Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des images de micro-tomodensitométrie à haute résolution de cœurs entiers de grands mammifères sains et pathologiques avec une amélioration du contraste sélectif du collagène.
Le remodelage structurel est une conséquence courante des stress pathologiques chroniques imposés au cœur. Comprendre les propriétés architecturales et compositionnelles des tissus malades est essentiel pour déterminer leurs interactions avec le comportement arythmique. Le remodelage des tissus à l’échelle microscopique, en dessous de la résolution clinique, émerge comme une source importante d’arythmie létale, avec une prévalence élevée chez les jeunes adultes. Il reste des défis à relever pour obtenir un contraste d’imagerie élevé à une résolution microscopique suffisante pour les modèles précliniques, tels que les cœurs entiers de grands mammifères. De plus, l’amélioration sélective du contraste de la composition tissulaire pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution fait toujours défaut. L’imagerie non destructive utilisant la micro-tomodensitométrie est prometteuse pour l’imagerie haute résolution. L’objectif était de soulager la souffrance due à l’atténuation par rayons X dans de grands échantillons biologiques. Les cœurs ont été extraits de porcs sains (N = 2) et de moutons (N = 2) présentant soit un infarctus chronique du myocarde et une formation de cicatrices fibrotiques, soit une fibrillation auriculaire chronique induite. Les cœurs excisés ont été perfusés avec: une solution saline complétée par un agent de trempe des ions calcium et un vasodilatateur, de l’éthanol en déshydratation en série et de l’hexaméthyldisilizane sous vide. Ce dernier a renforcé la structure du cœur lors du séchage à l’air pendant 1 semaine. Les tissus à dominante collagène ont été liés sélectivement par un agent améliorant le contraste des rayons X, l’acide phosphomolybdique. La conformation tissulaire était stable dans l’air, ce qui a permis des acquisitions de micro-tomographie de longue durée pour obtenir des images à haute résolution (isotropes de 20,7 μm). La charge optimale en agent de contraste par diffusion a montré une amélioration sélective du contraste de la couche épithéliale et des fibres sous-endocardiques de Purkinje dans des ventricules de porc sains. Les cœurs de fibrillation auriculaire (FA) ont montré une accumulation de contraste accrue dans les parois postérieures et les appendices des oreillettes, attribuée à une plus grande teneur en collagène. Les cœurs d’infarctus du myocarde ont montré un contraste accru de manière sélective dans les régions de fibrose cardiaque, ce qui a permis d’identifier les fibres musculaires myocardiques survivantes entrelacées. Les préparations de tissus séchés à l’air amélioré par contraste ont permis l’imagerie à micro-échelle du cœur intact des grands mammifères et l’amélioration sélective du contraste des constituants sous-jacents de la maladie.
Les cardiopathies structurelles représentent la majorité de la mortalité cardiaque dans le monde1. Le remodelage de la structure cardiaque influence l’environnement myocardique et l’espace interstitiel. Étant donné que la fonction électrique et mécanique cardiaque dépend de l’organisation des myocytes, la perturbation peut entraîner une arythmie cardiaque intolérable, des actions de pompage du sang altérées et une insuffisance cardiaque 2,3,4,5,6,7,8,9. Les développements de thérapies curatives pour les maladies cardiaques structurelles sont largement compensés par la prévalence de la maladie 2,5. En tant que tel, un nombre croissant de modèles précliniques de maladies cardiaques structurelles émergent pour mieux comprendre les profils anatomo-morphologiques et la pathogenèse résultante des arythmies cardiaques 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Dans l’ensemble du spectre des maladies structurelles, on observe une régulation à la hausse de la fibrose interstitielle et, plus fréquemment dans les cas liés à l’ischémie, un remplacement du myocarde par une fibrose et un tissu adipeux18. La compréhension morphologique des composants extracellulaires pathologiques peut permettre l’identification de substrats potentiels de l’arythmie. La distribution et l’étendue de la maladie fournissent de solides indicateurs du risque arythmogène. Pourtant, il reste des défis à relever pour imager de manière exhaustive les profils de maladie en intégrant des macro et micro-échelles dans le cœur intact.
La micro-tomodensitométrie (microCT), basée sur les rayons X, émerge comme un outil puissant pour interroger la microstructure des tissus biologiques mous à l’aide d’agents de contraste. Des cartes anatomiques très détaillées ont été obtenues pour les cœurs de petits rongeurs 24,25,26 et de petits échantillons disséqués de cœurs de grands mammifères 27,28. Cependant, l’imagerie au niveau de l’ensemble des organes des cœurs de grands mammifères présente des longueurs de chemin excessives sur lesquelles les photons de rayons X sont atténués à l’aide de techniques conventionnelles de préparation des tissus. Cela implique de charger le tissu par contraste et d’immerger l’échantillon dans un solvant d’agent de contraste lors de l’acquisition. L’augmentation de la taille et de la résolution de l’échantillon impose une prolongation du temps d’acquisition total. Par conséquent, la stabilité des tissus devient cruciale pour la reconstruction d’images utilisables, ce qui signifie que la déformation tissulaire résultant du séchage doit être évitée. L’utilisation d’un fluide d’immersion présente cependant des inconvénients: (i) l’intensité globale du signal de fond devient non négligeable et (ii) favorise la dilution des molécules de contraste liées aux tissus. Ces deux facteurs contribuent à réduire le contraste de l’image.
Cette étude détaille un nouveau pipeline de traitement tissulaire pour atténuer l’atténuation des photons de fond et optimiser la plage dynamique offerte par les agents d’amélioration du contraste. Il est suggéré d’utiliser une approche de séchage à l’air des tissus avec renforcement chimique des tissus pour limiter la déformation destissus 29. Par conséquent, les échantillons de tissus peuvent rester stables dans l’air pour de longues acquisitions et omettre les contributions de fond des fluides d’immersion. Ce pipeline méthodologique fournit : (i) un protocole complet de traitement et d’imagerie des tissus optimisé à l’aide de cœurs de porc entiers ; (ii) une évaluation des techniques de concentration et de charge de contraste et, (iii) l’application de ce pipeline dans deux modèles distincts de maladies chroniques de fibrillation auriculaire et d’infarctus du myocarde dans les cœurs de moutons. Le développement des modèles de maladies chroniques a été décrit ailleurs pour chaque modèle de maladie cardiaque chronique, infarctus du myocarde induit par l’embolisation percutanée de l’artère coronaire13 et la fibrillation auriculaire auto-entretenue30.
Un protocole détaillé pour les préparations de gros tissus est établi en utilisant des cœurs entiers de grands mammifères pour l’imagerie structurelle à haute résolution ultérieure. Une approche de séchage à l’air a éliminé les influences de l’atténuation des rayons X de fond et optimisé au maximum les tissus: contraste de fond29. En utilisant cette approche, une résolution isotrope de l’ordre de 20 μm pour l’imagerie volumétrique sur des échantillons jusqu’à 7,2 cm de diamètre a été obtenue. Cependant, la microCT des tissus mous repose généralement sur l’utilisation d’agents de contraste non spécifiques pour améliorer l’absorption des rayons X et la sensibilité des systèmes microCT34. Bien que les agents de contraste aux rayons X améliorent l’atténuation globale des rayons X et l’amélioration de l’imagerie des tissus mous, la séparation des constituants tissulaires en fonction de la composition biochimique reste difficile. Cependant, il a été observé que l’utilisation de cœurs séchés à l’air en combinaison avec un agent de contraste à rayons X commun en laboratoire, le PMA, tachait sélectivement des composants extracellulaires. Le tissu conjonctif associé au myocarde sain et au remodelage structurel pathologique dans les maladies chroniques a été amélioré.
Le processus de séchage à l’air des tissus biologiques nécessite une intervention pour résister à la déformation de l’échantillon. La préparation d’échantillons pour la microscopie électronique a des exigences similaires. En règle générale, une méthode de séchage aux points critiques est utilisée, qui utilise un équilibre du milieu d’immersion tissulaire, de la température et de la pression pour éliminer la tension superficielle du contenu liquide du tissu, ce qui provoque une déformation au niveau moléculaire lors de l’évaporation35. Cette approche nécessite un remplacement uniforme de la teneur en eau de l’échantillon par du dioxyde de carbone liquide, qui est plus fiable dans les échantillons de petite taille et facilement diffusables. Alternativement, l’intégrité structurelle du tissu peut être améliorée et le séchage à l’air, c’est-à-dire la phase d’évaporation peut être appliqué sur une plus longue période pour réduire la déformation globale. La molécule HMDS subit une silylation pour former un échafaudage à base de silicone afin de renforcer et de stabiliser l’organisation moléculaire de l’échantillon de tissu36. L’évaporation est encore prolongée en limitant les courants d’air circulants de l’environnement, également pour éviter l’évaporation inhomogène, en particulier entre la surface de l’échantillon et les couches intra-muros.
De nombreux agents de contraste ont déjà été utilisés pour l’imagerie microCT des tissus mous. Les plus courants sont l’iode, l’acide phosphotungstique (PTA) et le PMA. L’iode en particulier a été utilisé en raison d’un taux de diffusion plus élevé 34,37,38. Néanmoins, l’iode agit comme un catalyseur pour la silylation du réactif HMDS36. La réaction catalysée est agressive et exothermique, avec un risque élevé de destruction de l’échantillon et un risque pour la sécurité s’il reste du HMDS résiduel en raison d’une dessiccation incomplète de l’échantillon. Le PTA et le PMA dissous dans l’éthanol peuvent être utilisés en toute sécurité en conjonction avec le HMDS. Il a été démontré que la PTA et la PMA fournissent un plus grand pouvoir de résolution des structures fines dans les disques intervertébraux non minéralisés par rapport à la coloration à l’iode38. Dans l’imagerie microCT d’échantillons de mammifères, la PTA et la PMA ont été utilisées pour colorer les embryonsde souris 39, le système cardiovasculairede souris 37, les muscles et le cerveaude lapin 40 et les veines porcines41. Le PTA a une masse moléculaire et une densité en solution plus élevées que le PMA. Cela est dû en partie à une masse atomique plus élevée de tungstène (le numéro atomique est de 74 g / mol), le principal élément atténuant de la PTA. En comparaison, l’élément le plus lourd du PMA, le molybdène, a un numéro atomique de 42 g/mol. La masse atomique et la densité de l’échantillon sous-tendent l’atténuation des rayons X, en plus de l’épaisseur de l’échantillon42. En augmentant la longueur du trajet des rayons X en augmentant la taille des échantillons, l’atténuation des rayons X devient plus sensible à l’augmentation de la densité de l’échantillon. Par conséquent, l’agent de contraste PMA de densité inférieure a été choisi pour réduire le risque de sur-atténuation et pour optimiser la plage dynamique du contraste d’image pour les cœurs à l’échelle humaine. D’autres preuves ont montré que la charge de diffusion de PMA donne une coloration plus homogène que pour la molécule plus grande PTA dans le tissu cardiaque43.
La méthode d’administration des agents de contraste a une incidence sur l’uniformité de la distribution des agents de contraste dans le tissu cardiaque (figure 3). La perfusion d’agents de contraste dans le cœur déshydraté à l’éthanol a montré des niveaux de coloration de fond inégaux de PMA en raison d’une résistance vasculaire variable. Dans le cœur séché à l’air, la structure laminaire musculaire est soulignée par le processus de dessiccation de l’échantillon, ce qui augmente la séparation laminaire musculaire. Cela a finalement amélioré la perméabilité globale du tissu pour la charge en agent de contraste basée sur la diffusion. Par conséquent, le séchage à l’air a facilité les tissus : contraste de l’air aux niveaux laminaire et intra-laminaire (Figure 4). De plus, la charge de diffusion peut être encore facilitée par une application sous vide. Il a également été démontré que le rétrécissement tissulaire des échantillons non séchés dépend de la concentration en agent de contraste40. Cependant, la stabilisation morphologique préalable de l’échantillon par séchage à l’air inhibe les effets de rétrécissement tissulaire29.
Les images microCT haute résolution d’organes entiers produisent intrinsèquement de grands volumes de données. La nature des techniques d’imagerie tomographique permet la visualisation et la gestion des images tranche par tranche, ce qui allège le traitement informatique et la charge de mémoire. Cependant, pour visualiser des piles d’images tridimensionnelles, par exemple, pour rendre des volumes d’échantillons dans des représentations tridimensionnelles, les spécifications minimales recommandées par l’ordinateur sont de 128 Go de RAM et d’une vitesse de processeur de 3 GHz. Les disques durs SSD ont également considérablement amélioré le transfert de données.
L’émergence de l’imagerie microCT dans le domaine cardiaque offre de nombreux avantages pour les études translationnelles et la validation clinique. Les avantages de son imagerie tridimensionnelle et micrométrique ont déjà montré des applications dans la détermination de la charge thrombotique des patients atteints d’ischémie myocardique d’élévation ST44,45. La cartographie des sources potentielles d’arythmie chez les patients atteints de maladies cardiaques structurelles dépend en grande partie de la détermination de la distribution du tissu cicatriciel fibrotique et de la localisation des traces entrelacées du myocarde survivant. Les approches de deuxième intention pour le diagnostic des arythmies ventriculaires utilisent l’imagerie par résonance magnétique46. Il peut localiser de manière robuste la fibrose dense, mais se limite à la caractérisation morphologique à basse résolution et offre un aperçu limité du remodelage microstructurel et des distributions diffuses des lésions fibrotiques47. L’examen à haute résolution de la distribution et de la caractérisation des cicatrices a un vaste potentiel pour améliorer notre compréhension du remodelage structurel cardiaque et du risque de développer une insuffisance cardiaque. En particulier, les études de recherche fondamentale ou les investigations post-mortem bénéficieront d’images structurelles corroborantes pour la cartographie électrique de l’arythmie cardiaque.
En conclusion, les cœurs renforcés par le traitement HMDS et le séchage à l’air peuvent ensuite être colorés avec un agent de contraste aux rayons X pour améliorer l’atténuation des composants extracellulaires aux rayons X. Plus précisément, dans le myocarde sain, l’accumulation de PMA se produit au niveau de l’épithélium, du tissu valvulaire et des compartiments du système de conduction ventriculaire gainés de tissu conjonctif, ce qui a entraîné une atténuation accrue des rayons X. De plus, dans le myocarde structurellement malade, l’amélioration du contraste était encore plus sélective pour la fibrose.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a reçu le soutien financier du gouvernement Français dans le cadre du programme « Investissements du futur » géré par l’Agence nationale de la recherche (ANR), la référence de subvention ANR-10-IAHU-04 et la Fondation Leducq (réseau RHYTHM), ainsi que la référence de subvention ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], le financement de l’Espace européen de recherche sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD), la référence de subvention H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] et le financement de la région Français Nouvelle Aquitaine, références de subvention 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 et ANR-19-ECVD-0006-01.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |