Summary

葉透過の変化を用いて、シロイヌナズナの葉緑体運動を調べる

Published: July 14, 2021
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Summary

多くの植物種は、光吸収を最適化するために葉芽細胞の位置を変更します。このプロトコルは、シ ロイヌナズナ の葉緑体の動きを、葉を介した光の伝達の変化をプロキシとして使用して、簡単で自家製の楽器を使用して調べる方法を説明します。

Abstract

葉の葉の葉芽球運動は、光抑制を最小限に抑え、特定の条件下で成長を増加させるのに役立つものが示されている。葉の位置を研究することによって葉芽球の動きについて多くを学ぶことができますが、例えば、共焦点蛍光顕微鏡検査は、このタイプの顕微鏡へのアクセスが制限されています。このプロトコルは葉の伝達の変化を葉緑体運動のプロキシとして使用する方法を記述する。光のインターセプトを最大化するために葉芽が広がると、伝達は低くなります。光を避けるために葉膜が反柱状細胞壁に向かって移動すると、透過が高くなります。このプロトコルは、簡単な、家庭製の楽器を使用して、葉を異なる青色光強度に公開し、リーフ伝送の動的変化を定量化する方法を説明します。このアプローチにより、研究者は、異なる種および突然変異体における葉芽細胞の動きを定量的に記述し、化学物質や環境要因がそれに及ぼす影響を研究したり、新しい変異体のスクリーニングを行ったりして、光知覚から葉芽細胞の動きにつながる過程で欠けている成分を特定することができます。

Introduction

光合成、植物の成長、開発には光が不可欠です。これは、光強度が季節や日の間に変化するだけでなく、クラウドカバーに応じて迅速かつ予測不可能な方法で変化するので、最もダイナミックな不生物的要因の1つです。葉のレベルでは、光の強度はまた、周囲の植生の密度と性質と植物自身のキャノピーの影響を受けます。植物が可変光条件下で光の遮断を最適化することを可能にする重要なメカニズムの1つは、青色光刺激に応答して動く葉芽体の能力である低光条件下では、葉葉体はいわゆる蓄積応答で光に垂直に広がり(終円細胞壁に沿って)、光のインターセプトを最大化し、光合成を最大化する。高い光条件下では、葉膜はいわゆる回避応答で反クリナル細胞壁に向かって移動し、光の傍受と光抑制の危険性を最小限に抑えます。多くの種では、葉芽細胞はまた、蓄積および回避位置とは異なり、しばしばそれらの2つの間の中間である特定の暗い位置を仮定する3,4。葉芽球体の動きは葉短期的なストレス耐性のために重要であるだけでなく、植物の成長と生殖の成功、特に可変光条件下での増殖と生殖の成功のために、様々な研究が示されている8,9

光顕微鏡1を用いた特定の生きた標本(例えば、藻類やの薄葉植物など)では、葉緑体の動きがリアルタイムで容易に観察される。しかし、ほとんどの葉の葉の動きを研究するには、光顕微鏡10でサンプルを見る前に葉芽球運動、化学固定、および断面の調製を誘導するための前処理が必要です。共焦点レーザー顕微鏡の導入により、葉巻の3D配置を無傷または固定葉4,11,12に画像化することも可能になりました。これらのイメージング技術は、重要な定性的情報を提供することで、葉芽細胞の運動の理解を大いに助ける。クロロプラスト位置の定量化(例えば、これらの画像のペリクリンまたはアンチクリナル位置の葉芽細胞の割合、または全細胞表面あたりの葉ロプラストで覆われた領域の割合)も可能であるが、特に位置の急激な変化を捉えるために必要な間隔で行われる場合は非常に時間がかかる10,8.特定の種または突然変異体の暗く適合した葉が回避応答に葉緑体の動きが可能かどうかを示す最も簡単な方法は、葉のストリップを高光にさらしながら、葉の領域のほとんどを覆って葉の領域を暗闇の中に保つことです。最低20分の高光露光の後、露出した領域の葉緑体は回避位置に移動し、露出したストリップは葉の残りの部分よりも目に見えて色が明るくなります。これは野生のA型thalianaには当てはまりますが、後で詳細に説明する葉芽球運動変異体の一部には当てはまりません。この方法およびその修飾(例えば、葉のどの部分が露出しているか逆転、光強度を変化させる)は、多数の突然変異体をスクリーニングし、回避または蓄積応答または両方を示す能力を欠くヌル突然変異体を同定するのに有用である。しかし、葉芽球運動の動的変化に関する情報は提供しない。

対照的に、ここで説明する方法は、葉を通る光透過の変化を全体的な葉緑体運動の代理として使用して無傷の葉の葉の葉緑体運動を定量化することを可能にする:葉緑体が蓄積応答で中胞細胞に広がる条件下で、多くの葉緑体が回避応答している場合よりも葉を通してより少ない光が送出される。 反皮細胞壁に沿って自分自身を配置します。したがって、送信の変化は、葉14における全体的な葉葉芽細胞運動のプロキシとして使用することができる。器械の詳細は他の場所で説明されている( 補足ファイルを参照)、基本的には、器具は青い光を使用して葉緑体の動きをトリガし、設定された間隔でその葉を通してどれだけの赤い光が透過するかを測定する。さらに最近では、このシステムの改変が記載されており、これは、改変された96ウェルマイクロプレートリーダー、青色LED、コンピュータ、および温度制御インキュベーター15を使用する。

スクリーニングのための葉の光学的評価を含む方法の組み合わせを使用するオプションは、伝達の動的変化と顕微鏡の使用を測定することによって、基底のメカニズムと葉葉芽細胞運動の生理学的/生態学的意義の両方の理解を大いに助けました。例えば、それは、その動きの特定の側面で損なわれている様々な突然変異体の発見と特徴付けにつながった。例えば、A.タリアナphot1変異体は低光で葉葉芽を蓄積する能力を欠いているが、phot2変異体は回避反応を行う能力を欠いている。これらの型は、2つの青色光受容体16,17,18における障害によるものである。対照的に、chup1変異体は、葉巻をcell11,19内の所望の位置に移動させるために不可欠な葉巻の周りに適切なアクチンフィラメントを形成する能力を欠いている。変異体研究に加えて、研究者は、プロセスの機械学的側面を解明するために葉芽球運動に対する様々な阻害剤の影響を評価しました。例えば、H2O2および種々の抗酸化物質などの化学物質を用いて、このシグナル伝達分子が葉ロプラスト運動20に及ぼす影響を調べた。葉芽細胞運動21におけるカルシウムの役割を解明するために種々の阻害剤が用いられた。これらの方法は、葉芽球運動のメカニズムを明らかにするのに役立つだけでなく、この行動の生態学的および進化的文脈を理解するために、異なる条件で成長した様々な種または突然変異体における葉ロプラストの動きを比較するために使用することができる。例えば、葉葉芽球の移動経路における様々な突然変異の影響の程度は、成長条件依存していること7,9、そして太陽に適応した植物が葉ロプラストをあまり動かさないように見えることがわかっています。対照的に、動きは、木陰植物102223のために非常に重要です。

この方法論文は、モデルプラント A.thalianaに焦点を当て、以前に開発された機器9の更新版である伝送装置の使用方法を説明しています。この機器は市販されていませんが、エレクトロニクスの基本的な理解や工学や物理学の同僚や学生の助けを借りて、手頃な価格の部品を使用して、詳細な指示に従って楽器を構築することができます( 補足ファイルを参照)。機器を構築するために使用されるオープンソースプラットフォームは、広範なWebサポートと問題が発生した場合のヘルプを提供するコミュニティフォーラムを持っています24

このプロトコルは、幅広い光の条件にリーフを露出させ、A.タリアナの暗い、蓄積、および回避反応を捕捉する標準的な探索的実行における葉の伝達の変化を決定するために装置を使用する方法 に焦点を当てています。これらのランは、実験の目的に応じて変更することができ、ほとんどの植物種で使用することができます。本論文は 、A.タリアナ 野生型およびいくつかの変異体の伝送データの例を提供し、さらにデータを分析する方法を示す。

Protocol

1. 走行用の葉の準備 8 A.タリアナ 植物を暗闇の中に一晩置き(>6 hはほとんどの種で働く)、葉芽が暗い位置に移動することを保証します。すべてのレプリカは、同等の転送値で始まります。 あるいは、8つの完全な葉を底に湿ったろ過紙を入れたペトリ皿に入れ、ペトリ皿を閉じて、アルミホイルで包みます。 2. 伝送装置が動作するかどうかのテス…

Representative Results

伝送装置の異なる部分を 図1に示します。マイクロコントローラはデバイスの制御ユニットであり、黒い葉クリップで固定された葉が発生している光の状態を制御し、受け取った光伝送データを格納します(図1A、B)。計測器の制御ユニットのクローズアップには、オン/オフボタン、データストレージ機能用のSDカード、Bluetoothシールド(…

Discussion

デバイスは非常に使いやすいですが、LEDとフォトトランジスタの位置がリーフクリップからリーフクリップにわずかに異なる場合があるため、伝送デバイスの各リーフクリップの設定を独立して較正することが重要です。LEDとフォトトランジスタが安定して挿入されていることを確認し、データがオフに見える場合はキャリブレーションを再確認します。デバイスに水を入れないようにして?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

資金はフィスケ賞とウェルズリーカレッジ教員賞によって提供されました。

Materials

Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette Any
Petri dish Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water

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Cite This Article
Königer, M., Knapp, A., Futami, L., Kohler, S. Using Changes in Leaf Transmission to Investigate Chloroplast Movement in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (173), e62881, doi:10.3791/62881 (2021).

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