黄色 ブドウ球菌 内在化と抗菌性化合物の細胞内有効性を研究するための酵素保護アッセイの改善

ヒト上皮細胞の培養 Dulbeccoの修飾Eagle培地(DMEM)高グルコースをフェノールレッドで完全な培養培地を調製し、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清(FBS)を補う。 A549上皮細胞を完全な培養培地で5%CO2で36±1°Cで増殖させる。適切なサイズの培養容器を使用して、後続のステップに十分な細胞を確保してください(ステップ1.10参照)。注:1つの75 cm2 (T-75)フラスコは、2つの24ウェルプレートを播種し、細胞をサブ培養するのに十分です。 感染の2日前に、単一の24ウェルプレートを調製する。 使用済み培養培地をT-75フラスコから取り出して捨て、10mLのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)で細胞を1回洗浄します。 5 mLのトリプシン-EDTAを加え、5%CO2で36±1°Cで5分間培養します。 5 mLの完全な培養培地を加え、細胞をチューブに移します。 300×gで5分間細胞を遠心分離 する。 上清を捨て、10mLの新鮮な完全な培養培地で細胞を再懸濁する。 自動セルカウンター(または計数チャンバー)を持つセルをカウントします。 完全な培養培地で細胞を希釈し、105 個の細胞/mLの濃度2.0×で30mLの細胞懸濁液を調製する。 24ウェルプレートのウェルに1mLのセルサスペンションを加え、2cm²のウェルエリアに対して約1.0×105 セル/cm²のセル密度に対応します。 5%CO2 で36±1°Cで48時間培養し、合流率100%に達します。注:テストする条件に加えて、3つの井戸は、感染の日にセルカウントのために予約する必要があります(ステップ3.1.4を参照してください)。試験される条件の数に応じて、24ウェルプレートまで同時に準備することができます。プロトコルに示されているボリュームは、それに応じて増やす必要があります。 2. S. アウレウス 株の培養 感染の2日前に、フェノールレッドを含まないDMEM高グルコースで完全感染培地を調製し、抗生物質を使わずに10Sを補う。 寒天プレート上で試験されるS. アウレウス 株を解凍する。 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。 接種の前日に、完全感染培地の10mLで試験される S.アウレウス 株の1コロニーを接種する。 160rpmで振盪して36±1°Cで18〜24時間細菌をインキュベートします。細菌の沈降を避けるために45°で保持された50 mLの管を使用してください。注:新しい株で開始する前に、さらなる実験(培地、細菌負荷、リソスタフィン濃度およびインキュベーション時間)に使用される同じ条件の培養でリソスタフィン感受性を確認することをお勧めします。また、1つの株から別の株にわずかに異なる可能性があるため、0.5のOD600nm に対応する細菌負荷を決定することも重要です。細菌株の培養条件は、実験目的に応じて適合することができる。 3. S. アウレウスによる感染アッセイ 細胞密度と生存率の決定 A549細胞を数える専用の3つのウェルから使用済み培地を取り出して廃棄する。 5 μg/mL の Hoechst 33342 と 1 μg/mL のヨウ化プロピジウムを含む完全感染培地を 1 mL 加えます。注意: Hoechst 33342は既知のミュータゲンであり、注意して取り扱う必要があります。ヨウ化プロピジウム(潜在的な変異原)は、注意して取り扱い、適用される規制に従って安全に処分する必要があります。 5%CO2で36±1°Cで30分間培養します。 細胞数を数え、振り込み場蛍光顕微鏡を用いて細胞生存率を計算する。注:蛍光顕微鏡が利用できない場合、細胞密度と生存率は、細胞計数チャンバーを使用してトリパンブルー染色で計算することができます。 細菌懸濁液の調製 完全な感染媒体の25 mLをチューブに分配し、36±1°Cで予温する。 細胞密度計を用いて完全感染媒体中の0.5のaOD600nmにS.アウレウス懸濁液を調整します。 完全感染媒体中の0.5 OD600nm を希釈して細胞接種用の細菌懸濁液20mLを調製し、ウェル当たりの細胞数に応じて1の多重性の感染(MOI)を達成する。注:MOIは、各ウェルの細胞当たりの細菌の数に対応しています。たとえば、1.0 × 106 細胞を持つ 1.0 の MOI をウェルあたり 106 個のセルで実現するには、2.0 × 106 CFU/mL で細菌懸濁液を用意し、106 CFU を 500 μL の体積で追加できるようにします(ステップ 3.3.3 を参照)。MOIは、試験される細胞タイプおよび細菌株に応じて調整することができる。 自動スパイラルプラターを使用して、細胞接種ステップに使用する希釈細菌懸濁液の S.アウレウス 負荷を決定します。 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。 翌日、コロニーカウンターを持つコロニーの数を数え、検査された各株の正確なMOIを計算します。注:自動スパイラルプラターが利用できない場合、細菌の負荷は寒天プレートの連続希釈によって決定することができます。詳細14については、細菌学的分析マニュアルを参照してください。 細胞接種 細胞が健康で期待どおりに成長していることを確認するために、低倍率顕微鏡で24ウェルプレートのすべての井戸を観察します。 24ウェルプレートから使用済み細胞培養培地を取り出し、廃棄します。 100%コンフルエント細胞を持つ各ウェルに接種のための細菌懸濁液の500 μLを加えます。 1°Cおよび5%co2±36で細胞を2時間インキュベートする。注:試験(三重)をテストする各条件のためにプレートの3つのウェルを使用し、少なくとも3つの独立した実験を行うことをお勧めします。インキュベーションの遅延は、実験目的に応じて適合させることができる。 酵素保護アッセイ(iEPA)を改良した細胞内細菌の定量化 滅菌水に3.5 mLの2%トリトンX-100とトリプシン-EDTAの3.5 mLを用いて、4xリシスバッファー7 mLを調製します。 酢酸緩衝液中10mg/mLのリゾスタフィンストック溶液と25μLのアリコート液をクライオビアルに調製します。-80°Cで6ヶ月間保管してください。 リソスタフィンストック溶液25μL(10mg/mL)と0.1 M Tris-HClの225 μLを混合して、1mg/mLで250μLのリソスタフィン作業溶液を調製します。4°Cで48時間まで保管してください。 リソスタフィンの働く溶液の250 μLに完全な感染培地の6 mLを加えることによってリソスタフィンを補充する完全な感染培地の6.25 mLを準備する。 リソスタフィンを補った完全な感染培地250μLを各ウェルに加え、手でプレートを回転させることでプレートを軽く攪拌します。 細胞を5%CO2 で36±1°Cで1時間培養し、リソスタフィンが細胞外細菌を殺すようにします。 インキュベーション時間の終了時に、各ウェルに10mg/mLのプロテイナーゼKを10μL加えて、リソスタフィンを不活性化します。 室温で2分間細胞をインキュベートする。 4xリシスバッファーの250 μLを加え、浸透衝撃で細胞を分解します。 細胞を36分1°Cで10分間インキュベート±。 ウェルの底全体に10回上下にピペットを入れ、細胞が完全に溶かされ、均質化されるように徹底的に混合します。 自動スパイラルプラターを使用して、各ウェルの S.アウレウス 負荷を決定します。 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。 翌日、コロニーカウンターを有するコロニー数をカウントし、各ウェルの細胞内 S.アウレウス負荷を 計算する。 酵素保護アッセイ(EPA)による抗菌性化合物の細胞内有効性の測定 滅菌水に3.125 mLのトリトンX-100、トリプシン-EDTA 6.25 mL、滅菌水15.625 mLの1xリシスバッファー25 mLを調製します。 リソスタフィンストック溶液25μL(10mg/mL)と0.1 M Tris-HClの225 μLを混合して、1mg/mLで250μLのリソスタフィン作業溶液を調製します。 リソスタフィンの作業溶液の250 μLに完全な感染培地の24.75 mLを加えることによって、リソスタフィンを補った完全な感染培地の25 mLを準備します。 試験対象の各抗菌化合物について、研究対象の濃度でリソスタフィンおよび抗菌化合物を添加した完全感染培地3.1mLを調製する。 24ウェルプレートから使用済み細胞培養培地を取り出し、廃棄します。 リソスタフィンを添加した完全な感染培地の1 mLを加える。 細胞を5%CO2 で36±1°Cで1時間培養し、リソスタフィンが細胞外細菌を殺すようにします。 24ウェルプレートからリソスタフィンを添加した培地を取り出し、廃棄します。 リソスタフィンと試験する抗菌化合物を添加した培地の3つのウェルを満たします。 試験対象の各抗菌化合物について、ステップ3.5.9を繰り返します。 制御条件については、抗菌化合物を含まずにリソスタフィンを添加した培地1mLで3つのウェルを充填します。 細胞を5%CO2で36±1°Cで24時間培養します。 インキュベーション期間の終わりに、使用済み培地を取り除いて捨て、CaCl2 およびMgCl2で滅菌DPBSで3回ずつゆっくりと洗浄します。 各ウェルに1mLの1mLのライシスバッファーを加え、浸透衝撃によって細胞を剥離して分解します。 細胞を36分1°Cで10分間インキュベート±。 細胞が完全に溶かされ、均質化されていることを確認するために、ウェル全体に10回上下にピペットを介して徹底的に混合します。 自動スパイラルプラターを使用して、各ウェルの S.アウレウス 負荷を決定します。 寒天プレートを36±1°Cで18〜24時間インキュベートします。 翌日、コロニーカウンターを有するコロニー数をカウントし、各ウェルの細胞内 S.アウレウス負荷を 計算する。注:各抗菌化合物の細胞内活性は、制御条件の細菌負荷に応じて計算する必要があります。また、コントロールと化合物の間に認められる差異が細胞死によるものではないことを証明するために、すべての抗菌性化合物の細胞毒性をチェックすることも重要です。