Misurare l'evoluzione temporale di materiali su scala nanometrica con scattering neutronico a flusso interrotto e a piccolo angolo

Lo scattering neutronico a piccolo angolo (SANS) fornisce un modo unico per misurare le dimensioni, le forme, le interazioni e l’organizzazione di vari materiali su scale di lunghezza da ≈1 nm a ≈100 nm ^1,2,3. Strumenti recenti, tra cui gli strumenti VSANS (Very small-angle neutron scattering) con specchi di messa a fuoco, spingono i limiti verso la misurazione di scale di lunghezza ancora più grandi fino a ≈1000 nm ^4,5. In generale, il contrasto di scattering unico inerente ai metodi di scattering neutronico offre diversi vantaggi nella misurazione dell’evoluzione temporale delle strutture su scala nanometrica, come l’aggregazione di componenti nelle formulazioni farmaceutiche⁶, le reazioni di reticolazione e gelificazione nei sistemi polimerici^7,8, nella meso cristallizzazione delle proteine di membrana^9,10, la degradazione e lo spiegamento delle proteine^11,12 e crescita di materiali a base di silice^13,14,15. L’esclusivo contrasto di dispersione rende SANS (TR-SANS) risolto nel tempo un utile complemento ad altre misurazioni basate sul flusso interrotto.

I metodi di miscelazione a flusso interrotto sono spesso implementati nello scattering di raggi X a piccolo angolo (SAXS)16,17,18,19,20,21, nella spettroscopia di fluorescenza 22,23,24,25,26 e nella diffusione della luce^{27,28,29,30, 31,32} esperimenti per studiare i processi cinetici su scale temporali al millisecondo. Un’importante differenza tra SANS e SAXS è che lo scattering neutronico è una tecnica di caratterizzazione non distruttiva e, come tale, SANS può essere utilizzato per misurare lo stesso campione per ore o addirittura giorni senza danni da radiazioni ionizzanti al campione, che possono verificarsi durante esperimenti di diffusione dei raggi X ad alto flusso³³. Poiché le misurazioni SANS ripetute non alterano la struttura chimica della molecola o del campione della sonda, l’evoluzione temporale può essere studiata senza effetti del fotosbiancamento, ad esempio, che può complicare le misurazioni cinetiche che si basano sulla fluorescenza^23,24. Inoltre, SANS può essere utilizzato per misurare campioni altamente concentrati e otticamente opachi che sono spesso difficili da caratterizzare con tecniche basate sulla luce come la diffusione dinamica della luce.

Oltre a fornire informazioni strutturali su scala nanometrica, SANS può essere utilizzato per sondare la composizione locale di queste strutture attraverso la variazione del contrasto della densità della lunghezza di diffusione dei neutroni. La densità della lunghezza di scattering (SLD) di diversi elementi varia casualmente attraverso la tavola periodica e varia con diversi isotopi dello stesso elemento. Un esempio comunemente sfruttato è l’idrogeno (¹H o H) e il deuterio (²H o D), che hanno lunghezze di scattering neutronico molto diverse. Pertanto, i materiali ricchi di idrogeno, come tensioattivi, lipidi, proteine, RNA, DNA e altri polimeri, possono essere distinti dai solventi deuterati utilizzando SANS senza modificare significativamente le proprietà fisiche del sistema. Tuttavia, è importante notare che lo scambio H/D può influenzare la densità, il legame idrogeno e le temperature di transizione di fase nel campione. Tuttavia, la sensibilità unica di SANS ai materiali ricchi di idrogeno è particolarmente utile nella ricerca sulla materia soffice in cui i campioni di interesse hanno un contrasto di diffusione e un segnale inferiori nelle tecniche basate sui raggi X come SAXS. La sostituzione isotopica rende anche SANS un potente strumento per studiare la cinetica di scambio molecolare in materiali ricchi di idrogeno semplicemente mescolando molecole marcate H e D. La sostituzione isotopica è particolarmente utile nei sistemi in cui i coloranti fluorescenti voluminosi sono più grandi delle molecole tensioattive o lipidiche di interesse e possono influenzare la cinetica di scambio^34,35.

Le misurazioni SANS risolte nel tempo sono vantaggiose perché l’intensità misurata è una funzione del tempo, della scala di lunghezza e del contrasto SLD. Come tale, gli esperimenti TR-SANS possono essere progettati per sondare i cambiamenti dipendenti dal tempo nelle distribuzioni spaziali e nelle composizioni dei campioni. Questi vantaggi unici di SANS hanno portato a importanti informazioni sui processi cinetici in molti sistemi di materiali morbidi come tensioattivi 36,37,38, emulsioni 39,40,41, lipidi 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ^,50, e polimeri 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. La maggior parte degli studi TR-SANS si sono concentrati su scale temporali da minuti a ore. Tuttavia, molti processi cinetici di interesse si verificano sulla seconda scala temporale e sono essenziali per comprendere i meccanismi sottostanti. L’acquisizione di questi primi punti temporali richiede che le soluzioni siano rapidamente miscelate e misurate in situ, in cui la miscelazione è sincronizzata con la raccolta dei dati durante la diffusione della luce a flusso interrotto 27,28,29,30,31,32, fluorescenza 22,23,24,25,26 e raggi X 16,17,18,19,20,21 esperimenti. Questo lavoro descrive l’uso di un ambiente di campionamento progettato per miscelare rapidamente più campioni liquidi e iniettare la miscela in una cella di vetro al quarzo per le misurazioni TR-SANS. Il dispositivo di miscelazione è un adattamento del dispositivo reoSANS capillare⁶³ recentemente sviluppato e utilizza più pompe e valvole a siringa per controllare la miscelazione del campione e automatizzare la pulizia delle celle. Collegando le pompe a siringa a una serie di valvole selettrici di flusso, è possibile miscelare, misurare, risciacquare e asciugare ripetutamente più flussi di ingresso per facilitare le misurazioni TR-SANS sulla scala dei secondi.

La procedura attuale presuppone che i campioni di interesse siano stati identificati e preparati. Ci concentriamo sulla configurazione di miscelazione in situ e sui metodi per raccogliere i dati TR-SANS. I dati di diffusione dei neutroni sono stati raccolti sullo strumento VSANS presso il NIST Center for Neutron Research (NCNR); tuttavia, la procedura dovrebbe essere applicabile ad altri strumenti SANS. I lettori interessati a implementare protocolli simili su altri strumenti SANS dovrebbero consultare gli scienziati locali per determinare la configurazione ottimale dello strumento per massimizzare il flusso di neutroni alla scala di lunghezza desiderata e alla scala temporale più rilevante per i processi cinetici di interesse. I dati qui presentati sono stati raccolti utilizzando la configurazione ad alto flusso “white beam” su VSANS per massimizzare il conteggio dei neutroni alla perdita di risoluzione spaziale⁵. I carrelli del rivelatore sono stati posizionati per coprire una gamma di vettori di scattering (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1, corrispondenti a scale di lunghezza da ≈130 nm a ≈13 nm. Il vettore di scattering è definito come q = 4π/λ sin (θ/2) in cui λ è la lunghezza d’onda del neutrone e θ è l’angolo di scattering.

Il dispositivo di miscelazione a flusso interrotto utilizzato per le misurazioni TR-SANS è costituito da più pompe, siringhe di risciacquo, siringhe per campioni, selettori di flusso, nonché un miscelatore dinamico, una cella di campionamento e un contenitore di campioni misti, come mostrato nella Figura 1. Tutti i percorsi sigillati dei fluidi si trovano all’interno di un involucro climatizzato, che include siringhe, valvole, tubi di collegamento, miscelatore dinamico e celle di campionamento. Un condizionatore d’aria termoelettrico programmabile viene utilizzato per controllare la temperatura dell’involucro nell’intervallo da 10 °C a 50 °C entro ±1 °C. Si noti che parte dell’isolamento della custodia è stato rimosso per mostrare le parti funzionanti del dispositivo. L’involucro principale del dispositivo di miscelazione è posizionato su uno stadio traslazionale sulla linea del fascio NG3 VSANS presso l’NCNR. La posizione dell’involucro viene regolata utilizzando lo stadio di traslazione per posizionare la cella campione nel percorso del fascio di neutroni (linea tratteggiata gialla).

Figura 1: Una configurazione di esempio per combinare la miscelazione a flusso interrotto e le misure di scattering neutronico a piccolo angolo sulla linea di fascio VSANS presso il NIST Center for Neutron Research. La configurazione contiene quattro pompe a siringa, due siringhe per il risciacquo con solvente e due siringhe per l’iniezione del campione, quattro valvole selettrici per pompe, due valvole di selezione del miscelatore, un miscelatore dinamico, una cella al quarzo a flusso continuo e un contenitore di campioni misti. I neutroni incidenti si disperdono dal campione misto situato all’interno della cellula campione. Un involucro isolato con finestre al quarzo e un’unità termoelettrica climatizzata viene utilizzata per controllare il campione e tutte le apparecchiature a temperatura costante. La linea tratteggiata gialla mostra il percorso del fascio di neutroni. Barra scala = 10 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il dispositivo illustrato nella Figura 1 è configurato con due siringhe campione, due siringhe di risciacquo e una cella campione. I diagrammi di flusso corrispondenti per le diverse fasi del protocollo sono illustrati nella Figura 2. I volumi desiderati dei due diversi campioni vengono iniettati nel miscelatore e nella cella campione (Figura 2A). Una volta riempita la cella di campionamento, la valvola dell’interruttore di ingresso (ISV) e la valvola dell’interruttore di uscita (OSV) vengono chiuse per isolare la cella del campione dal miscelatore dinamico e per impedire la diffusione del campione nella cella durante la raccolta dei dati TR-SANS (Figura 2B). Prima del miscelatore dinamico, il tubo di collegamento varia in lunghezza da 10 cm a 1 m e non influisce sul tempo di ritardo della miscelazione. Tuttavia, i collegamenti dei tubi tra il miscelatore dinamico e la cella di campionamento influiscono sul tempo di ritardo della miscelazione e sul volume di iniezione del campione richiesto. I tubi in acciaio inossidabile pretagliati con diametro interno di 0,04 pollici (1 mm) e lunghezza di 100 mm vengono utilizzati per collegare il miscelatore dinamico, le valvole di selezione del miscelatore (MSV1 e MSV2), ISV e OSV. I tubi fluorurati con diametro interno di 1 mm e lunghezza di 115 mm vengono utilizzati per collegare l’ISV e l’OSV (o l’uscita del miscelatore dinamico) alla cella di campionamento. Il volume totale di vuoto che influenza il tempo di ritardo di miscelazione include il volume di vuoto del miscelatore (0,15 ml), il tubo tra l’uscita del miscelatore e l’ingresso della cella del campione (0,09 ml) e il volume della cella del campione (0,16 ml). In questo esempio, il volume totale del vuoto è 0,4 ml. I volumi di vuoto interno delle valvole sono trascurabili rispetto ai volumi di vuoto di tubi, miscelatori e celle di campionamento. Ad esempio, le valvole selettrici a bassa pressione impiegate (diametro del foro 0,75 mm) contengono volumi di vuoto approssimativi di 4 μL, mentre le valvole selettrici e le valvole di commutazione ad alta pressione (diametro del foro 0,25 mm) contengono volumi vuoti approssimativi di 0,5 μL.

Al termine della misurazione TR-SANS, il campione viene spinto fuori dalla cella con solvente e il solvente di risciacquo viene ripetutamente pompato attraverso la cella per rimuovere il campione residuo e pulire la cella del campione (Figura 2C). Si noti che le siringhe di risciacquo sono collegate a serbatoi di solventi più grandi (ad esempio, acqua ed etanolo) tramite valori di selezione della pompa per garantire che siano disponibili volumi di solvente adeguati per pulire la cella di campionamento tra una corsa e l’altra. Le fonti di solventi, le fonti di campionamento e i contenitori di campioni misti che contengono liquidi infiammabili sono posizionati in un involucro separato senza apparecchiature elettriche per eliminare tutte le possibili fonti di accensione. Inoltre, vengono utilizzati tappi di bottiglia con bloccaggio del vapore per ridurre al minimo i vapori infiammabili e l’evaporazione del solvente. Infine, la cella del campione viene essiccata con un flusso di azoto gassoso per rimuovere il solvente di risciacquo residuo (Figura 2D). La pressione del gas di azoto in ingresso alla valvola selettiva del miscelatore è regolata a circa 2 bar (0,2 MPa, pressione manometrica) utilizzando un regolatore di pressione manuale situato sulla bombola del gas di azoto. Una volta che la cella del campione è sufficientemente pulita ed essiccata, un campione appena miscelato viene iniettato nella cella campione per il successivo ciclo di misurazione (ripetendo la miscelazione e l’iniezione illustrate nel diagramma di flusso nella figura 2A).

Figura 2: Diagramma di flusso di esempio utilizzando una cella campione, due campioni di miscelazione e due solventi di risciacquo per la pulizia . (A) Miscelazione del campione A (blu) e del campione B (rosso) e quindi flusso del campione misto (viola) nella cella del campione. (B) Durante la raccolta dei dati, lo stato del dispositivo a flusso interrotto in cui le valvole di commutazione ISV e OSV sono chiuse per isolare la cella del campione e impedire la retrodiffusione del campione durante la raccolta dei dati. (C) Le fasi di pulizia in cui la cella campione viene risciacquata con solvente di risciacquo da SS1 (verde) dopo la raccolta dei dati. (D) Fase di essiccazione in cui la cella campione viene essiccata con azoto gassoso (arancione). Abbreviazioni: PSV = valvola selettrice pompa; MSV = valvola selettrice miscelatrice; OSV = valvola interruttore di uscita; ISV = valvola interruttore di ingresso; SS1 = fonte di solvente 1; SSA = fonte di campionamento A; N2 = fonte di azoto gassoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Figura 3 mostra i diagrammi di flusso per una versione leggermente diversa in cui la configurazione di miscelazione è configurata con due celle di campionamento separate collegate alle stesse valvole di commutazione (Figura 3A). Mentre i dati TR-SANS vengono raccolti nella cella campione 1, la cella campione 2 viene risciacquata (Figura 3B) e asciugata (Figura 3C). Quando la raccolta dei dati è completa per la cella campione 1, la valvola dell’interruttore di ingresso indirizza un campione appena miscelato nella cella campione 2 per la raccolta dei dati (Figura 3D). Mentre i dati TR-SANS vengono raccolti nella cella campione 2, la cella campione 1 viene risciacquata e asciugata (Figura 3E). Questo processo parallelo e alternato tra due celle campione riduce al minimo il tempo tra le successive iniezioni di campioni e massimizza l’uso del tempo del fascio di neutroni.

Figura 3: Diagramma di flusso di esempio utilizzando due celle a campione, due campioni che si mescolano e due solventi di risciacquo per la pulizia. (A) Mescolare il campione A (blu) e il campione B (rosso) e quindi far confluire il campione misto (viola) nella cella 1. (B) Lo stato del dispositivo di arresto del flusso durante la raccolta dei dati sulla cella campione 1 mentre la cella campione 2 viene risciacquata con solvente da SS1 (verde). (C) Lo stato del dispositivo di interruzione del flusso durante la raccolta dei dati sulla cella campione 1 mentre la cella campione 2 è essiccata con azoto gassoso (arancione). (D) Una volta completata la raccolta dei dati della cella campione 1, un nuovo campione (viola) viene immediatamente miscelato e confluito nella cella campione 2. (E) Lo stato del dispositivo di arresto del flusso durante la raccolta dei dati sulla cella campione 2 mentre la cella campione 1 viene risciacquata con solvente da SS1 (verde). Mentre una cella campione viene misurata, l’altra cella campione viene pulita e asciugata. Il processo di misurazione del flusso interrotto alterna due celle campione per ridurre al minimo il tempo tra le successive iniezioni di miscelazione del campione. Abbreviazioni: PSV = valvola selettrice pompa; MSV = valvola selettrice miscelatrice; OSV = valvola interruttore di uscita; ISV = valvola interruttore di ingresso; SS1 = fonte di solvente 1; SSA = fonte di campionamento A; N2 = fonte di azoto gassoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Di seguito è descritto un protocollo passo-passo per collegare le pompe e le tubazioni, adescare il sistema, risciacquare e asciugare la cella del campione e iniettare il campione misto. Sebbene la configurazione a cella singola sia dimostrata per semplicità (Figura 2), la configurazione modulare flessibile, il protocollo e gli script possono essere facilmente modificati per implementare più pompe a siringa, valvole, miscelatori o configurazioni di celle campione, come la configurazione a due celle campione mostrata nella Figura 3. I dati rappresentativi della velocità di conteggio dei neutroni grezzi raccolti durante i cicli di iniezione di miscelazione e pulizia sono mostrati nella Figura 4, mentre la cinetica di scambio lipidico misurata a 3 diverse temperature e l’intensità diffusa normalizzata estratta corrispondente alla frazione di lipidi scambiati sono mostrati rispettivamente nella Figura 5 e nella Figura 6.