detaylandırmaktadır. Doku deformasyonunu sınırlamak için kimyasal doku takviyesi ile doku hava kurutma yaklaşımının kullanılması önerilmektedir29. Bu nedenle, doku örnekleri uzun kazanımlar için havada sabit kalabilir ve daldırma sıvılarının arka plan katkılarını atlayabilir. Bu metodoloji boru hattı şunları sağlar: (i) tüm domuz kalpleri kullanılarak optimize edilmiş kapsamlı bir doku işleme ve görüntüleme protokolü; (ii) kontrast konsantrasyonu ve yükleme tekniklerinin değerlendirilmesi ve (iii) bu boru hattının koyun kalplerinde atriyal fibrilasyon ve miyokard enfarktüsünün iki ayrı kronik hastalık modelinde uygulanması. Kronik hastalık modellerinin gelişimi, her kronik kalp hastalığı modeli, perkütan koroner arter embolizasyonunun neden olduğu miyokard enfarktüsü13 ve kendi kendine yeten atriyal fibrilasyon30 için başka yerlerde tanımlanmıştır.
Büyük doku preparatları için ayrıntılı bir protokol, daha sonraki yüksek çözünürlüklü yapısal görüntüleme için büyük memelilerden gelen tüm kalpler kullanılarak hazırlanmıştır. Hava ile kurutma yaklaşımı, arka plan X-ışını zayıflamasının etkilerini ortadan kaldırdı ve dokuyu maksimum derecede optimize etti: arka plan kontrastı29. Bu yaklaşım kullanılarak, çapı 7,2 cm’ye kadar olan numunelerde hacimsel görüntüleme için 20 μm aralığında izotropik çözünürlük elde edildi. Bununla birlikte, yumuşak dokunun mikroBT’si tipik olarak X-ışını emilimini ve mikroBT sistemlerinin duyarlılığını iyileştirmek için spesifik olmayan kontrast maddelerin kullanımına dayanır34. X-ışını kontrast ajanları genel X-ışını zayıflamasını ve yumuşak doku görüntüleme iyileştirmesini iyileştirse de, doku bileşenlerinin biyokimyasal bileşime göre ayrılması zor olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, laboratuvar ortamında yaygın bir X-ışını kontrast maddesi olan PMA ile kombinasyon halinde hava ile kurutulmuş kalplerin kullanılmasının, seçici olarak hücre dışı bileşenleri boyadığı gözlenmiştir. Sağlıklı miyokard ile ilişkili bağ dokusu ve kronik hastalıklarda patolojik yapısal düzelme geliştirilmiştir.
Biyolojik dokunun hava ile kurutulması işlemi, numunenin deformasyonuna direnmek için bir müdahale gerektirir. Elektron mikroskobu için numune hazırlama da benzer gereksinimlere sahiptir. Tipik olarak, dokunun sıvı içeriğinin yüzey gerilimini ortadan kaldırmak için doku daldırma ortamı, sıcaklık ve basınç dengesini kullanan kritik noktalı bir kurutma yöntemi kullanılır, bu da buharlaşma üzerine moleküler düzeyde deformasyona neden olur35. Bu yaklaşım, numunenin su içeriğinin, küçük ve kolayca yayılabilir numunelerde daha güvenilir olan sıvı karbondioksit ile eşit şekilde değiştirilmesini gerektirir. Alternatif olarak, dokunun yapısal bütünlüğü iyileştirilebilir ve hava ile kurutma, yani buharlaşma aşaması, genel deformasyonu azaltmak için daha uzun bir süre boyunca uygulanabilir. HMDS molekülü, doku örneğinin moleküler organizasyonunu güçlendirmek ve stabilize etmek için silikon bazlı bir iskele oluşturmak üzere sililasyona tabi tutulur36. Evaporasyon, özellikle numune yüzeyi ve intramural tabakalar arasında homojen olmayan buharlaşmayı önlemek için ortamdan dolaşımdaki hava akımlarını sınırlayarak daha da uzatılır.
Daha önce yumuşak dokuların mikroBT görüntülemesinde çok sayıda kontrast madde kullanılmıştır. En yaygın olanları iyot, fosfotungstik asit (PTA) ve PMA’dır. İyot özellikle daha yüksek difüzyon oranı34,37,38 nedeniyle kullanılmıştır. Bununla birlikte, iyot, HMDS reaktifi36’nın sililasyonu için bir katalizör görevi görür. Katalizörlü reaksiyon agresif ve ekzotermiktir, numunenin tahrip olma riski yüksektir ve numunenin eksik kurutulması nedeniyle artık HMDS kalırsa güvenlik riski yüksektir. Etanol içinde çözünmüş hem PTA hem de PMA, HMDS ile birlikte güvenle kullanılabilir. PTA ve PMA’nın, iyot boyama38 ile karşılaştırıldığında, mineralize olmayan intervertebral disklerdeki ince yapıların daha fazla çözme gücü sağladığı gösterilmiştir. Memeli örneklerinin mikroBT görüntülemesinde, PTA ve PMA, fare embriyolarını39, fare kardiyovasküler sistemini37, tavşan kası ve beynini40 ve domuz damarlarını41 boyamak için kullanılmıştır. PTA, PMA’dan daha yüksek bir moleküler kütleye ve çözelti yoğunluğuna sahiptir. Bu kısmen, PTA’daki başlıca zayıflatıcı element olan tungstenin daha yüksek atomik kütlesinden (atom numarası 74 g / mol’dür) kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, PMA’daki en ağır element olan molibden, 42 g / mol’lük bir atom numarasına sahiptir. Hem atomik kütle hem de numune yoğunluğu, numune kalınlığı42’ye ek olarak X-ışını zayıflamasının altında yatmaktadır. Numune boyutlarını artırarak X-ışını yolu uzunluğunu artıran X-ışını zayıflaması, artan numune yoğunluğuna karşı daha hassas hale gelir. Bu nedenle, aşırı zayıflama riskini azaltmak ve insan benzeri ölçekteki kalpler için dinamik görüntü kontrastı aralığını optimize etmek için düşük yoğunluklu PMA kontrast maddesi seçildi. Daha fazla kanıt, PMA’nın difüzyon yüklemesinin, kalp dokusundaki daha büyük molekül PTA’dan daha homojen boyama sağladığını göstermiştir43.
Kontrast madde verme yöntemi, kalp dokusundaki kontrast madde dağılımının homojenliğini etkiler (Şekil 3). Etanol dehidrate kalpte kontrast maddelerin perfüzyonu, değişken vasküler direnç nedeniyle PMA’nın yamalı arka plan boyama seviyelerini gösterdi. Hava ile kurutulmuş kalpte, kas laminer yapısı, kas laminer ayrımını artıran numune kuruma işlemi ile vurgulanır. Bu sonuçta, difüzyon bazlı kontrast madde yüklemesi için dokunun genel geçirgenliğini arttırdı. Sonuç olarak, hava kuruması dokuyu kolaylaştırdı: laminer ve laminar iç seviyelerde hava kontrastı (Şekil 4). Ayrıca, difüzyon yüklemesi vakum altında uygulama ile daha da kolaylaştırılabilir. Ayrıca, kurutulmamış numunelerin doku büzülmesinin kontrast madde konsantrasyonuna bağlı olduğu gösterilmiştir40. Bununla birlikte, numunenin hava kurutmayla önceden morfolojik stabilizasyonu, doku büzülme etkilerini inhibe eder29.
Tüm organların yüksek çözünürlüklü mikroBT görüntüleri doğal olarak büyük veri hacimleri üretir. Tomografik görüntüleme tekniklerinin doğası, bilgisayar işleme ve bellek yükünü hafifleten dilim bazında görselleştirme ve görüntü işlemeyi mümkün kılar. Bununla birlikte, üç boyutlu görüntü yığınlarını görselleştirmek için, örneğin, örnek hacimlerini üç boyutlu gösterimlerde işlemek için, önerilen minimum bilgisayar özellikleri 128 GB RAM ve 3 GHz işlemci hızıdır.
Kardiyak alanda mikroBT görüntülemenin ortaya çıkması, translasyonel çalışmalar ve klinik validasyon için sayısız avantaj sağlamaktadır. Üç boyutlu ve mikrometrik görüntülemenin avantajları, ST elevasyonlu miyokard iskemisi hastalarının trombotik yükünün belirlenmesinde uygulamaları göstermiştir44,45. Yapısal kalp hastalığı hastalarında potansiyel aritmi kaynaklarının haritalandırılması, büyük ölçüde fibrotik skar dokusunun dağılımının belirlenmesine ve hayatta kalan miyokardın iç içe geçmiş izlerinin lokalize edilmesine bağlıdır. Ventriküler aritmilerin tanısında ikinci basamak yaklaşımlarda manyetik rezonans görüntüleme46 kullanılmaktadır. Yoğun fibrozisi sağlam bir şekilde lokalize edebilir, ancak düşük çözünürlüklü morfolojik karakterizasyon ile sınırlıdır ve fibrotik lezyonların mikroyapısal yeniden şekillenmesi ve diffüz dağılımları hakkında sınırlı bir fikir verir47. Skar dağılımı ve karakterizasyonunun yüksek çözünürlüklü incelenmesi, kardiyak yapısal yeniden yapılanma ve kalp yetmezliği gelişme riski hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Özellikle, temel araştırma çalışmaları veya ölüm sonrası araştırmalar, kardiyak aritminin elektriksel haritalanması için doğrulayıcı yapısal görüntülerden yararlanacaktır.
Sonuç olarak, HMDS tedavisi ve hava kurutma ile güçlendirilmiş kalpler daha sonra hücre dışı bileşenlerin X-ışını zayıflamasını arttırmak için bir X-ışını kontrast maddesi ile boyanabilir. Spesifik olarak, sağlıklı miyokardda, PMA birikimi epitelde, kapak dokusunda ve bağ dokusu tarafından kaplanmış ventriküler iletim sisteminin bölmelerinde meydana gelir ve X-ışını zayıflamasının artmasına neden olur. Ayrıca, yapısal olarak hastalıklı miyokardda, artmış kontrast fibroz için daha seçiciydi.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Araştırma Ajansı (ANR), Hibe referansı ANR-10-IAHU-04 ve Leducq Vakfı (RHYTHM ağı) tarafından yönetilen “Geleceğin Yatırımları” programının bir parçası olarak Fransız Hükümeti’nden finansal destek aldı ve ayrıca Hibe referansı ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], Avrupa Kardiyovasküler Hastalıklar Araştırma Alanı’ndan (ERA-CVD) fon, hibe referansı H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] ve Fransız Bölgesi Nouvelle Aquitaine’den fon sağladı. hibe referansları 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 ve ANR-19-ECVD-0006-01.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |