Qui, presentiamo un protocollo per ottenere immagini di micro tomografia computerizzata ad alta risoluzione di cuori interi di mammiferi sani e patologici con miglioramento del contrasto selettivo del collagene.
Il rimodellamento strutturale è una conseguenza comune degli stress patologici cronici imposti al cuore. Comprendere le proprietà architettoniche e compositive del tessuto malato è fondamentale per determinare le loro interazioni con il comportamento aritmico. Il rimodellamento tissutale su microscala, al di sotto della risoluzione clinica, sta emergendo come un’importante fonte di aritmia letale, con alta prevalenza nei giovani adulti. Rimangono sfide nell’ottenere un elevato contrasto di imaging a una risoluzione sufficiente su microscala per i modelli preclinici, come i grandi cuori interi dei mammiferi. Inoltre, manca ancora il miglioramento selettivo del contrasto della composizione tissutale per l’imaging tridimensionale ad alta risoluzione. L’imaging non distruttivo che utilizza la tomografia micro-computerizzata è promettente per l’imaging ad alta risoluzione. L’obiettivo era quello di alleviare la sofferenza da raggi X rispetto all’attenuazione in grandi campioni biologici. I cuori sono stati estratti da suini sani (N = 2) e pecore (N = 2) con infarto miocardico cronico indotto e formazione di cicatrici fibrotiche o fibrillazione atriale cronica indotta. I cuori asportati sono stati perfusi con: una soluzione salina integrata con un agente dissetante di ioni calcio e un vasodilatatore, etanolo nella disidratazione seriale e esametildilisilizane sotto vuoto. Quest’ultimo ha rinforzato la struttura del cuore durante l’essiccazione all’aria per 1 settimana. Il tessuto dominante del collagene è stato selettivamente legato da un agente di contrasto a raggi X, l’acido fosfomolibdico. La conformazione tissutale era stabile nell’aria, consentendo acquisizioni di tomografia microcalcografica di lunga durata per ottenere immagini ad alta risoluzione (isotrope 20,7 μm). Il carico ottimale dell’agente di contrasto per diffusione ha mostrato un miglioramento selettivo del contrasto dello strato epiteliale e delle fibre di Purkinje sub-endocardiche nei ventricoli di maiale sani. I cuori di fibrillazione atriale (AF) hanno mostrato un maggiore accumulo di contrasto nelle pareti posteriori e nelle appendici degli atri, attribuito a un maggiore contenuto di collagene. I cuori da infarto miocardico hanno mostrato un aumento selettivo del contrasto nelle regioni della fibrosi cardiaca, che ha permesso l’identificazione delle fibre muscolari miocardiche sopravvissute intrecciate. I preparati di tessuto essiccato all’aria con contrasto hanno consentito l’imaging su microscala del cuore di mammifero di grandi dimensioni intatto e il miglioramento selettivo del contrasto dei costituenti della malattia di base.
Le malattie cardiache strutturali rappresentano la maggior parte della mortalità correlata al cuore in tutto il mondo1. Il rimodellamento della struttura cardiaca influenza l’ambiente miocardico e lo spazio interstiziale. Poiché sia la funzione elettrica che meccanica cardiaca dipendono dall’organizzazione dei miociti, l’interruzione può portare ad aritmia cardiaca intollerabile, azioni di pompaggio del sangue compromesse e insufficienza cardiaca 2,3,4,5,6,7,8,9. Gli sviluppi delle terapie curative per le malattie cardiache strutturali sono di gran lunga superati dalla prevalenza della malattia 2,5. Pertanto, sta emergendo un numero crescente di modelli preclinici di malattie cardiache strutturali per comprendere meglio i profili anatomo-morfologici e la conseguente patogenesi delle aritmie cardiache 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Osservata in tutto lo spettro delle malattie strutturali è la sovraregolazione della fibrosi interstiziale e, più comunemente nei casi correlati all’ischemia, la sostituzione miocardica con fibrosi e tessuto adiposo18. La comprensione morfologica dei componenti extracellulari patologici può consentire l’identificazione di potenziali substrati di aritmia. La distribuzione e l’estensione della malattia forniscono forti indicatori di rischio aritmogeno. Tuttavia, rimangono sfide per l’immagine completa dei profili di malattia integrando macro e microscale nel cuore intatto.
La tomografia micro-computerizzata (microCT), basata sui raggi X, sta emergendo come un potente strumento per interrogare la microstruttura dei tessuti biologici molli utilizzando agenti di contrasto. Sono state ottenute mappe anatomiche altamente dettagliate per cuori di piccoli roditori 24,25,26 e piccoli campioni sezionati da grandi cuori di mammiferi 27,28. Tuttavia, l’imaging a livello di intero organo di grandi cuori di mammiferi presenta lunghezze di percorso eccessive su cui i fotoni a raggi X vengono attenuati utilizzando tecniche convenzionali di preparazione dei tessuti. Ciò comporta il caricamento del tessuto a contrasto e l’immersione del campione in un solvente mezzo di contrasto durante l’acquisizione. L’aumento della dimensione e della risoluzione del campione impone un prolungamento del tempo totale di acquisizione. Pertanto, la stabilità dei tessuti diventa cruciale per la ricostruzione dell’immagine utilizzabile, il che significa che la deformazione dei tessuti derivante dall’essiccazione deve essere prevenuta. L’uso di un fluido ad immersione, tuttavia, presenta degli svantaggi: (i) l’intensità complessiva del segnale di fondo diventa non trascurabile e (ii) promuove la diluizione delle molecole di contrasto legate ai tessuti. Entrambi questi fattori contribuiscono a ridurre il contrasto dell’immagine.
Questo studio descrive in dettaglio una nuova pipeline di elaborazione dei tessuti per alleviare l’attenuazione dei fotoni di fondo e ottimizzare la gamma dinamica offerta dagli agenti di miglioramento del contrasto. Si consiglia di utilizzare un approccio di essiccazione all’aria dei tessuti con rinforzo chimico del tessuto per limitare la deformazione del tessuto29. Pertanto i campioni di tessuto possono rimanere stabili nell’aria per lunghe acquisizioni e omettere contributi di fondo dai fluidi ad immersione. Questa pipeline metodologica fornisce: (i) un protocollo completo di elaborazione e imaging dei tessuti ottimizzato utilizzando cuori di maiale interi; (ii) una valutazione della concentrazione di contrasto e delle tecniche di carico e, (iii) l’applicazione di questa pipeline in due distinti modelli di malattia cronica di fibrillazione atriale e infarto miocardico nei cuori di pecora. Lo sviluppo dei modelli di malattia cronica è stato descritto altrove per ciascun modello di malattia cardiaca cronica, infarto miocardico indotto da embolizzazione coronarica percutanea13 e fibrillazione atriale autosufficiente30.
Un protocollo dettagliato per le preparazioni di tessuti di grandi dimensioni viene definito utilizzando cuori interi di grandi mammiferi per la successiva imaging strutturale ad alta risoluzione. Un approccio di essiccazione all’aria ha rimosso le influenze dell’attenuazione dei raggi X di fondo e ha ottimizzato al massimo il tessuto: contrasto di fondo29. Utilizzando questo approccio, è stata raggiunta una risoluzione isotropa nell’intervallo di 20 μm per l’imaging volumetrico su campioni fino a 7,2 cm di diametro. La microCT dei tessuti molli, tuttavia, si basa tipicamente sull’uso di agenti di contrasto non specifici per migliorare l’assorbimento dei raggi X e la sensibilità dei sistemi microCT34. Sebbene gli agenti di contrasto a raggi X migliorino l’attenuazione complessiva dei raggi X e il miglioramento dell’imaging dei tessuti molli, la separazione dei costituenti tissutali in base alla composizione biochimica rimane difficile. Tuttavia, è stato osservato che l’uso di cuori essiccati all’aria in combinazione con un comune agente di contrasto a raggi X in laboratorio, PMA, ha colorato selettivamente i componenti extracellulari. Il tessuto connettivo associato a miocardio sano e rimodellamento strutturale patologico nelle malattie croniche è stato migliorato.
