Измерение временной эволюции наноразмерных материалов с остановленным потоком и малоугловым рассеянием нейтронов

Малоугловое рассеяние нейтронов (SANS) обеспечивает уникальный способ измерения размеров, форм, взаимодействий и организации различных материалов на масштабах длин от ≈1 нм до ≈100 нм ^1,2,3. Современные приборы, в том числе приборы VSANS (очень малоугловое рассеяние нейтронов) с фокусирующими зеркалами, раздвигают границы измерения еще больших масштабов длины до ≈1000 нм ^4,5. В целом, уникальный контраст рассеяния, присущий методам рассеяния нейтронов, дает ряд преимуществ при измерении временной эволюции наноразмерных структур, таких как агрегация компонентов в фармацевтических препаратах⁶, реакции сшивания и гелеобразования в полимерных системах ^7,8, мезокристаллизация мембранных белков^9,10, деградация и развертывание белков^11,12 и рост материалов на основе кремнезема^13,14,15. Уникальный контраст рассеяния делает SANS С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ (TR-SANS) полезным дополнением к другим измерениям на основе остановленного потока.

Методы смешивания с остановленным потоком часто реализуются при малоугловом рассеянии рентгеновских лучей (SAXS)16,17,18,19,20,21, флуоресцентной спектроскопии 22,23,24,25,26 и рассеянии света^{27,28,29,30, 31,32} эксперимента по изучению кинетических процессов на миллисекундных временных масштабах. Важное различие между SANS и SAXS заключается в том, что рассеяние нейтронов является методом неразрушающего определения характеристик, и поэтому SANS можно использовать для измерения одного и того же образца в течение нескольких часов или даже дней без повреждения образца ионизирующим излучением, что может произойти во время экспериментов по рассеянию рентгеновских лучей с более высоким потоком³³. Поскольку повторные измерения SANS не изменят химическую структуру молекулы зонда или образца, эволюция времени может быть изучена, например, без эффектов фотообесцвечивания, что может усложнить измерения кинетики, основанные на флуоресценции^23,24. Кроме того, SANS можно использовать для измерения высококонцентрированных и оптически непрозрачных образцов, которые часто трудно охарактеризовать с помощью методов, основанных на свете, таких как динамическое рассеяние света.

В дополнение к предоставлению структурной информации на наноуровне, SANS может быть использован для исследования локального состава этих структур через изменение контраста плотности длины рассеяния нейтронов. Плотность длины рассеяния (SLD) различных элементов случайным образом изменяется в периодической таблице и изменяется в зависимости от разных изотопов одного и того же элемента. Обычно используемым примером является водород (¹H или H) и дейтерий (²H или D), которые имеют совершенно разные длины рассеяния нейтронов. Таким образом, богатые водородом материалы, такие как поверхностно-активные вещества, липиды, белки, РНК, ДНК и другие полимеры, можно отличить от дейтерированных растворителей с использованием SANS без существенного изменения физических свойств системы. Однако важно отметить, что H/D обмен может влиять на плотность, водородную связь и температуру фазового перехода в образце. Тем не менее, уникальная чувствительность SANS к материалам, богатым водородом, особенно полезна в исследованиях мягкой материи, где интересующие образцы имеют более низкий контраст рассеяния и сигнал в рентгеновских методах, таких как SAXS. Изотопное замещение также делает SANS мощным инструментом для изучения кинетики молекулярного обмена в богатых водородом материалах путем простого смешивания молекул, меченных H и D. Изотопное замещение особенно полезно в системах, где громоздкие флуоресцентные красители больше, чем интересующие молекулы поверхностно-активного вещества или липидов, и могут влиять на кинетику обмена^34,35.

