ここでは、コラーゲン選択的コントラスト増強を有する健康で病理学的な大型哺乳類心臓全体の高解像度マイクロコンピュータ断層撮影画像を得るためのプロトコルを提示する。
構造リモデリングは、心臓に課せられた慢性的な病理学的ストレスの一般的な結果である。罹患組織の建築的および構成的特性を理解することは、不整脈行動との相互作用を決定するために重要である。臨床分解能を下回るマイクロスケールの組織リモデリングは、致死的不整脈の重要な原因として浮上しており、若年成人において高い有病率を有する。大型哺乳類の心臓全体などの前臨床モデルに対して十分なマイクロスケール解像度で高い画像コントラストを得ることには、課題が残っています。さらに、3次元高解像度画像化のための組織組成選択的コントラスト増強は依然として欠けている。マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた非破壊イメージングは、高解像度イメージングに有望であることを示しています。その目的は、大規模な生物学的サンプルにおけるX線過減衰の苦しみを緩和することでした。心臓は、健康なブタ(N = 2)、およびヒツジ(N = 2)から抽出され、慢性心筋梗塞および線維性瘢痕形成を誘発するか、または慢性心房細動を誘発した。摘出した心臓を、カルシウムイオン消光剤および血管拡張剤を添加した生理食塩水、段階的脱水中のエタノール、および真空下でのヘキサメチルジシリザンで灌流した。後者は、1週間の風乾中に心臓構造を強化した。コラーゲン優勢組織は、X線造影増強剤、リンモリブデン酸によって選択的に結合した。組織立体構造は空気中で安定しており、長期間のマイクロコンピュータ断層撮影で高解像度(等方性20.7μm)画像を得ることができました。 拡散による最適な造影剤装填は、健康なブタ心室における上皮層および心内膜下プルキンエ線維の選択的コントラスト増強を示した。心房細動(AF)心臓は、心房の後壁および付属器における増強されたコントラスト蓄積を示し、コラーゲン含有量の増加に起因する。心筋梗塞心臓は、心臓線維症の領域において選択的にコントラストの増加を示し、これは、織り交ぜられた生き残った心筋筋線維の同定を可能にした。コントラスト増強空気乾燥組織調製物は、無傷の大型哺乳動物心臓のマイクロスケールイメージングおよび基礎疾患成分の選択的コントラスト増強を可能にした。
構造的心疾患は、世界中の心臓関連死亡率の大部分を占めています1.心臓構造のリモデリングは、心筋環境および間質空間に影響を及ぼす。心臓の電気的および機械的機能の両方が筋細胞組織に依存するので、破壊は耐え難い心臓不整脈、血液ポンプ作用の障害、および心不全2,3,4,5,6,7,8,9をもたらし得る。構造的心臓病に対する治癒的治療法の開発は、疾患の有病率をはるかに上回っています2,5。このように、構造的心臓疾患の前臨床モデルの数の増加は、心臓不整脈の解剖学的形態学的プロファイルおよび結果として生じる病因をよりよく理解するために出現している10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,22,23。構造疾患スペクトル全体にわたって観察されるのは、間質性線維症の上方制御であり、より一般的には虚血関連症例において、線維症および脂肪組織による心筋置換である18。病理学的細胞外成分の形態学的理解は、不整脈の潜在的な基質の同定を可能にすることができる。この疾患の分布および程度は、不整脈誘発リスクの強力な指標を提供する。しかし、無傷の心臓にマクロスケールとマイクロスケールを統合することによって疾患プロファイルを包括的に画像化するには、依然として課題が残っています。
X線に基づくマイクロコンピュータ断層撮影(microCT)は、造影剤を使用して軟部生体組織の微細構造を調査するための強力なツールとして浮上している。非常に詳細な解剖学的地図は、小型げっ歯類24、25、26および大型哺乳類の心臓からの小型解剖サンプル27、28から得られた。しかし、大型哺乳類の心臓の全器官レベルでのイメージングは、従来の組織調製技術を用いてX線光子が減衰する過剰な経路長を提示する。これには、組織にコントラスト負荷をかけ、取得中にサンプルを造影剤溶媒に浸漬することが含まれます。サンプルサイズと分解能を大きくすると、合計集録時間が長くなります。したがって、組織の安定性は、使用可能な画像再構成にとって極めて重要となり、乾燥に起因する組織の変形を防止しなければならないことを意味する。しかしながら、浸漬流体の使用には、(i)全体的なバックグラウンドシグナル強度が無視できない程度になり、(ii)組織結合コントラスト分子の希釈を促進するという欠点がある。これらの要因の両方が、画像のコントラストを低下させる原因となります。
この研究は、バックグラウンド光子減衰を緩和し、コントラスト増強剤によってもたらされるダイナミックレンジを最適化するための新規組織処理パイプラインを詳述する。組織変形を制限するために化学組織補強を伴う組織空気乾燥アプローチを使用することが示唆される29。したがって、組織サンプルは、長時間の取得のために空気中で安定に保たれ、浸漬流体からのバックグラウンドの寄与を省略することができます。この方法論パイプラインは、(i)ブタの心臓全体を使用して最適化された包括的な組織処理およびイメージングプロトコルを提供する。(ii)コントラスト濃度および負荷技術の評価、ならびに(iii)羊の心臓における心房細動および心筋梗塞の2つの異なる慢性疾患モデルにおけるこのパイプラインの適用。慢性疾患モデルの開発は、各慢性心疾患モデルについて他の場所で記載されており、経皮的冠動脈塞栓術13 および自立性心房細動30により誘導される心筋梗塞。
大型組織調製のための詳細なプロトコールは、その後の高解像度構造イメージングのために大型哺乳類の心臓全体を使用して設定されています。空気乾燥アプローチは、バックグラウンドX線減衰の影響を除去し、組織を最大限に最適化する:バックグラウンドコントラスト29。このアプローチを使用して、直径7.2cmまでのサンプルにわたる体積イメージングのために20μmの範囲の等方性分解能が達成された。しかしながら軟部組織のMicroCTは、典型的には、microCTシステム34のX線吸収および感度を改善するために非特異的造影剤の使用に依存する。X線造影剤は全体的なX線減衰および軟部組織イメージングの増強を改善するが、生化学的組成に基づく組織構成成分の分離は依然として困難である。しかし、実験室の設定で一般的なX線造影剤と組み合わせて空気乾燥心臓を使用して、PMAは、細胞外成分を選択的に染色することが観察された。慢性疾患における健康な心筋および病理学的構造リモデリングに関連する結合組織が増強された。
生物学的組織を風乾するプロセスには、サンプルの変形に抵抗するための介入が必要です。電子顕微鏡用のサンプル調製にも同様の要件があります。典型的には、臨界点乾燥法が採用され、これは、組織浸漬媒体、温度、および圧力のバランスを使用して、蒸発時に分子レベルでの変形を引き起こす組織の液体含有量の表面張力を排除する35。このアプローチでは、サンプルの含水量を液体二酸化炭素で均一に置換する必要があり、小型で拡散しやすいサンプルでより信頼性が高くなります。あるいは、組織の構造的完全性を改善し、風乾することができ、すなわち、蒸発相をより長い期間にわたって適用して、全体的な変形を低減することができる。分子HMDSはシリル化を受けてシリコーンベースの足場を形成し、組織試料36の分子組織を補強および安定化する。蒸発は、環境からの循環気流を制限することによってさらに延長され、また、特に試料表面と壁内層との間の不均一な蒸発を回避する。
多数の造影剤が、軟部組織のマイクロCT画像化のために以前に使用されてきた。最も一般的なのはヨウ素、リンタングステン酸(PTA)およびPMAである。ヨウ素は特に、より高い拡散速度34、37、38のために採用されている。それにもかかわらず、ヨウ素はHMDS試薬36のシリル化のための触媒として作用する。触媒反応は攻撃的で発熱性であり、試料の破壊のリスクが高く、試料の不完全な乾燥のために残留HMDSが残存する場合、安全性のリスクが高い。エタノールに溶解したPTAとPMAの両方をHMDSと組み合わせて安全に使用することができます。PTAおよびPMAは、ヨウ素染色と比較して、非石灰化椎間板における微細構造のより大きな分解能を提供することが示されている38。哺乳動物試料のマイクロCT画像化において、PTAおよびPMAは、マウス胚39、マウス心血管系37、ウサギの筋肉および脳40、およびブタ静脈41の染色に用いられてきた。PTAはPMAよりも溶液中の分子量および密度が高い。これは、PTAの主要な減衰元素であるタングステン(原子番号は74g / mol)の原子質量が高いことが一因です。対照的に、PMAの中で最も重い元素であるモリブデンは、42g / molの原子番号を有する。原子質量および試料密度の両方が、試料厚さ42に加えて、X線減衰の根底にある。サンプルサイズを大きくしてX線パス長を長くすると、X線減衰はサンプル密度の増加に対してより敏感になります。したがって、低密度PMA造影剤は、過減衰のリスクを低減し、ヒトのようなスケールの心臓の画像コントラストのダイナミックレンジを最適化するために選択された。さらなる証拠は、PMAの拡散負荷が心臓組織におけるより大きな分子PTAに対するよりも均質な染色を与えることを示している43。
