Использование изменений в листовой передаче для исследования движения хлоропластов в Arabidopsis thaliana

Свет необходим для фотосинтеза, роста и развития растений. Это один из наиболее динамичных абиотических факторов, поскольку интенсивность света не только меняется в течение сезона или дня, но и быстро и непредсказуемо в зависимости от облачного покрова. На уровне листьев интенсивность света также зависит от плотности и характера окружающей растительности и собственного полога растения. Одним из важных механизмов, который позволяет растениям оптимизировать перехват света в условиях переменного освещения, является способность хлоропластов двигаться в ответ на стимулы синего ^{света1,2}. В условиях низкой освещенности хлоропласты распространяются перпендикулярно свету (вдоль периклинальных клеточных стенок) в так называемой реакции накопления, максимизируя перехват света и, следовательно, фотосинтез. В условиях высокой освещенности хлоропласты движутся к антиклинальной клеточной стенке в так называемой реакции избегания, сводя к минимуму перехват света и опасность фотоингибирования. У многих видов хлоропласты также принимают специфическое темное положение, которое отличается от позиций накопления и избегания и часто является промежуточным между этими ^{двумя3,4}. Различные исследования показали, что движение хлоропластов важно не только для кратковременной стрессоустойчивости ^{листьев5,6,7}, но и для роста и репродуктивной успешности растений, особенно в условиях переменного ^{освещения8,9}.

Движение хлоропласта легко наблюдается в режиме реального времени у некоторых живых образцов (например, водорослей или тонколистных растений, таких как элодея) с помощью световой микроскопии1. Однако изучение движения хлоропластов в большинстве листьев требует предварительной обработки, чтобы вызвать движение хлоропласта, химическую фиксацию и подготовку поперечных сечений перед просмотром образцов под световым ^{микроскопом10}. С введением конфокальной лазерной микроскопии также стало возможным получать изображения 3D-расположения хлоропластов в неповрежденных или неподвижных листьях4,11,12. Эти методы визуализации значительно помогают понять движение хлоропласта, предоставляя важную качественную информацию. Количественная оценка позиционирования хлоропластов (например, в процентах от хлоропластов в периклинальном или антиклинальном положении на этих изображениях или в процентном отношении площади, покрытой хлоропластами, на общую поверхность клетки) также возможна, но довольно трудоемка, особенно если она проводится с интервалами, необходимыми для фиксации быстрых изменений в ^{позиционировании10,8} . Самый простой способ показать, способны ли адаптированные к темноте листья определенного вида или мутантов перемещать хлоропласт в реакцию избегания, – это покрыть большую часть площади листа, чтобы держать хлоропласты в темноте, подвергая полоску листа высокому освещению. После минимум 20 минут воздействия высокого освещения хлоропласты в открытой области переместятся в положение избегания, и открытая полоса будет заметно светлее по цвету, чем остальная часть листа. Это верно для дикого типа A. thaliana, но не для некоторых мутантов движения хлоропластов, описанных более подробно ^позже13. Этот метод и его модификации (например, изменение того, какие части листа подвергаются воздействию, изменение интенсивности света) полезны для скрининга большого количества мутантов и выявления нулевых мутантов, которые не имеют способности проявлять реакцию избегания или накопления, либо и то, и другое. Однако он не дает информации о динамических изменениях в движении хлоропластов.

Напротив, метод, описанный здесь, позволяет количественно оценить движение хлоропластов в неповрежденных листьях, используя изменения в пропускании света через лист в качестве прокси для общего движения хлоропласта: в условиях, когда хлоропласты распространяются в клетках мезофилла в реакции накопления, через лист пропускается меньше света, чем когда многие хлоропласты находятся в реакции избегания, позиционируются вдоль антиклинальных клеточных стенок. Следовательно, изменения в передаче могут быть использованы в качестве прокси для общего движения хлоропласта в ^{листьях14}. Детали прибора описаны в другом месте (см. Дополнительный файл), но в основном прибор использует синий свет для запуска движения хлоропласта и измеряет, сколько красного света проходит через этот лист через заданные интервалы. Совсем недавно была описана модификация этой системы, в которой используется модифицированный 96-луночный считыватель микропластин, синий светодиод, компьютер и инкубатор с контролируемой ^{температурой15}.

Возможность использования комбинации методов, включая оптическую оценку листьев для скрининга с последующим измерением динамических изменений в передаче и использованием микроскопии, в значительной степени помогла нам понять как основные механизмы, так и физиологическое/экологическое значение движения хлоропластов. Например, это привело к обнаружению и характеристике различных мутантов, которые нарушены в конкретных аспектах своих движений. Например, мутантам A. thaliana phot 1 не хватает способности накапливать свои хлоропласты при слабом освещении, в то время как мутантам phot 2 не хватает способности выполнять реакцию избегания. Эти фенотипы обусловлены нарушением двух соответствующих рецепторов синего света16,17,18. Напротив, мутанты chup1 не обладают способностью образовывать правильные актиновые нити вокруг хлоропластов, которые необходимы для перемещения хлоропластов в желаемое положение внутри ^{клетки11,19}. В дополнение к мутантным исследованиям, исследователи оценили влияние различных ингибиторов на движение хлоропласта, чтобы прояснить механистические аспекты процесса. Например, химические вещества, такие как _H2O2 и различные антиоксиданты, были использованы для исследования влияния этой сигнальной молекулы на движение хлоропласта20. Различные ингибиторы были использованы для выяснения роли кальция в движении ^{хлоропластов21}. В дополнение к тому, чтобы помочь раскрыть механизмы движения хлоропластов, эти методы могут быть использованы для сравнения движения хлоропластов у различных видов или мутантов, выращенных в разных условиях, в попытке понять экологический и эволюционный контекст этого поведения. Например, было показано, что степень воздействия различных мутаций в пути движения хлоропласта зависит от условий ^{роста7,9}, и что адаптированные к солнцу растения, по-видимому, не сильно перемещают свои хлоропласты. Напротив, движение очень важно для теневых растений10,22,23.

В данной методической работе, ориентированной на модель растения A. thaliana, описывается, как использовать передающее устройство, которое является обновленной версией ранее разработанного ^{прибора9}. Хотя этот инструмент не является коммерчески доступным, люди с базовым пониманием электроники или с помощью коллег и студентов по инженерии или физике смогут построить инструмент, используя доступные детали и следуя подробным инструкциям (см. Дополнительный файл). Платформа с открытым исходным кодом, используемая для создания инструмента, имеет обширную веб-поддержку и форум сообщества, который предлагает помощь в случае возникновения ^{проблем24}.

Протокол фокусируется на том, как использовать инструмент для определения изменений в передаче листьев в стандартном исследовательском прогоне, который подвергает лист широкому диапазону условий освещения и захватывает темные, аккумуляционные и избегающие реакции A. thaliana. Эти прогоны могут быть изменены в зависимости от цели эксперимента и могут быть использованы с большинством видов растений. В статье приведены примеры передачи данных дикого типа A. thaliana и нескольких мутантов и показано, как в дальнейшем анализировать данные.