葉透過の変化を用いて、シロイヌナズナの葉緑体運動を調べる

光合成、植物の成長、開発には光が不可欠です。これは、光強度が季節や日の間に変化するだけでなく、クラウドカバーに応じて迅速かつ予測不可能な方法で変化するので、最もダイナミックな不生物的要因の1つです。葉のレベルでは、光の強度はまた、周囲の植生の密度と性質と植物自身のキャノピーの影響を受けます。植物が可変光条件下で光の遮断を最適化することを可能にする重要なメカニズムの1つは、青色光刺激に応答して動く葉芽体の能力^である。低光条件下では、葉葉体はいわゆる蓄積応答で光に垂直に広がり(終円細胞壁に沿って)、光のインターセプトを最大化し、光合成を最大化する。高い光条件下では、葉膜はいわゆる回避応答で反クリナル細胞壁に向かって移動し、光の傍受と光抑制の危険性を最小限に抑えます。多くの種では、葉芽細胞はまた、蓄積および回避位置とは異なり、しばしばそれらの2^つの間の中間である特定の暗い位置を仮定する^3,4。葉芽球体の動きは葉^の短期的なストレス耐性のために重要^{であるだけでなく、植物}の成長と生殖の成功、特に可変光条件下での増殖と生殖の成功のために、様々な研究が示されている^8,9。

光顕微鏡1を用いた特定の生きた標本(例えば、藻類や葉の薄葉植物など)では、葉緑体の動きがリアルタイムで容易に観察^される。しかし、ほとんどの葉の葉の動きを研究するには、光顕微鏡¹⁰でサンプルを見る前に葉芽球運動、化学固定、および断面の調製を誘導するための前処理が必要です。共焦点レーザー顕微鏡の導入により、葉巻の3D配置を無傷または^{固定葉4,11,12}に画像化することも可能になりました。これらのイメージング技術は、重要な定性的情報を提供することで、葉芽細胞の運動の理解を大いに助ける。クロロプラスト位置の定量化(例えば、これらの画像のペリクリンまたはアンチクリナル位置の葉芽細胞の割合、または全細胞表面あたりの葉ロプラストで覆われた領域の割合)も可能であるが、特に位置の急激な変化を捉えるために必要な間隔で行われる場合は非常に時間がかかる^10,8.特定の種または突然変異体の暗く適合した葉が回避応答に葉緑体の動きが可能かどうかを示す最も簡単な方法は、葉のストリップを高光にさらしながら、葉の領域のほとんどを覆って葉の領域を暗闇の中に保つことです。最低20分の高光露光の後、露出した領域の葉緑体は回避位置に移動し、露出したストリップは葉の残りの部分よりも目に見えて色が明るくなります。これは野生のA型thalianaには当てはまりますが、後で詳細に説明する葉芽球運動変異体の一部には当てはま^{りません。}この方法およびその修飾(例えば、葉のどの部分が露出しているか逆転、光強度を変化させる)は、多数の突然変異体をスクリーニングし、回避または蓄積応答または両方を示す能力を欠くヌル突然変異体を同定するのに有用である。しかし、葉芽球運動の動的変化に関する情報は提供しない。

対照的に、ここで説明する方法は、葉を通る光透過の変化を全体的な葉緑体運動の代理として使用して無傷の葉の葉の葉緑体運動を定量化することを可能にする:葉緑体が蓄積応答で中胞細胞に広がる条件下で、多くの葉緑体が回避応答している場合よりも葉を通してより少ない光が送出される。 反皮細胞壁に沿って自分自身を配置します。したがって、送信の変化は、葉¹⁴における全体的な葉葉芽細胞運動のプロキシとして使用することができる。器械の詳細は他の場所で説明されている( 補足ファイルを参照)、基本的には、器具は青い光を使用して葉緑体の動きをトリガし、設定された間隔でその葉を通してどれだけの赤い光が透過するかを測定する。さらに最近では、このシステムの改変が記載されており、これは、改変された96ウェルマイクロプレートリーダー、青色LED、コンピュータ、および温度制御インキュベー^ター15を使用する。

スクリーニングのための葉の光学的評価を含む方法の組み合わせを使用するオプションは、伝達の動的変化と顕微鏡の使用を測定することによって、基底のメカニズムと葉葉芽細胞運動の生理学的/生態学的意義の両方の理解を大いに助けました。例えば、それは、その動きの特定の側面で損なわれている様々な突然変異体の発見と特徴付けにつながった。例えば、A.タリアナphot1変異体は低光で葉葉芽を蓄積する能力を欠いているが、phot2変異体は回避反応を行う能力を欠いている。これらの型は、2つの青色光受容体^16,17,18における障害によるものである。対照的に、chup1変異体は、葉巻を^cell11,19内の所望の位置に移動させるために不可欠な葉巻の周りに適切なアクチンフィラメントを形成する能力を欠^いている。変異体研究に加えて、研究者は、プロセスの機械学的側面を解明するために葉芽球運動に対する様々な阻害剤の影響を評価しました。例えば、_H2O2および種々の抗酸化物質などの化学物質を用いて、このシグナル伝達分子が葉ロプラスト運動²⁰に及ぼす影響を調べた。葉芽細胞運動²¹におけるカルシウムの役割を解明するために種々の阻害剤が用いられた。これらの方法は、葉芽球運動のメカニズムを明らかにするのに役立つだけでなく、この行動の生態学的および進化的文脈を理解するために、異なる条件で成長した様々な種または突然変異体における葉ロプラストの動きを比較するために使用することができる。例えば、葉葉芽球の移動経路における様々な突然変異の影響の程度は、成長条件^に依存していること^7,9、そして太陽に適応した植物が葉ロプラストをあまり動かさないように見えることがわかっています。対照的に、動きは、木陰植物^10、22、23のために非常に重要です。

この方法論文は、モデルプラント A.thalianaに焦点を当て、以前に開発された機器⁹の更新版である伝送装置の使用方法を説明しています。この機器は市販されていませんが、エレクトロニクスの基本的な理解や工学や物理学の同僚や学生の助けを借りて、手頃な価格の部品を使用して、詳細な指示に従って楽器を構築することができます( 補足ファイルを参照)。機器を構築するために使用されるオープンソースプラットフォームは、広範なWebサポートと問題が発生した場合のヘルプを提供するコミュニティフォーラムを持っています²⁴。

このプロトコルは、幅広い光の条件にリーフを露出させ、A.タリアナの暗い、蓄積、および回避反応を捕捉する標準的な探索的実行における葉の伝達の変化を決定するために装置を使用する方法 に焦点を当てています。これらのランは、実験の目的に応じて変更することができ、ほとんどの植物種で使用することができます。本論文は 、A.タリアナ 野生型およびいくつかの変異体の伝送データの例を提供し、さらにデータを分析する方法を示す。