造影剤送達の方法は、心臓組織における造影剤分布の均一性に影響を及ぼす(図3)。エタノール脱水心臓における造影剤の灌流は、可変血管抵抗に起因するPMAの斑状バックグラウンド染色レベルを示した。風乾性心臓では、試料乾燥プロセスによって筋層状構造が強調され、筋層間分離が増加する。これは最終的に、拡散ベースの造影剤装填のための組織の全体的な透過性を改善した。その結果、空気乾燥が容易な組織:層流レベルおよび層内レベルでの空気コントラスト(図4)。さらに、拡散負荷は、真空下での適用によってさらに促進することができる。さらに、非乾燥サンプルの組織収縮が造影剤濃度40に依存することが示されている。しかしながら、風乾による標本の事前形態安定化は、組織収縮を抑制する効果29である。
臓器全体の高解像度マイクロCT画像は、本質的に大量のデータを生成します。断層イメージング技術の性質上、スライス単位での可視化と画像処理が可能となり、コンピュータ処理やメモリの負担が軽減されます。しかし、3次元画像スタックを視覚化する場合、例えば試料体積を3次元表現でレンダリングする場合、推奨される最小コンピュータ仕様は128 GB RAMと3GHzのプロセッサ速度です。ソリッドステートハードドライブはデータ転送も大幅に改善されました。
心臓分野におけるマイクロCTイメージングの出現は、トランスレーショナル研究および臨床検証に多くの利点をもたらします。その三次元およびマイクロメトリック画像化の利点は、ST上昇心筋虚血患者44、45の血栓性負担を決定する際の用途を既に示している。構造的心疾患患者における不整脈の潜在的な原因のマッピングは、線維性瘢痕組織の分布を決定し、生存している心筋の織り交ぜられた痕跡を局在化させることに大きく依存する。心室性不整脈の診断のための第2のアプローチは、磁気共鳴画像化46を利用する。これは、緻密な線維症を頑健に局在化することができるが、低分解能の形態学的特徴付けに限定され、線維性病変の微細構造リモデリングおよびびまん性分布に関する限られた洞察を提供する47。瘢痕分布と特性評価の高解像度検査は、心臓構造リモデリングと心不全発症リスクの理解を向上させる大きな可能性を秘めています。特に、基礎調査研究または死後調査は、心臓不整脈の電気的マッピングのための補強構造画像の恩恵を受けるであろう。
結論として、HMDS処理および空気乾燥で強化された心臓は、その後、細胞外成分のX線減衰を高めるためにX線造影剤で染色することができる。具体的には、健康な心筋において、PMA蓄積は、結合組織によって覆われた上皮、弁組織、および心室伝導系の区画で起こり、X線減衰の増強をもたらした。さらに、構造的に罹患した心筋において、増強されたコントラストは線維症に対してさらに選択的であった。
The authors have nothing to disclose.
本研究は、国立研究機関(ANR)、グラントリファレンスANR-10-IAHU-04、およびLeducq財団(RHYTHMネットワーク)が管理する「未来への投資」プログラムの一環として、フランス政府から資金援助を受け、グラントリファレンスANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC]、欧州心血管疾患研究領域(ERA-CVD)、グラントリファレンスH2020-HCO-2015_680969 [MultiFib]およびフランス地域ヌーベルアキテーヌからの資金提供を受け、 助成金参照 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 および ANR-19-ECVD-0006-01.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |