Verbeterde enzymbeschermingstest om staphylococcus aureus internalisatie en intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te bestuderen

1. Kweek van menselijke epitheelcellen Bereid volledig kweekmedium met Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM) hoge glucose met fenolrood, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibiotica. Kweek A549-epitheelcellen in volledig kweekmedium bij 36 ± 1 °C in 5% CO2. Zorg ervoor dat u een kweekvat van de juiste grootte gebruikt om voldoende cellen te hebben voor de volgende stappen (zie stap 1.10).OPMERKING: Eén kolf van 75 cm2 (T-75) is voldoende om twee 24-well platen te zaaien en de cellen te subcultureren. Bereid twee dagen voor infectie een enkele 24-well plaat voor. Verwijder en gooi het gebruikte kweekmedium weg uit de T-75 kolf en was de cellen eenmaal met 10 ml Dulbecco′s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Voeg 5 ml trypsine-EDTA toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 36 ± 1 °C in 5% CO2. Voeg 5 ml volledig kweekmedium toe en breng de cellen over in een buis. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 10 ml vers volledig kweekmedium. Tel de cellen met een automatische celteller (of een telkamer). Verdun de cellen in het volledige kweekmedium om 30 ml celsuspensie te bereiden in een concentratie van 2,0 × 105 cellen/ml. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan elke put van een 24-putplaat, wat overeenkomt met een celdichtheid van ongeveer 1,0 × 105 cel / cm² voor een putoppervlak van 2 cm². Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 36 ± 1 °C in 5% CO2 totdat ze 100% samenvloeiing bereiken.OPMERKING: Naast de te testen omstandigheden moeten op de dag van infectie drie putjes worden gereserveerd voor het tellen van cellen (zie stap 3.1.4). Afhankelijk van het aantal te testen omstandigheden kunnen maximaal twee 24-putplaten tegelijkertijd worden bereid. De in het protocol aangegeven volumes moeten dienovereenkomstig worden verhoogd. 2. Kweek van S. aureus-stammen Twee dagen voor infectie, bereid volledige infectie medium met DMEM hoge glucose zonder fenol rood, aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica. Ontdooi S. aureus stammen te testen op agar platen. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C. Ent de dag voor de inenting één kolonie van de S. aureus-stam in om te worden getest in 10 ml volledig infectiemedium. Incubeer de bacteriën gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C met schudden bij 160 tpm. Gebruik buizen van 50 ml die op 45° worden gehouden om te voorkomen dat de bacteriën bezinken.OPMERKING: Voordat u met een nieuwe stam begint, wordt aanbevolen om de gevoeligheid voor lysostaphin te verifiëren in dezelfde cultuuromstandigheden die zullen worden gebruikt voor verdere experimenten (media, bacteriële belastingen en lysostapineconcentratie en incubatietijd). Het is ook belangrijk om de bacteriële belasting te bepalen die overeenkomt met een OD600nm van 0,5, omdat deze enigszins kan variëren van de ene stam tot de andere. Kweekomstandigheden van bacteriestammen kunnen worden aangepast aan het experimentele doel. 3. Infectietest met S. aureus Bepaling van celdichtheid en levensvatbaarheid Verwijder en gooi het gebruikte kweekmedium weg uit de drie putten die zijn bestemd voor het tellen van A549-cellen. Voeg 1 ml volledig infectiemedium toe met 5 μg/ml Hoechst 33342 en 1 μg/ml propidiumjodide.OPMERKING: Hoechst 33342 is een bekend mutageen en moet met zorg worden behandeld. Propidiumjodide, een potentieel mutageen, moet met zorg worden behandeld en veilig worden verwijderd volgens de toepasselijke regelgeving. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 36 ± 1 °C in 5% CO2. Tel het celnummer en bereken de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een wield-field fluorescentiemicroscoop.OPMERKING: Als er geen fluorescentiemicroscoop beschikbaar is, kunnen de celdichtheid en levensvatbaarheid worden berekend met trypan blauwe kleuring met behulp van een celtelkamer. Bereiding van de bacteriële suspensie Doseer 25 ml volledig infectiemedium in een buis en verwarm voor bij 36 ± 1 °C. Stel de S. aureus-suspensie in op anOD600nm van 0,5 in volledig infectiemedium met behulp van een celdichtheidsmeter. Bereid 20 ml bacteriële suspensie voor celinenting voor door de 0,5 OD600 nm in volledig infectiemedium te verdunnen om een multipliciteit van infectie (MOI) van 1 te bereiken, afhankelijk van het aantal cellen per put.OPMERKING: De MOI komt overeen met het aantal bacteriën dat per cel in elke put wordt toegevoegd. Om bijvoorbeeld een MOI van 1 met 1,0 × 106 cellen per put te bereiken, bereidt u een bacteriële suspensie voor op 2,0 × 106 KVE/ml, zodat 106 KVE kan worden toegevoegd in een volume van 500 μL (zie stap 3.3.3). De MOI kan worden aangepast aan de te testen celtypen en bacteriestammen. Gebruik een automatische spiraalplater om de S. aureusbelasting van de verdunde bacteriële suspensie te bepalen die moet worden gebruikt voor de celinentingsstap. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C. Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de nauwkeurige MOI voor elke geteste stam te berekenen.OPMERKING: Als er geen automatische spiraalplater beschikbaar is, kan de bacteriële belasting worden bepaald door seriële verdunning op een agarplaat. Zie de bacteriologische analytische handleiding voor details14. Celinenting Observeer elke put van de 24-putplaat door microscopie met lage vergroting om ervoor te zorgen dat de cellen gezond zijn en groeien zoals verwacht. Verwijder het gebruikte celkweekmedium van de 24-well plaat en gooi het weg. Voeg 500 μL van de bacteriële suspensie voor inenting toe aan elke put met 100% confluente cellen. Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij 36 ± 1 °C en 5% CO2.OPMERKING: het wordt aanbevolen om drie putjes van de plaat te gebruiken voor elke te testen aandoening (drievoudig) en om ten minste drie onafhankelijke experimenten uit te voeren. De vertraging van incubatie kan worden aangepast aan het experimentele doel. Kwantificering van intracellulaire bacteriën met verbeterde enzyme protection assay (iEPA) Bereid 7 ml 4x lysisbuffer met 3,5 ml 2% Triton X-100 in steriel water en 3,5 ml trypsine-EDTA. Bereid een lysostaphin stockoplossing van 10 mg /ml in acetaatbuffer en aliquot 25 μL in cryovialen. Bewaren bij -80 °C gedurende maximaal 6 maanden. Bereid 250 μL van een verse lysostaphin-werkoplossing bij 1 mg/ml door 25 μL van de lysostaphin-stamoplossing (10 mg/ml) en 225 μL van 0,1 M Tris-HCl te mengen. Bewaren bij 4 °C tot 48 uur. Bereid 6,25 ml volledig infectiemedium aangevuld met lysostaphin door 6 ml volledig infectiemedium toe te voegen aan 250 μL van de lysostaphin-werkoplossing. Voeg 250 μL volledig infectiemedium aangevuld met lysostapine toe aan elke put en roer de plaat voorzichtig door de plaat met de hand te draaien. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 36 ± 1 °C in 5% CO2 om de lysostaphin de extracellulaire bacteriën te laten doden. Voeg aan het einde van de incubatietijd 10 μL proteïnase K bij 20 mg / ml toe aan elke put om de lysostaphin te inactiveren. Incubeer de cellen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 250 μL 4x lysisbuffer toe om de cellen te lyseren door osmotische shock. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 36 ± 1 °C. Meng grondig door tien keer op en neer te pipetteren over de bodem van de put om ervoor te zorgen dat de cellen volledig worden gelyseerd en gehomogeniseerd. Gebruik een automatische spiraalplater om de S. aureusbelasting van elke put te bepalen. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C. Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de intracellulaire S. aureusbelasting van elke put te berekenen. Meting van de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen met enzyme protection assay (EPA) Bereid 25 ml 1x lysisbuffer met 3,125 ml 2% Triton X-100 in steriel water, 6,25 ml trypsine-EDTA en 15,625 ml steriel water. Bereid 250 μL van een verse lysostaphin-werkoplossing bij 1 mg/ml door 25 μL van een lysostaphin-stamoplossing (10 mg/ml) en 225 μL van 0,1 M Tris-HCl te mengen. Bereid 25 ml volledig infectiemedium aangevuld met lysostaphin door 24,75 ml volledig infectiemedium toe te voegen aan 250 μl van de lysostaphin-werkoplossing. Bereid voor elke antimicrobiële verbinding die moet worden getest 3,1 ml volledig infectiemedium, aangevuld met lysostapine en de antimicrobiële verbinding in de te onderzoeken concentratie. Verwijder het gebruikte celkweekmedium van de 24-well plaat en gooi het weg. Voeg 1 ml volledig infectiemedium toe, aangevuld met lysostapine. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 36 ± 1 °C in 5% CO2 om de lysostaphin de extracellulaire bacteriën te laten doden. Verwijder en gooi het medium aangevuld met lysostaphin uit de 24-well plaat. Vul drie putjes met 1 ml medium aangevuld met lysostaphin plus de te testen antimicrobiële verbinding. Herhaal stap 3.5.9 voor elke antimicrobiële verbinding die moet worden getest. Vul voor de controleconditie drie putten met 1 ml medium aangevuld met lysostapine zonder antimicrobiële verbinding. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 36 ± 1 °C in 5% CO2. Verwijder en gooi aan het einde van de incubatieperiode het gebruikte medium weg en was elke put voorzichtig driemaal met steriel DPBS met CaCl2 en MgCl2. Voeg 1 ml 1x lysisbuffer toe aan elke put om de cellen los te maken en te lyseren door osmotische shock. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 36 ± 1 °C. Meng grondig door tien keer op en neer te pipetteren over de put om ervoor te zorgen dat de cellen volledig worden gelyseerd en gehomogeniseerd. Gebruik een automatische spiraalplater om de S. aureusbelasting van elke put te bepalen. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C. Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de intracellulaire S. aureusbelasting van elke put te berekenen.OPMERKING: De intracellulaire activiteit van elke antimicrobiële verbinding moet worden berekend op basis van de bacteriële belasting van de controleconditie. Het is ook belangrijk om de cytotoxiciteit van alle antimicrobiële verbindingen te controleren om te bewijzen dat de waargenomen verschillen tussen de controle en de verbindingen niet te wijten zijn aan celdood.