Il processo di essiccazione all’aria del tessuto biologico richiede un intervento per resistere alla deformazione del campione. La preparazione del campione per la microscopia elettronica ha requisiti simili. Tipicamente, viene utilizzato un metodo di essiccazione del punto critico, che utilizza un equilibrio di mezzo di immersione tissutale, temperatura e pressione per eliminare la tensione superficiale del contenuto liquido del tessuto, che causa la deformazione a livello molecolare dopo l’evaporazione35. Questo approccio richiede una sostituzione uniforme del contenuto di acqua del campione con anidride carbonica liquida, che è più affidabile in campioni piccoli e facilmente diffusibili. In alternativa, l’integrità strutturale del tessuto può essere migliorata e l’essiccazione all’aria, cioè la fase di evaporazione può essere applicata su un periodo più lungo per ridurre la deformazione complessiva. La molecola HMDS subisce la sililazione per formare uno scaffold a base di silicone per rafforzare e stabilizzare l’organizzazione molecolare del campione di tessuto36. L’evaporazione viene ulteriormente prolungata limitando le correnti d’aria circolanti dall’ambiente, anche per evitare l’evaporazione disomogenea, in particolare tra la superficie del campione e gli strati intramurali.
Numerosi agenti di contrasto sono stati precedentemente utilizzati per l’imaging microCT dei tessuti molli. I più comuni sono iodio, acido fosfotungstico (PTA) e PMA. Lo iodio in particolare è stato impiegato a causa di un più alto tasso di diffusione 34,37,38. Tuttavia, lo iodio agisce come catalizzatore per la sililazione del reagente HMDS36. La reazione catalizzata è aggressiva ed esotermica, con un alto rischio di distruzione del campione e rischio per la sicurezza se l’HMDS residuo rimane a causa di un’essiccazione incompleta del campione. Sia il PTA che il PMA disciolti in etanolo possono essere tranquillamente utilizzati in combinazione con HMDS. PTA e PMA hanno dimostrato di fornire un maggiore potere risolutivo delle strutture fini nei dischi intervertebrali non mineralizzati rispetto alla colorazione dello iodio38. Nell’imaging microCT di campioni di mammiferi, PTA e PMA sono stati utilizzati per la colorazione di embrioni di topo39, sistema cardiovascolare di topo37, muscolo di coniglio e cervello40 e vene suine41. Il PTA ha una massa molecolare e una densità in soluzione più elevate rispetto alla PMA. Ciò è in parte dovuto a una maggiore massa atomica di tungsteno (il numero atomico è 74 g / mol), il principale elemento attenuante nel PTA. In confronto, l’elemento più pesante in PMA, il molibdeno, ha un numero atomico di 42 g / mol. Sia la massa atomica che la densità del campione sono alla base dell’attenuazione dei raggi X, oltre allo spessore del campione42. Aumentando la lunghezza del percorso dei raggi X aumentando le dimensioni del campione, l’attenuazione dei raggi X diventa più sensibile all’aumento della densità del campione. Pertanto, l’agente di contrasto PMA a densità inferiore è stato selezionato per ridurre il rischio di eccessiva attenuazione e per ottimizzare la gamma dinamica del contrasto dell’immagine per i cuori di scala umana. Ulteriori prove hanno dimostrato che il carico di diffusione della PMA fornisce una colorazione più omogenea rispetto alla molecola più grande PTA nel tessuto cardiaco43.
Il metodo di somministrazione dell’agente di contrasto influisce sull’uniformità della distribuzione dell’agente di contrasto nel tessuto cardiaco (Figura 3). La perfusione di agenti di contrasto nel cuore disidratato con etanolo ha mostrato livelli di colorazione di fondo irregolare di PMA a causa della resistenza vascolare variabile. Nel cuore essiccato all’aria, la struttura laminare muscolare è enfatizzata dal processo di essiccazione del campione, aumentando la separazione laminare muscolare. Ciò alla fine ha migliorato la permeabilità complessiva del tessuto per il carico di agenti di contrasto basati sulla diffusione. Di conseguenza, l’essiccazione all’aria ha facilitato il tessuto: contrasto dell’aria a livello laminare e intralaminare (Figura 4). Inoltre, il carico di diffusione può essere ulteriormente facilitato dall’applicazione sotto vuoto. È stato inoltre dimostrato che il restringimento tissutale dei campioni non essiccati dipende dalla concentrazione di mezzo di contrasto40. Tuttavia, la precedente stabilizzazione morfologica del campione mediante essiccazione all’aria inibisce gli effetti di restringimento dei tessuti29.
Le immagini microCT ad alta risoluzione di interi organi producono intrinsecamente grandi volumi di dati. La natura delle tecniche di imaging tomografico consente la visualizzazione e la gestione delle immagini su base slice-by-slice, il che facilita l’elaborazione del computer e il carico di memoria. Tuttavia, per visualizzare stack di immagini tridimensionali, ad esempio per eseguire il rendering di volumi di campioni in rappresentazioni tridimensionali, le specifiche minime consigliate per il computer sono 128 GB di RAM e una velocità del processore di 3 GHz. Anche i dischi rigidi a stato solido hanno notevolmente migliorato il trasferimento dei dati.
L’emergere dell’imaging microCT in campo cardiaco offre numerosi vantaggi per gli studi traslazionali e la convalida clinica. I vantaggi della sua imaging tridimensionale e micrometrico hanno già mostrato applicazioni nel determinare il carico trombotico dei pazienti con ischemia miocardica con elevazione ST 44,45. La mappatura delle potenziali fonti di aritmia nei pazienti con cardiopatia strutturale dipende in gran parte dalla determinazione della distribuzione del tessuto cicatriziale fibrotico e dalla localizzazione delle tracce intrecciate del miocardio sopravvissuto. Gli approcci di seconda linea per la diagnosi delle aritmie ventricolari utilizzano la risonanza magnetica46. Può localizzare in modo robusto la fibrosi densa, ma è limitato alla caratterizzazione morfologica a bassa risoluzione e offre una visione limitata del rimodellamento microstrutturale e delle distribuzioni diffuse delle lesioni fibrotiche47. L’esame ad alta risoluzione della distribuzione e della caratterizzazione delle cicatrici ha un vasto potenziale per migliorare la nostra comprensione del rimodellamento strutturale cardiaco e del rischio di sviluppare insufficienza cardiaca. In particolare, studi di ricerca fondamentale o indagini post-mortem trarranno beneficio da immagini strutturali corroboranti per la mappatura elettrica dell’aritmia cardiaca.
In conclusione, i cuori rinforzati con trattamento HMDS e asciugatura all’aria possono successivamente essere colorati con un mezzo di contrasto a raggi X per migliorare l’attenuazione a raggi X dei componenti extracellulari. In particolare, nel miocardio sano, l’accumulo di PMA si verifica nell’epitelio, nel tessuto valvolare e nei compartimenti del sistema di conduzione ventricolare rivestiti dal tessuto connettivo con conseguente attenuazione dei raggi X migliorata. Inoltre, nel miocardio strutturalmente malato, il contrasto migliorato era ulteriormente selettivo per la fibrosi.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio ha ricevuto un sostegno finanziario dal governo francese nell’ambito del programma “Investimenti del futuro” gestito dall’Agenzia nazionale per la ricerca (ANR), dal riferimento di sovvenzione ANR-10-IAHU-04 e dalla Fondazione Leducq (rete RHYTHM), nonché dal riferimento di sovvenzione ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], finanziamenti dello Spazio europeo della ricerca sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD), riferimento di sovvenzione H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] e finanziamenti della regione francese Nouvelle Aquitaine, riferimenti di sovvenzione 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 e ANR-19-ECVD-0006-01.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |