تحسين فحص حماية الإنزيم لدراسة استوعب المكورات العنقودية والفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى وصف كيفية دراسة مدى استيعاب المكورات العنقودية والحجرة وقدرتها على البقاء داخل الخلية المضيفة للإنسان ، وكذلك الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات.
Abstract
المكورات العنقودية أوريوس يعبر عن عوامل الفوعة لتحريك استيعابها في خلايا eukaryote والبقاء على قيد الحياة داخل مقصورات فرعية مختلفة. تصف هذه الورقة فحص حماية الإنزيم لدراسة مدى استيعاب S. aureus وبقائه داخل الخلايا في الخلايا البلعومية غير الاحترافية (NPPCs) بالإضافة إلى الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات. تزرع NPPCs في لوحة متعددة الآبار حتى تصل إلى التقاء 100٪. S. تزرع الثقافات أوريوس بين عشية وضحاها في خلية الثقافة المتوسطة. يتم تخفيف التعليق البكتيري وفقا لعدد الخلايا لكل بئر لتطعيم الخلايا في تعدد الإصابة الخاضع للرقابة. يتم احتضان الخلايا الملقحة لمدة 2 ساعة للسماح للبكتيريا أن تكون داخلية من قبل NPPCs، وبعد ذلك يتم إضافة الليسوستافين إلى وسط الثقافة لقتل البكتيريا خارج الخلية بشكل انتقائي. ليسوستافين موجود في الوسط الثقافي لبقية التجربة.
عند هذه النقطة، يمكن احتضان الخلايا المصابة بمركبات مضادة للميكروبات لتقييم أنشطتها داخل الخلايا ضد S. aureus. بعد ذلك ، يتم غسل الخلايا ثلاث مرات لإزالة الأدوية ، ثم يتم قياس حمولة S. aureus داخل الخلايا عن طريق الاستزراع على لوحات أجار. بدلا من ذلك، لدراسة عوامل الفوعة المكورات العنقودية المشاركة في البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا وسمية الخلية، يمكن تعطيل الليسوستافين مع البروتين K للقضاء على الحاجة إلى خطوات الغسيل. يحسن هذا الطرف موثوقية التحديد الكمي للأحمال البكتيرية داخل الخلايا ، خاصة إذا كانت الخلايا تميل إلى الانفصال عن لوحة الثقافة عندما تصاب بشدة بسبب تكاثر S. aureus داخل الخلية. يمكن استخدام هذه البروتوكولات مع جميع أنواع NPPCs المنضمة تقريبا ومع نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد مثل organoids.
Introduction
المكورات العنقودية أوريوس هو على حد سواء ممرض يهدد الحياة وبكتيريا كومينسال من الجلد والغشاء المخاطي الذي يستعمر ملياري فرد في جميع أنحاء العالم1. في البشر، الناقلين الأنف من S. أوريوس لديها خطر متزايد من العدوى مع سلالة خاصة بهم من النقل. ومع ذلك، فإن المحددات متعددة العوامل للنقل المخاطي S. aureus لا تزال غير واضحة1،2. بالإضافة إلى الالتهابات الحادة ، يمكن للمرضى أيضا تطوير التهابات S. aureus المزمنة التي غالبا ما تكون صعبة للعلاج3. إن الفهم الأفضل للتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض أثناء الاستعمار والعدوى أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة وتحسين إدارة المرضى.
في المختبر، S. أوريوس يمكن أن تؤدي إلى استيعابها في الخلايا المضيفة التي تعبر عن integrin4 α5α1. التفاعل الثلاثي بين البروتينات الملزمة للمكورات العنقودية الليفية الراسية على جدار الخلية S. aureus ، فيبروكتين ، و β1 integrin المعبر عنها على سطح الخلية المضيفة معروف جيدا باسم المسار الرئيسي لاستيعاب S. aureus في NPPCs مثل الخلايا الكيراتينية ، والعظام العظمية ، والخلايا الليفية ، والخلايا الظهارية والظهارية4. تظهر الدراسات الحديثة أن S. aureus يمكن العثور عليها داخل الخلايا البشرية خلال استعمار الأنف5،6 والعدوى7. ومع ذلك ، فإن دور الخزان داخل الخلايا في الإمراض من عدوى S. aureus لا يزال غير واضح. ويمكن للخلايا المضيفة أن تكون بمثابة مأوى ل S. aureus، وهو محمي من كل من الجهاز المناعي8 ومعظم مركبات مضادات الميكروبات6,9.
يمكن اختبار حماية الليسوستافين ، الذي وصفه Proctor10 في وقت سابق من الثمانينيات ، من دراسة العوامل البكتيرية والمضيفة المشاركة في استيعاب عزلات S. aureus. ليسوستوفين هو بكتيريا تنتجها المكورات العنقودية simulans، الذي يظهر نشاطا قويا ضد تقريبا جميع عزلات S. أوريوس، بما في ذلك سلالات مقاومة للمضادات الحيوية11. وقد استخدمت ليسوستافين لتدمير فقط خارج الخلية S. أوريوس لتمكين العد من البكتيريا داخل الخلايا فقط قابلة للحياة12. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع وساهمت في اكتشاف العديد من عوامل الفوعة من S. أوريوس. كما يستخدم جنتامايسين، وحده وجنبا إلى جنب مع الليسوستافين، على نطاق واسع لدراسة البكتيريا داخل الخلايا.
ومع ذلك، أظهرت دراسة حديثة أن جنتامايسين يدخل الخلايا النواة ويصل إلى البكتيريا الداخلية بطريقة تعتمد على الوقت والتركيز13. كما أظهرت هذه الدراسة أن الليسوستافين لا يدخل الخلايا eukaryotic، مما يؤكد أن اختبار حماية الإنزيم القائم على الليسوستافين (EPA) هو الفحص الأكثر دقة لقياس الحمل داخل الخلية S. aureus حسب الثقافة13. بغض النظر عن المركب الذي يستخدم لتدمير البكتيريا خارج الخلية (على سبيل المثال، الليسوستاوستافين أو جنتامايسين)، ينبغي إزالته عن طريق غسل الخلايا قبل طلاء داخل الخلية S. أوريوس على لوحات أجار. قد يؤدي الغسل المتتالي إلى انفصال الخلايا ، وخاصة الخلايا الملتصقة بشكل سيئ (على سبيل المثال ، الخلايا المصابة بشدة) ، مما يؤدي إلى التقليل من شأن حمولة S. aureus داخل الخلايا. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيف يمكن استخدام وكالة حماية البيئة لتحديد حمولة S. aureus داخل الخلايا وقياس الفعالية داخل الخلايا لمركبات مضادات الميكروبات باستخدام نموذج المختبر. وتجدر الإشارة إلى أنه تم اقتراح طريقة بسيطة لتحسين موثوقية التحديد الكمي للأحمال داخل الخلايا عن طريق تجنب الغسل المكثف.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن المقايسات الموصوفة هنا قيمة لدراسة مدى الاستيعاب والبقاء داخل الخلايا ل S. aureus في NPPCs ، وكذلك الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات6،15،16. يمكن أن تكون بعض الخطوات في كلا البروتوكولين الفحص حرجة. يجب التحكم في الحالة الصحية وكثافة الخلايا بشكل مثالي ومتسقة بين التجارب المستقلة. يجب أن تكون inoculum البكتيرية موحدة بعناية للحصول على MOI الحقيقي على مقربة من وزارة الداخلية النظرية المستهدفة. بشكل عام، يجب الحرص على عدم فصل أي من الخلايا أثناء الأنابيب. يغسل لإزالة اليسوستافين والمضادات الحيوية هي خطوات حاسمة في وكالة حماية البيئة. تم العثور على استخدام البروتين K لتحسين هذه الخطوة عندما لا يتم استخدام المضادات الحيوية (انظر أدناه). أخيرا وليس آخرا، يجب فصل الخلايا تماما في كل بئر ومتجانسة تماما بعد الحضانة مع العازلة تحلل لتحديد موثوق الحمل S. أوريوس داخل الخلايا.
في بعض الحالات، قد تواجه مشكلات، ويجب التحقق من عدة نقاط أولا. في حالة عدم الإعادة إنتاجها ، يجب أن يوضع في الاعتبار أن S. aureus يمكن أن تشكل كتلا ، مما يجعل القياس الكمي عن طريق الامتصاص غير دقيق. يمكن زيادة تكتل البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وخطوات الغسيل إذا كان سيتم استبدال وسيط الثقافة (على سبيل المثال ، للقضاء على البروتين المفرز). يجب استخدام التعليق البكتيري بسرعة لأن البكتيريا تستمر في النمو في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن تنخفض فعالية اليسوستافين بسبب ظروف التخزين غير الصحيحة ، وhh دون المستوى الأمثل لنشاط الإنزيم في وسائل الإعلام الثقافية ، والتباين في النشاط الأنزيمي بين الدفعات ومقدمي الخدمات ، وعدم وجود حساسية اليسوستاوستافين لبعض السلالات في ظروف نمو محددة. فينول الأحمر يمكن أن يكون لها تأثير البكتيريا طفيف، وخصوصا عندما يكون متوسط الثقافة فقيرة نسبيا في المواد الغذائية بالمقارنة مع مرق نموذجي المستخدمة لزراعة البكتيريا. وهكذا، فإنه من المستحسن استخدام خلية ثقافة المتوسطة دون فينول الأحمر، الذي يحسن أيضا الملاحظات المجهرية الفلورية عن طريق الحد من الضوضاء الخلفية.
على الرغم من أن هذه الطريقة هي أداة قيمة لدراسة المصير داخل الخلايا من سلالات مختلفة، وينبغي النظر في بعض حدود الأسلوب. ويمكن أن يؤدي استخدام وزارة الداخلية العالية جدا إلى إثقال قدرة الأجهزة النووية على الاستيعاب وتسوية الاختلافات بين السلالات المختلفة التي تم اختبارها. يمكن التقليل من مدى استيعاب السلالات الأكثر السامة للخلايا لأن الليسوستافين (أو المضادات الحيوية) يدمر بسرعة S. aureus التي يتم إطلاقها بواسطة الخلايا التالفة. وهكذا، فإن التجارب ذات المدد الممتدة (أي لدراسة البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا أو النشاط داخل الخلايا للمضادات الحيوية) أسهل في الإعداد مع سلالات ذات سمية خلوية منخفضة. لذلك ، يجب تعديل وقت الحضانة و MOI بدقة وفقا لضراوة السلالة ونوع الخلية والهدف التجريبي.
الطريقة الموصوفة هنا مع استخدام الليسوستافين أكثر موثوقية من تلك التي تستند إلى جنتاميسين لأنه ، على عكس الليسوستافين ، يميل جنتاميسين إلى أن يتم استيعابه من قبل الخلايا المضيفة13. الميزة الأخرى هي إمكانية تعطيل ال ليسوستافين. وأبلغ كيم وآخرون 13 عن تثبيط نشاط اليسوستافين باستخدام EDTA لتغلي أيونات الزنك أو 110 فينانثيرولين؛ ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى يغسل مكثفة لإزالة الانزيم قبل طلاء البكتيريا. هنا، بروتيناز K تمكن من تعطيل سريع من اليسوستافين. لاحظنا أن الخلايا تميل إلى الانفصال عن لوحة الثقافة عندما تصاب بشدة بسبب تكاثر S. aureus داخل الخلايا. من خلال تخطي خطوة الغسيل النهائية ، فإن طريقة iEPA تبسيط المعالجة التقنية بشكل كبير وتمكين استرداد البكتيريا الداخلية في الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض أو المنفصلة بالفعل.
كما ساعدت الكواشف والمخازن المؤقتة الأكثر تركيزا المستخدمة في iEPA في تقليل جهد الأنابيب وتقليل فقدان الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام iEPA مع الخلايا في التعليق، وكذلك مع organoids التي يصعب غسلها. في الختام، تمكن مقايسات حماية الإنزيم من دراسة مدى الاستيعاب والمصير داخل الخلايا ل S. aureus، وكذلك النشاط داخل الخلايا للأدوية المضادة للميكروبات ذات النماذج المختبرية المختلفة. وينبغي إدخال تحسينات على تحسين توصيف العلاقة بين الاستيعاب والسمية الخلوية لتقدير أفضل لأهمية تطوير الأدوية القادرة على الوصول إلى S. أوريوس داخل الخلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. سلالات أوريوس SF8300 WT وSF8300 ΔfnbA/B كانت موهوبة بسخاء من قبل البروفيسور بينه ديب (جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد دعم هذا العمل منحة من جمعية فينوفي (#AO13 FINOVI) تحت رعاية مؤسسة جامعة ليون.
Materials
| 24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
| A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
| Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
| AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
| COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
| Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
| Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
| Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
| Sterile water | OTEC | 600500 | |
| T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
| TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
| Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |
References
- Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
- Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
- Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Hanssen, A. -. M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
- Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
- Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
- Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
- Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
- Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
- Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
- Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
- Kim, J. -. H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
- Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count (2021)
- Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
- Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).
