Antimikrobiyal Bileşiklerin Staphylococcus aureus Internalization ve Hücre İçi Etkinliğini İncelemek için Geliştirilmiş Enzim Koruma Tahlilleri
Summary
Bu protokol, Staphylococcus aureus içselleştirmesinin kapsamının ve insan konak hücre içinde hayatta kalma yeteneğinin yanı sıra antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğinin nasıl incelenerek incelenebilmesini tanımlamayı amaçlamaktadır.
Abstract
Staphylococcus aureus , ökaryot hücrelerine içselleşmesini tetiklemek ve farklı hücre altı bölmelerde hayatta kalmak için virülans faktörlerini ifade eder. Bu makalede, S. aureus içselleştirmesinin kapsamını ve profesyonel olmayan fagositik hücrelerde (NPPC’ ler) hücre içi sağkalımını ve antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğini incelemek için bir enzim koruma tahlili açıklanmaktadır. NPPC’ler% 100 birliğe ulaşana kadar çok kuyulu bir tabakta yetiştirilir. S. aureus kültürleri hücre kültürü ortamında bir gecede yetiştirilir. Bakteriyel süspansiyon, kontrollü bir enfeksiyon çokluğunda hücreleri aşılamak için kuyu başına hücre sayısına göre seyreltilir. Aşılanmış hücreler, bakterilerin NPPC’ler tarafından içselleştirilmesine izin vermek için 2 saat boyunca inkübe edilir, ardından hücre dışı bakterileri seçici olarak öldürmek için kültür ortamına lysostaphin eklenir. Lysostaphin, deneyin geri kalanında kültür ortamında mevcuttur.
Bu noktada, enfekte hücreler S. aureus’a karşı hücre içi aktivitelerini değerlendirmek için antimikrobiyal bileşiklerle inkübe edilebilir. Daha sonra, hücreler ilaçları çıkarmak için üç kez yıkanır ve hücre içi S. aureus yükü daha sonra agar plakaları üzerinde kültleme ile ölçülür. Alternatif olarak, hücre içi sağkalım ve hücre toksisitesinde rol oynayan stafilokok virülans faktörlerini incelemek için, yıkama adımları ihtiyacını ortadan kaldırmak için proteinaz K ile lysostaphin inaktive edilebilir. Bu ipucu hücre içi bakteri yükü nicelemesinin güvenilirliğini artırır, özellikle hücreler hücre içi S. aureus’un çoğalması nedeniyle ağır enfekte olduklarında kültür plakasından kopma eğilimindedir. Bu protokoller hemen hemen her türlü yandaş NPPC ile ve organoidler gibi 3D hücre kültürü modelleriyle kullanılabilir.
Introduction
Staphylococcus aureus hem hayatı tehdit eden bir patojen hem de cildin ve dünyadaki iki milyar kişiyi kolonizleştiren mukozanın kommensal bir bakterisi1. İnsanlarda, S. aureus’un burun taşıyıcıları kendi taşıma suşu ile enfeksiyon riskine sahiptir; ancak S. aureus mukozal taşıyıcının çok yönlü belirleyicileri hala belirsizdir1,2. Akut enfeksiyonlara ek olarak, hastalar genellikle tedavisi zor olan kronik S. aureus enfeksiyonları da geliştirebilirler3. Kolonizasyon ve enfeksiyon sırasında konak-patojen etkileşimlerinin daha iyi anlaşılması, yeni terapötik stratejiler geliştirmek ve hasta yönetimini iyileştirmek için çok önemlidir.
In vitro, S. aureus α5β1 integrin4 ifade konak hücreleri içine içselleştirme tetikleyebilir. Stafilokok fibronektin bağlayıcı proteinler arasındaki üçlü etkileşim S hücre duvarına tutturuldu. aureus, fibronektin ve konak hücre yüzeyinde ifade edilen β1 integrin, keratinositler, osteoblastlar, fibroblastlar ve epitel ve endotel hücreleri gibi NPPC’lerde S. aureus internalizasyonunun ana yolu olarak bilinir4. Son çalışmalar, S. aureus’un burun kolonizasyonu5,6 ve enfeksiyon sırasında insan hücrelerinin içinde bulunabileceğini göstermektedir7. Bununla birlikte, hücre içi rezervuarın S. aureus enfeksiyonunun patogenezindeki rolü belirsizliğini korumaktadır. Konak hücreler, hem bağışıklık sisteminden hem de çoğu antimikrobiyal bileşikten korunan S. aureus için bir sığınak görevi görebilmektedir6,9.
1980’lerin başlarında Proctor10 tarafından tanımlanan lysostaphin koruma tahlili, S. aureus izolelerinin içselleştirilmesinde rol oynayan bakteriyel ve konak faktörlerin incelenmesini sağlar. Lysostaphin, Staphylococcus simulans tarafından üretilen ve antibiyotiğe dirençli suşlar da dahil olmak üzere hemen hemen tüm S. aureus izolatlarına karşı güçlü aktivite gösteren bir bakteriyosindir11. Lysostaphin, sadece hücre dışı bakterilerin sayılabilmesi için sadece hücre dışı S. aureus’u yok etmek için kullanılmıştır12. Bu teknik yaygın olarak kullanılmış ve S. aureus’un çeşitli virülans faktörlerinin keşfine katkıda bulunmuştur. Gentamycin, yalnız ve lysostaphin ile birlikte hücre içi bakterileri incelemek için de yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bununla birlikte, yeni bir çalışma, gentamycin’in ökaryotik hücrelere girdiğini ve zaman ve konsantrasyona bağlı bir şekilde içselleştirilmiş bakterilere ulaştığını göstermiştir13. Bu çalışma ayrıca lisostaphin’in ökaryotik hücrelere girmediğini göstererek, lisostafin bazlı enzim koruma testinin (EPA) hücre içi S. aureus yükünü kültüre göre ölçmek için en doğru test olduğunu doğruladı13. Hücre dışı bakterileri (örneğin, lisostafin veya gentamycin) yok etmek için hangi bileşiğin kullanıldığına bakılmaksızın, hücre içi S. aureus’u agar plakalarına kaplamadan önce hücreler yıkanarak çıkarılmalıdır. Ardışık yıkamalar, hücrelerin, özellikle de kötü yapışan hücrelerin (örneğin, ağır enfekte hücreler) kopmasıyla sonuçlanabilir ve bu da hücre içi S. aureus yükünün hafife almasına neden olur. Bu makalede, EPA’nın hücre içi S. aureus yükünü ölçmek ve bir in vitro model kullanarak antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğini ölçmek için nasıl kullanılabileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Not olarak, yoğun yıkamalardan kaçınarak hücre içi yük nicelemesinin güvenilirliğini artırmak için basit bir yöntem önerilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan tahliller, NPPC’lerde S. aureus’un içselleştirilmesinin ve hücre içi sağkalımının yanı sıra antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğini incelemek için değerlidir6,15,16. Her iki test protokolündeki bazı adımlar kritik olabilir. Sağlık durumu ve hücrelerin yoğunluğu, bağımsız deneyler arasında mükemmel bir şekilde kontrol edilmeli ve tutarlı olmalıdır. Hedeflenen teorik MOI’ye yakın gerçek bir MOI elde etmek için bakteriyel inoculum dikkatlice standartlaştırılmalıdır. Genel olarak, pipetleme yaparken hücrelerin hiçbirini ayırmamaya özen edilmelidir. Lisostaphin ve antibiyotikleri çıkarmak için yıkamalar EPA’da kritik adımlardır. Proteinaz K kullanımının antibiyotik kullanılmadığında bu adımı iyileştirdiği bulunmuştur (aşağıya bakınız). Son olarak, hücreler her kuyuda tamamen ayrılmalı ve S. aureus hücre içi yükü güvenilir bir şekilde ölçmek için lizis tamponu ile inkübasyondan sonra iyice homojenize edilmelidir.
Bazı durumlarda, sorunlarla karşılaşılabilir ve önce birkaç noktanın denetlenmesi gerekir. Tekrarlanabilirlik eksikliği durumunda, S. aureus’un kümeler oluşturabileceği ve absorbans yanlışlığı ile nicelik yapabileceği akılda tutulmalıdır. Kültür ortamı değiştirilecekse (örneğin, salgılanan bir proteini ortadan kaldırmak için) bakterilerin topaklanması santrifüjleme ve yıkama adımları ile arttırılabilir. Bakteri süspansiyonu hızla kullanılmalıdır çünkü bakteriler oda sıcaklığında büyümeye devam eder. Yanlış depolama koşulları, kültür medyasında enzim aktivitesi için yetersiz pH, partiler ve sağlayıcılar arasındaki enzimamatik aktivitede değişkenlik ve belirli büyüme koşullarında bazı suşların lisostafin hassasiyetinin olmaması nedeniyle lisostafin etkinliği azalabilir. Fenol kırmızısı, özellikle kültür ortamı, bakteri yetiştirmek için kullanılan tipik et sularına kıyasla besin bakımından nispeten zayıf olduğunda, hafif bir bakteriyostatik etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, arka plan gürültüsünü azaltarak floresan mikroskobik gözlemleri de iyileştiren fenol kırmızısı olmayan bir hücre kültürü ortamının kullanılması tavsiye edilir.
Bu yöntem farklı suşların hücre içi kaderini incelemek için değerli bir araç olmasına rağmen, yöntemin bazı sınırları göz önünde bulundurulmalıdır. Çok yüksek bir MOI kullanımı, NPPC’ler tarafından içselleştirme yeteneğini aşırı yükleyebilir ve test edilen farklı suşlar arasındaki farkları seviyelendirebilir. En sitotoksik suşların içselleştirilmesinin kapsamı hafife alınabilir, çünkü lisostafin (veya antibiyotikler) hasarlı hücreler tarafından salınan S. aureus’u hızla yok eder. Bu nedenle, uzun süreli deneyler (yani, hücre içi sağkalım veya hücre içi antibiyotik aktivitesini incelemek için) düşük sitotoksisiteye sahip suşlarla kurmak daha kolaydır. Bu nedenle, inkübasyon süresi ve MOI, gerinim virülansına, hücre tipine ve deneysel amaca göre doğru bir şekilde ayarlanmalıdır.
Burada lysostaphin kullanımı ile açıklanan yöntem gentamisin bazlı olanlardan daha güvenilirdir, çünkü lizostafin aksine, gentamisin konak hücreler tarafından içselleştirilme eğilimindedir13. Diğer avantaj, lisostaphin’i devre dışı bırakma olasılığıdır. Kim ve ark.13 tarafından çinko iyonlarını şelatlamak için EDTA veya 1.10-fenantropin kullanılarak lysostaphin aktivitesinin inhibisyonu bildirilmiştir; bununla birlikte, bakterilerin kaplayılmadan önce enzimi çıkarmak için hala yoğun yıkamalar gereklidir. Burada proteinaz K, lizostafin hızlı inaktivasyonunu sağlar. Hücre içi S. aureus çoğalması nedeniyle hücrelerin ağır enfekte olduklarında kültür plakasından kopma eğiliminde olduklarını gözlemledik. Son yıkama adımını atlayarak, iEPA yöntemi teknik kullanımı büyük ölçüde basitleştirdi ve gevşek yapışan veya zaten ayrılmış hücrelerde içselleştirilmiş bakterilerin geri kazanılmasını sağladı.
iEPA’da kullanılan daha konsantre reaktifler ve tamponlar da pipetleme çabasını azaltmaya ve hücre kaybını en aza indirmeye yardımcı oldu. Ek olarak, iEPA süspansiyondaki hücrelerle ve yıkanması zor organoidlerle kullanılabilir. Sonuç olarak, enzim koruma tahlilleri, S. aureus’un içselleştirmenin kapsamının ve hücre içi kaderinin yanı sıra farklı in vitro modellere sahip antimikrobiyal ilaçların hücre içi aktivitesinin incelenmesini sağlar. Hücre içindeki S. aureus’a ulaşabilen ilaçlar geliştirmenin önemini daha iyi takdir etmek için içselleştirme ve sitotoksiklik arasındaki ilişkiyi daha iyi karakterize etmek için iyileştirmeler yapılmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. aureus suşları SF8300 WT ve SF8300 ΔfnbA/B, Prof. Binh Diep (Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco, ABD) tarafından cömertçe hediye edildi. Bu çalışma, Lyon Üniversitesi Vakfı’nın himayesinde finovi derneğinin (#AO13 FINOVI) hibesi ile desteklendi.
Materials
| 24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
| A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
| Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
| AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
| COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
| Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
| Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
| Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
| Sterile water | OTEC | 600500 | |
| T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
| TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
| Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |
References
- Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
- Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
- Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Hanssen, A. -. M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
- Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
- Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
- Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
- Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
- Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
- Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
- Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
- Kim, J. -. H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
- Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count (2021)
- Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
- Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).
