Verwendung von Veränderungen in der Blattübertragung zur Untersuchung der Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana

Licht ist essentiell für die Photosynthese, das Pflanzenwachstum und die Entwicklung. Es ist einer der dynamischsten abiotischen Faktoren, da sich die Lichtintensitäten nicht nur im Laufe einer Saison oder eines Tages ändern, sondern auch schnell und unvorhersehbar je nach Wolkendecke. Auf Blattebene werden die Lichtintensitäten auch durch die Dichte und Beschaffenheit der umgebenden Vegetation und des pflanzeneigenen Blätterdachs beeinflusst. Ein wichtiger Mechanismus, der es Pflanzen ermöglicht, das Abfangen von Licht unter variablen Lichtverhältnissen zu optimieren, ist die Fähigkeit von Chloroplasten, sich als Reaktion auf blaue Lichtreize zu ^bewegen1,2. Bei schlechten Lichtverhältnissen breiten sich Chloroplasten senkrecht zum Licht (entlang der periclinalen Zellwände) in einer sogenannten Akkumulationsreaktion aus, wodurch der Lichteinfang und damit die Photosynthese maximiert wird. Unter hohen Lichtverhältnissen bewegen sich Chloroplasten in einer sogenannten Vermeidungsreaktion auf die antiklinale Zellwand zu, wodurch das Abfangen von Licht und die Gefahr der Photoinhibition minimiert werden. Bei vielen Arten nehmen Chloroplasten auch eine spezifische dunkle Position ein, die sich von den Akkumulations- und Vermeidungspositionen unterscheidet und oft zwischen diesen beiden ^liegt3,4. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Chloroplastenbewegung nicht nur für die kurzfristige Stresstoleranz der Blätter ^{wichtig ist5,6,7}, sondern auch für das Wachstum und den Fortpflanzungserfolg von Pflanzen, insbesondere unter variablen Lichtverhältnissen8,9.

Die Chloroplastenbewegung wird bei bestimmten lebenden Exemplaren (z. B. Algen oder dünnblättrigen Pflanzen wie Elodea) mittels Lichtmikroskopie in Echtzeit ^beobachtet1. Die Untersuchung der Chloroplastenbewegung in den meisten Blättern erfordert jedoch eine Vorbehandlung, um die Chloroplastenbewegung, die chemische Fixierung und die Vorbereitung von Querschnitten zu induzieren, bevor die Proben unter einem Lichtmikroskop betrachtet ^werden10. Mit der Einführung der konfokalen Lasermikroskopie wurde es auch möglich, die 3D-Anordnung von Chloroplasten in intakten oder festen Blättern abzubilden4,11,12. Diese bildgebenden Verfahren helfen dem Verständnis der Chloroplastenbewegung erheblich, indem sie wichtige qualitative Informationen liefern. Die Quantifizierung der Chloroplastenpositionierung (z. B. als Prozentsatz der Chloroplasten in den periclinalen oder antiklinalen Positionen in diesen Bildern oder als Prozentsatz der von Chloroplasten bedeckten Fläche pro Gesamtzelloberfläche) ist ebenfalls möglich, aber ziemlich zeitaufwendig, insbesondere wenn sie in den Intervallen durchgeführt wird, die erforderlich sind, um schnelle Positionsänderungen zu ^erfassen10,8 . Der einfachste Weg, um zu zeigen, ob dunkel angepasste Blätter einer bestimmten Spezies oder Mutanten in der Lage sind, Chloroplastenbewegung in die Vermeidungsreaktion zu versetzen, besteht darin, den größten Teil der Blattfläche abzudecken, um die Chloroplasten im Dunkeln zu halten, während ein Streifen des Blattes hohem Licht ausgesetzt wird. Nach mindestens 20 Minuten hoher Lichteinwirkung haben sich die Chloroplasten im exponierten Bereich in die Vermeidungsposition bewegt, und der freiliegende Streifen ist sichtbar heller als der Rest des Blattes. Dies gilt für wilden Typ A. thaliana, aber nicht für einige der Chloroplasten-Bewegungsmutanten, die später ausführlicher beschrieben ^werden13. Diese Methode und modifikationen davon (z. B. Umkehrung der exponierten Teile des Blattes, Änderung der Lichtintensitäten) sind nützlich, um eine große Anzahl von Mutanten zu screenen und Nullmutanten zu identifizieren, denen entweder die Fähigkeit fehlt, eine Vermeidungs- oder Akkumulationsreaktion oder beides zu zeigen. Es liefert jedoch keine Informationen über die dynamischen Veränderungen in der Chloroplastenbewegung.

Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene Methode die Quantifizierung der Chloroplastenbewegung in intakten Blättern unter Verwendung von Änderungen der Lichtdurchlässigkeit durch ein Blatt als Proxy für die gesamte Chloroplastenbewegung: Unter Bedingungen, unter denen Chloroplasten in der Akkumulationsreaktion in den Mesophyllzellen ausgebreitet werden, wird weniger Licht durch das Blatt übertragen, als wenn viele Chloroplasten in einer Vermeidungsreaktion sind. positionieren sich entlang der antiklinalen Zellwände. Daher können Änderungen in der Übertragung als Proxy für die gesamte Chloroplastenbewegung in Blättern verwendet ^werden14. Die Details des Instruments sind an anderer Stelle beschrieben (siehe Ergänzende Datei), aber im Grunde verwendet das Instrument blaues Licht, um die Chloroplastenbewegung auszulösen und misst, wie viel rotes Licht in festgelegten Intervallen durch dieses Blatt übertragen wird. In jüngerer Zeit wurde eine Modifikation dieses Systems beschrieben, das einen modifizierten 96-Well-Mikroplattenleser, eine blaue LED, einen Computer und einen temperaturgesteuerten ^Inkubator15 verwendet.

Die Möglichkeit, eine Kombination von Methoden zu verwenden, einschließlich der optischen Beurteilung von Blättern für das Screening, gefolgt von der Messung dynamischer Transmissionsänderungen und der Verwendung von Mikroskopie, hat unser Verständnis sowohl der zugrunde liegenden Mechanismen als auch der physiologischen / ökologischen Bedeutung der Chloroplastenbewegung erheblich erleichtert. Zum Beispiel führte es zur Entdeckung und Charakterisierung verschiedener Mutanten, die in bestimmten Aspekten ihrer Bewegungen beeinträchtigt sind. Zum Beispiel fehlt A. thaliana phot 1 Mutanten die Fähigkeit, ihre Chloroplasten bei schwachem Licht anzusammeln, während Phot 2 Mutanten nicht in der Lage sind, eine Vermeidungsreaktion durchzuführen. Diese Phänotypen sind auf eine Beeinträchtigung von zwei jeweiligen Blaulichtrezeptoren zurückzuführen16,17,18. Im Gegensatz dazu fehlt den Chup1-Mutanten die Fähigkeit, geeignete Aktinfilamente um die Chloroplasten herum zu bilden, die unerlässlich sind, um die Chloroplasten in die gewünschte Position innerhalb einer Zelle zu ^bringen11,19. Zusätzlich zu Mutantenstudien haben Forscher die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren auf die Chloroplastenbewegung bewertet, um die mechanistischen Aspekte des Prozesses aufzuklären. Zum Beispiel wurden Chemikalien wie _H2O2 und verschiedene Antioxidantien verwendet, um die Auswirkungen dieses Signalmoleküls auf die Chloroplastenbewegung ^{zu untersuchen20}. Verschiedene Inhibitoren wurden verwendet, um die Rolle von Calcium bei der Chloroplastenbewegung ^{aufzuklären21}. Diese Methoden helfen nicht nur, die Mechanismen der Chloroplastenbewegung aufzudecken, sondern können auch verwendet werden, um die Chloroplastenbewegung in verschiedenen Arten oder Mutanten, die unter verschiedenen Bedingungen angebaut werden, zu vergleichen, um den ökologischen und evolutionären Kontext dieses Verhaltens zu verstehen. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass das Ausmaß der Auswirkungen verschiedener Mutationen im Chloroplasten-Bewegungsweg von den Wachstumsbedingungen ^abhängt7,9 und dass sonnenangepasste Pflanzen ihre Chloroplasten nicht viel zu bewegen scheinen. Im Gegensatz dazu ist Bewegung bei Schattenpflanzen sehr wichtig10,22,23.

Dieses Methodenpapier, das sich auf die Modellpflanze A. thaliana konzentriert, beschreibt die Verwendung eines Übertragungsgeräts, das eine aktualisierte Version eines zuvor entwickelten Instruments ^ist9. Obwohl dieses Instrument nicht im Handel erhältlich ist, können Personen mit einem grundlegenden Verständnis der Elektronik oder der Hilfe von Ingenieur- oder Physikkollegen und Studenten das Instrument aus erschwinglichen Teilen und nach den detaillierten Anweisungen bauen (siehe Ergänzende Datei). Die Open-Source-Plattform, die zum Aufbau des Instruments verwendet wurde, verfügt über umfangreiche Webunterstützung und ein Community-Forum, das Hilfe bei Problemen ^bietet24.

Das Protokoll konzentriert sich darauf, wie das Instrument verwendet werden kann, um Änderungen in der Blattübertragung in einem Standard-Erkundungslauf zu bestimmen, der ein Blatt einer Vielzahl von Lichtbedingungen aussetzt und die Dunkel-, Akkumulations- und Vermeidungsreaktionen von A. thaliana erfasst. Diese Läufe können je nach Ziel des Experiments modifiziert und bei den meisten Pflanzenarten verwendet werden. Das Papier liefert Beispiele für Übertragungsdaten von A. thaliana Wildtype und mehreren Mutanten und zeigt, wie die Daten weiter analysiert werden können.