Veranderingen in bladtransmissie gebruiken om chloroplastbeweging in Arabidopsis thaliana te onderzoeken

Licht is essentieel voor fotosynthese, plantengroei en ontwikkeling. Het is een van de meest dynamische abiotische factoren omdat lichtintensiteiten niet alleen veranderen in de loop van een seizoen of dag, maar ook snel en op onvoorspelbare manieren, afhankelijk van het wolkendek. Op bladniveau worden de lichtintensiteiten ook beïnvloed door de dichtheid en aard van de omringende vegetatie en het eigen bladerdak van de plant. Een belangrijk mechanisme dat planten in staat stelt om de lichtonderschepping onder variabele lichtomstandigheden te optimaliseren, is het vermogen van chloroplasten om te bewegen als reactie op prikkels in blauw ^licht1,2. Bij weinig licht verspreiden chloroplasten zich loodrecht op het licht (langs de periclinale celwanden) in een zogenaamde accumulatierespons, waardoor de lichtonderschepping en dus de fotosynthese worden gemaximaliseerd. Onder hoge lichtomstandigheden bewegen chloroplasten zich naar de anticlinale celwand in een zogenaamde vermijdingsreactie, waardoor lichtonderschepping en het gevaar van foto-inhibitie worden geminimaliseerd. Bij veel soorten nemen chloroplasten ook een specifieke donkere positie aan, die verschilt van de accumulatie- en vermijdingsposities en vaak intermediair is tussen die ^twee3,4. Verschillende studies hebben aangetoond dat chloroplastbeweging niet alleen belangrijk is voor de stresstolerantie op korte termijn van ^{bladeren5,6,7}, maar ook voor de groei en het voortplantingssucces van planten, vooral onder variabele ^{lichtomstandigheden8,9}.

Chloroplastbeweging wordt gemakkelijk in realtime waargenomen in bepaalde levende exemplaren (bijv. Algen of dunbladige planten zoals Elodea) met behulp van lichtmicroscopie1. Het bestuderen van chloroplastbeweging in de meeste bladeren vereist echter een voorbehandeling om chloroplastbeweging, chemische fixatie en voorbereiding van doorsneden te induceren voordat de monsters onder een lichtmicroscoop ^{worden bekeken10}. Met de introductie van confocale lasermicroscopie werd het ook mogelijk om de 3D-opstelling van chloroplasten in intacte of vaste bladeren in beeld te brengen4,11,12. Deze beeldvormingstechnieken helpen het begrip van chloroplastbewegingen enorm door belangrijke kwalitatieve informatie te verstrekken. Het kwantificeren van chloroplastpositionering (bijvoorbeeld als percentage chloroplasten in de periclinale of anticlinale posities in deze afbeeldingen of het percentage van het gebied dat door chloroplasten per totaal celoppervlak wordt bedekt) is ook mogelijk, maar vrij tijdrovend, vooral als het wordt uitgevoerd met de intervallen die nodig zijn om snelle veranderingen in positionering vast te ^leggen10,8 . De eenvoudigste manier om aan te tonen of donker-aangepaste bladeren van een bepaalde soort of mutanten in staat zijn tot chloroplastbeweging in de vermijdingsreactie, is door het grootste deel van het gebied van een blad te bedekken om de chloroplasten in het donker te houden terwijl een strook van het blad wordt blootgesteld aan veel licht. Na een blootstelling van minimaal 20 minuten aan hoog licht zijn de chloroplasten in het blootgestelde gebied in de vermijdingspositie verplaatst en zal de blootgestelde strip zichtbaar lichter van kleur zijn dan de rest van het blad. Dit geldt voor wild type A. thaliana, maar niet voor sommige van de chloroplastbewegingsmutanten die later in meer detail worden ^beschreven13. Deze methode en wijzigingen ervan (bijvoorbeeld het omkeren van welke delen van het blad worden blootgesteld, veranderende lichtintensiteiten) zijn nuttig voor het screenen van grote aantallen mutanten en om nulmutanten te identificeren die niet het vermogen hebben om een vermijdings- of accumulatierespons of beide te vertonen. Het geeft echter geen informatie over de dynamische veranderingen in chloroplastbewegingen.

Daarentegen maakt de hier beschreven methode de kwantificering van chloroplastbeweging in intacte bladeren mogelijk met behulp van veranderingen in lichttransmissie door een blad als een proxy voor de algehele chloroplastbeweging: onder omstandigheden waarin chloroplasten in de mesofylcellen worden verspreid in de accumulatierespons, wordt er minder licht door het blad doorgelaten dan wanneer veel chloroplasten in een vermijdingsreactie zijn, zichzelf positionerend langs de anticlinale celwanden. Daarom kunnen veranderingen in transmissie worden gebruikt als een proxy voor de algehele chloroplastbeweging in ^bladeren14. De details van het instrument worden elders beschreven (zie Aanvullend bestand), maar in principe gebruikt het instrument blauw licht om chloroplastbewegingen te activeren en meet het hoeveel rood licht er met bepaalde intervallen door dat blad wordt doorgelaten. Meer recent is een wijziging van dit systeem beschreven, dat gebruik maakt van een gemodificeerde 96-well microplaatlezer, een blauwe LED, een computer en een temperatuurgecontroleerde ^incubator15.

De optie om een combinatie van methoden te gebruiken, waaronder de optische beoordeling van bladeren voor screening, gevolgd door het meten van dynamische veranderingen in transmissie en het gebruik van microscopie, heeft ons inzicht in zowel de onderliggende mechanismen als de fysiologische / ecologische betekenis van chloroplastbeweging enorm geholpen. Het leidde bijvoorbeeld tot de ontdekking en karakterisering van verschillende mutanten, die zijn aangetast in specifieke aspecten van hun bewegingen. A. thaliana phot 1-mutanten missen bijvoorbeeld het vermogen om hun chloroplasten bij weinig licht te accumuleren, terwijl phot 2-mutanten niet het vermogen hebben om een vermijdingsreactie uit te voeren. Deze fenotypen zijn te wijten aan een aantasting van twee respectievelijke blauwlichtreceptoren16,17,18. Chup1-mutanten daarentegen missen het vermogen om de juiste actinefilamenten rond de chloroplasten te vormen die essentieel zijn om de chloroplasten in de gewenste positie in een cel te ^brengen11,19. Naast mutantenstudies hebben onderzoekers de effecten van verschillende remmers op chloroplastbeweging beoordeeld om de mechanistische aspecten van het proces op te helderen. Chemicaliën zoals _H2O2 en verschillende antioxidanten werden bijvoorbeeld gebruikt om de effecten van dit signaalmolecuul op chloroplastbeweging20 te onderzoeken. Verschillende remmers werden gebruikt om de rol van calcium in chloroplastbewegingen op te ^helderen21. Naast het helpen ontdekken van de mechanismen van chloroplastbeweging, kunnen deze methoden worden gebruikt om chloroplastbewegingen te vergelijken bij verschillende soorten of mutanten die in verschillende omstandigheden zijn gekweekt in een poging om de ecologische en evolutionaire context van dit gedrag te begrijpen. Zo is aangetoond dat de omvang van de effecten van verschillende mutaties in de chloroplastbewegingsroute afhankelijk is van de ^{groeiomstandigheden7,9}, en dat zongecorrigeerde planten hun chloroplasten niet veel lijken te bewegen. Beweging is daarentegen erg belangrijk voor schaduwplanten10,22,23.

Dit methodedocument, gericht op de modelfabriek A. thaliana, beschrijft hoe een transmissieapparaat te gebruiken dat een bijgewerkte versie is van een eerder ontwikkeld ^instrument9. Hoewel dit instrument niet commercieel beschikbaar is, kunnen mensen met een basiskennis van elektronica of de hulp van technische of natuurkundige collega’s en studenten het instrument bouwen met behulp van betaalbare onderdelen en het volgen van de gedetailleerde instructies (zie Aanvullend bestand). Het open-sourceplatform dat wordt gebruikt om het instrument te bouwen, heeft uitgebreide webondersteuning en een communityforum dat hulp biedt als zich problemen ^voordoen24.

Het protocol richt zich op het gebruik van het instrument om veranderingen in bladoverdracht te bepalen in een standaard verkennende run die een blad blootstelt aan een breed scala aan lichtomstandigheden en de donkere, accumulatie- en vermijdingsreacties van A. thaliana vangt. Deze runs kunnen worden aangepast afhankelijk van het doel van het experiment en kunnen bij de meeste plantensoorten worden gebruikt. Het artikel geeft voorbeelden van transmissiegegevens van A. thaliana wildtype en verschillende mutanten en laat zien hoe de gegevens verder kunnen worden geanalyseerd.