Измерения SANS с временным разрешением выгодны, поскольку измеренная интенсивность зависит от времени, шкалы длины и контраста SLD. Таким образом, эксперименты TR-SANS могут быть разработаны для исследования зависящих от времени изменений в пространственных распределениях и составах образцов. Эти уникальные преимущества SANS привели к важному пониманию кинетических процессов во многих системах мягких материалов, таких как поверхностно-активные вещества 36,37,38, эмульсии 39,40,41, липиды 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ^,50, и полимеры 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. Большинство исследований TR-SANS были сосредоточены на временных масштабах от минут до часов. Тем не менее, многие кинетические процессы, представляющие интерес, происходят на втором временном масштабе и необходимы для понимания основных механизмов. Захват этих ранних временных точек требует, чтобы растворы были быстро смешаны и измерены in situ, в котором смешивание синхронизируется со сбором данных во время рассеяния света с остановившимся потоком 27,28,29,30,31,32, флуоресценции ^{22,23,24,25,26} и рентгеновского излучения 16,17,18,19,20,21 экспериментов. В этой работе описывается использование среды для образцов, предназначенной для быстрого смешивания нескольких жидких образцов и впрыска смеси в ячейку из кварцевого стекла для измерений TR-SANS. Смесительное устройство является адаптацией недавно разработанного капиллярного устройства⁶³ rheoSANS и использует несколько шприцевых насосов и клапанов для управления перемешиванием проб и автоматизации очистки клеток. Подключая шприцевые насосы к ряду клапанов селектора потока, можно многократно смешивать, измерять, промывать и сушить несколько входных потоков для облегчения измерений TR-SANS в секундной шкале времени.

Нынешняя процедура предполагает, что интересующие образцы были идентифицированы и подготовлены. Мы фокусируемся на установке смешивания in situ и методах сбора данных TR-SANS. Данные о рассеянии нейтронов были собраны на приборе VSANS в Центре нейтронных исследований NIST (NCNR); однако эта процедура должна быть применима к другим документам SANS. Читатели, заинтересованные в реализации аналогичных протоколов на других приборах SANS, должны проконсультироваться с местными учеными-приборостроителями, чтобы определить оптимальную конфигурацию прибора для максимизации потока нейтронов в желаемом масштабе длины и масштабе времени, наиболее подходящем для интересующих кинетических процессов. Представленные здесь данные были собраны с использованием конфигурации «белого луча» с высоким потоком на VSANS для максимизации количества нейтронов при потере пространственного разрешения⁵. Каретки детектора были расположены так, чтобы охватывать диапазон векторов рассеяния (q), 0,005 ^Å-1 < q < 0,5 ^Å-1, что соответствует масштабам длин от ≈130 нм до ≈13 нм. Вектор рассеяния определяется как q = 4π/λ sin (θ/2), где λ — длина волны нейтрона, а θ — угол рассеяния.

Устройство для смешивания с остановленным потоком, используемое для измерений TR-SANS, состоит из нескольких насосов, промывочных шприцев, шприцев для отбора проб, селекторов потока, а также адинамического смесителя, ячейки для проб и контейнера для смешанных образцов, как показано на рисунке 1. Все герметичные жидкостные тракты расположены внутри кондиционируемого корпуса, который включает в себя шприцы, клапаны, соединительные трубки, динамический смеситель и ячейки для проб. Программируемый термоэлектрический кондиционер используется для контроля температуры корпуса в диапазоне от 10 °C до 50 °C в пределах ±1 °C. Обратите внимание, что часть изоляции корпуса была удалена, чтобы показать рабочие части устройства. Корпус основного смесительного устройства расположен на ступени поступательного движения на лучевой линии NG3 VSANS в NCNR. Положение корпуса регулируется с помощью передаточного столика для позиционирования ячейки образца на пути нейтронного пучка (желтая пунктирная линия).

Рисунок 1: Пример установки для совмещения измерений смешивания остановленного потока и малоуглового рассеяния нейтронов на линии пучка VSANS в Центре нейтронных исследований NIST. Установка содержит четыре шприцевых насоса, два шприца для промывки растворителем и два шприца для впрыска пробы, четыре селекторных клапана насоса, два селекторных клапана смесителя, динамический смеситель, проточную кварцевую ячейку и контейнер для смешанных образцов. Падающие нейтроны рассеиваются от смешанного образца, находящегося внутри ячейки образца. Изолированный корпус с кварцевыми окнами и термоэлектрическим кондиционером используется для контроля образца и всего оборудования при постоянной температуре. Желтая пунктирная линия показывает траекторию пучка нейтронов. Масштабная линейка = 10 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Устройство, изображенное на фиг.1 , сконфигурировано с двумя шприцами для образцов, двумя шприцами для промывки и одной ячейкой для образца. Соответствующие блок-схемы для различных этапов протокола проиллюстрированы на рисунке 2. Желаемые объемы двух разных образцов впрыскиваются в смеситель и ячейку для образцов (рис. 2A). После заполнения ячейки для отбора проб впускной клапан (ISV) и выходной выключающий клапан (OSV) закрываются, чтобы изолировать ячейку для отбора проб от динамического смесителя и предотвратить обратную диффузию образца в ячейку во время сбора данных TR-SANS (рис. 2B). Перед динамическим смесителем соединительная трубка изменяется по длине от 10 см до 1 м и не влияет на время задержки смешивания. Однако соединения трубок между динамическим смесителем и ячейкой для отбора проб будут влиять на время задержки смешивания и требуемый объем впрыска образца. Предварительно нарезанные трубки из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,04 дюйма (1 мм) и длиной 100 мм используются для подключения динамического смесителя, селекторных клапанов смесителя (MSV1 и MSV2), а также независимых поставщиков программного обеспечения и OSV. Фторированная трубка с внутренним диаметром 1 мм и длиной 115 мм используется для подключения ISV и OSV (или выхода динамического смесителя) к ячейке для образцов. Общий объем пустоты, влияющий на время задержки смешивания, включает объем пустот смесителя (0,15 мл), трубку между выходным отверстием смесителя и входным отверстием ячейки для отбора проб (0,09 мл) и объем ячейки для отбора проб (0,16 мл). В этом примере общий объем пустоты составляет 0,4 мл. Внутренние объемы пустот клапанов незначительны по сравнению с объемами пустот трубок, смесителя и ячейки для образцов. Например, используемые селекторные клапаны низкого давления (диаметр отверстия 0,75 мм) содержат приблизительный объем пустот 4 мкл, в то время как селекторные клапаны высокого давления и переключающие клапаны (диаметр отверстия 0,25 мм) содержат приблизительные объемы пустот 0,5 мкл.

После завершения измерения TR-SANS образец выталкивается из ячейки с растворителем, и промывочный растворитель многократно прокачивается через ячейку для удаления остаточного образца и очистки ячейки для образца (рис. 2C). Обратите внимание, что шприцы для полоскания подключаются к большим резервуарам для растворителей (например, для воды и этанола) с помощью селектора значений насоса, чтобы обеспечить наличие достаточных объемов растворителя для очистки ячейки образца между прогонами. Источники растворителей, источники проб и емкости для смешанных образцов, содержащие легковоспламеняющиеся жидкости, размещаются в отдельном корпусе без электрооборудования для устранения всех возможных источников воспламенения. Кроме того, крышки бутылок с паровой блокировкой используются для минимизации легковоспламеняющихся паров и испарения растворителя. Наконец, ячейку для отбора проб сушат потоком газообразного азота для удаления остатков промывочного растворителя (рис. 2D). Давление газообразного азота на входе в селекторный клапан смесителя регулируется примерно до 2 бар (0,2 МПа, манометрическое давление) с помощью ручного регулятора давления, расположенного на баллоне с газообразным азотом. После того, как ячейка для отбора проб достаточно очищена и высушена, вновь смешанный образец вводится в ячейку для образца для следующего цикла измерения (повторяя смешивание и впрыск, показанные на блок-схеме на рисунке 2A).

Рисунок 2: Пример блок-схемы с использованием одной ячейки для образцов, смешивания двух образцов и двух промывочных растворителей для очистки . (A) Смешивание образца A (синий) и образца B (красный), а затем подача смешанного образца (фиолетового) в ячейку для образца. (B) Во время сбора данных – состояние устройства остановки потока, при котором переключающие клапаны ISV и OSV закрыты для изоляции ячейки для отбора проб и предотвращения обратной диффузии пробы во время сбора данных. (C) Этапы очистки, на которых ячейка для отбора проб промывается промывочным растворителем SS1 (зеленый) после сбора данных. (D) Стадия сушки, на которой ячейка для отбора проб осушается газообразным азотом (оранжевый). Сокращения: ПСВ = селекторный клапан насоса; MSV = селекторный клапан смесителя; OSV = выпускной выключательный клапан; ISV = впускной выключательный клапан; SS1 = источник растворителя 1; SSA = источник пробы A; N2 = источник газообразного азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 3 показаны блок-схемы для несколько иной версии, в которой смесительная установка сконфигурирована с двумя отдельными ячейками для отбора проб, подключенными к одним и тем же переключающим клапанам (рис. 3A). В то время как данные TR-SANS собираются в ячейке образца 1, ячейка образца 2 промывается (рис. 3B) и сушат (рис. 3C). Когда сбор данных для ячейки образца 1 завершен, клапан впускного переключателя направляет вновь смешанный образец в ячейку образца 2 для сбора данных (рис. 3D). В то время как данные TR-SANS собираются в ячейке образца 2, ячейка образца 1 промывается и сушится (рис. 3E). Этот чередующийся, параллельный процесс между двумя ячейками для образцов сводит к минимуму время между последующими инъекциями образца и максимизирует использование времени нейтронного пучка.

Рисунок 3: Пример блок-схемы с использованием ячеек с двумя образцами, смешивания двух образцов и двух промывочных растворителей для очистки. (A) Смешивание образца A (синий) и образца B (красный) и последующее переливание смешанного образца (фиолетового) в ячейку для образца 1. (B) Состояние устройства остановки потока во время сбора данных на ячейке 1 для отбора проб, в то время как ячейка для отбора проб 2 промывается растворителем из SS1 (зеленый). (C) Состояние устройства остановки потока во время сбора данных на ячейке 1 для отбора проб, когда ячейка 2 для отбора проб осушается газообразным азотом (оранжевый). (D) После того, как сбор данных ячейки образца 1 завершен, новый образец (фиолетовый) немедленно смешивается и подается в ячейку образца 2. (E) Состояние устройства остановки потока во время сбора данных на ячейке 2 для отбора проб во время промывки ячейки 1 для отбора проб растворителем из SS1 (зеленый цвет). В то время как одна ячейка образца измеряется, другая ячейка образца очищается и сушится. Процесс измерения остановленного потока чередуется между двумя ячейками для отбора проб, чтобы свести к минимуму время между последующими впрысками для смешивания проб. Сокращения: ПСВ = селекторный клапан насоса; MSV = селекторный клапан смесителя; OSV = выпускной выключательный клапан; ISV = впускной выключательный клапан; SS1 = источник растворителя 1; SSA = источник пробы A; N2 = источник газообразного азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ниже описан пошаговый протокол для подключения насосов и трубопроводов насосно-компрессорных труб, заливки системы, промывки и сушки ячейки для отбора проб и впрыска смешанного образца. Несмотря на то, что конфигурация с одной ячейкой продемонстрирована для простоты (рис. 2), гибкая модульная установка, протокол и сценарии могут быть легко изменены для реализации большего количества шприцевых насосов, клапанов, смесителей или конфигураций ячеек для образцов, таких как конфигурация ячеек с двумя образцами, показанная на рисунке 3. Репрезентативные данные о скорости подсчета необработанных нейтронов, собранные во время циклов впрыска смешивания и очистки, показаны на рисунке 4, в то время как кинетика липидного обмена, измеренная при 3 различных температурах, и извлеченная нормализованная интенсивность рассеяния, соответствующая доле обмененных липидов, показаны на рисунке 5 и рисунке 6 соответственно.