肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

1. 細胞の調製 クラスIIの層流微生物学的安全キャビネットで滅菌条件下ですべての実験を行います( 材料表を参照)。 フードをオンにして、気流の安定化を可能にします。 内部フード表面に70%エタノールを十分にスプレーして、以前のユーザーからの汚染を排除します。 500 mL ガラスビーカーに消毒液の5%を準備します。溶液内の細胞上清または細胞デブリを捨てます。 70%エタノールでマイクロピペットとチップボックスをすべて十分に洗浄してください。 ダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)高グルコース培地を10%熱失活ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン1%(ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL)、2mM-LLを添加して、新鮮な細胞培養培地を調製します。LX2肝星状細胞株の場合、FBSサプリメントの濃度を2%に下げる。 実験を開始する前に温かい培養メディア。 フー7とHep3B HCC腫瘍細胞株とCOS7およびLX2線維芽細胞株を液体窒素の貯蔵ラックから取り出します。急速に凍結保存細胞を解凍する。 2 mLの新鮮な培養培地で解凍した細胞を希釈します。遠心分離細胞は室温で4分間200× g で。上清を捨て、新鮮な温かい培養培地の1mLで細胞ペレットを再懸濁します。 T75細胞培養フラスコの種子細胞。細胞が60%~70%のコンフルエンスに達するまで、95%加湿条件下で37°Cで5%CO2 の細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。 2. セルコレクション 吸引培養培地及びリン酸緩衝塩(PBS)で細胞を3回洗浄する。 2 mLのプリウォームド 1x トリプシンを加えて、T75 フラスコの底部から接着細胞を取り外します。インキュベーターで37°Cで4分間インキュベートします。 完全な培養培地の4 mLを加えることによってトリプシンを不活性化する。細胞懸濁液と遠心分離細胞を室温で4分間200xgで回収します。上清を捨て、4mLの新鮮な培養培地で細胞を再懸濁する。 3. セルカウント 遠心分離管内の細胞の均質な分布を確保するために細胞懸濁液を穏やかに渦巻く。 10 μL ピペットを使用して、10 μL のセル懸濁液を 10 μL の Trypan ブルーと混合します。混合物を上下に4回軽くピペット化し、染料で外細胞表面の完全な染色を確実にします。 ヘモサイトメーターを使用して細胞の数を数えます。 まず、染色された細胞懸濁液を積み込む前に、血球計計面積の上にカバースリップを置きます。 細胞懸濁液を含むピペットチップをヘモサイトメーターのV溝に入れる。チップの内容をカウントスライドにそっと出します。 スラリーを残して、細胞数を数える顕微鏡の段階で固定する前に数分間沈着します。注: 二重カウントを避けるために、大きい四角形の両側のセルのみをカウントします。 上または右の判決を重ねるセル内でカウントし、下または左の判決をオーバーラップするセルを避けます。 セルの総数を計算します。注: 1 ml あたりのセル数 = 4. 繊維芽細胞コンディションメディア(CM)の収集 吸引培養培地をPBSでLX2細胞を3回洗浄する。 2 mLのプリウォームド 1x トリプシンを加えて、T75 フラスコの底部から接着細胞を取り外します。フラスコを37°Cでインキュベーターで4分間インキュベーターします。 完全な培養培地の4 mLを加えることによってトリプシンを不活性化する。細胞懸濁液と遠心分離細胞を室温で4分間200xgで回収します。ステップ 3 に従ってセルをカウントします。 シード 1 x 106 LX2 細胞を 10 cm3 の皿で 37 °C で 48 時間のために。 48時間後に線維芽細胞CMを収集する。200 x g で 4 分間の遠心分離機を室温で任意の浮遊細胞をペレットにします。20 mL シリンジの底部に固定された 0.22 μm フィルタを使用して、CM を滅菌フィルターします。 CMを2 mLチューブに上清CM.アリコートを回収し、-80°Cで保管して、さらなる用途に向けて保管してください。注:溶液は-80°Cで6ヶ月間保存することができます。 5. 完璧な回転楕円体のための細胞密度の検証 吸引培養培地を、PBSでHCC細胞株を3回洗浄する。 2 mLのプリウォームド 1x トリプシンを加えて、T75 フラスコの底部から接着細胞を取り外します。インキュベーターで37°Cで4分間インキュベートします。 完全な培養培地の4 mLを加えることによってトリプシンを不活性化する。細胞懸濁液と遠心分離細胞を室温で4分間200xgで回収します。 ステップ 3 に従ってセルをカウントします。 ペトリ皿の10cm3 蓋の内部表面上の20μLの培地における腫瘍細胞株(12000、6000、3000、1500、1500、1000、1000、500、250、および125細胞)とは異なる密度のピペット。 皿の底に10mLの無菌PBSを加えて、スフェロイド形成のプロセスに湿気の多い条件を提供します。 10 cm3 皿の蓋を反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にぶら下がることができるようにします。ぶら下がった液滴を3日間放置します。 元の液滴を吊り下げてから3日後に反転した顕微鏡を使用して、50倍の倍率で回転楕円体の画像を撮ります。 6. 不均一性腫瘍/間質スフェロイド 1500個のCOS7哺乳動物線維芽細胞を有する1500のHuh7 HCC細胞を吊り下げて(1:1比)、球体を形成する垂滴を下す。皿の底に10mLの無菌PBSを加えて、スフェロイドに湿度の高い条件を提供します。 10 cm3 皿の蓋を反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にぶら下がることができるようにします。ぶら下がった液滴を3日間放置します。 3日目から10日目までの逆顕微鏡を使用して、スフェロイドの画像を撮影します。 10cm3の皿を顕微鏡のステージに置きます。すべての回転楕円体の50倍で顕微鏡の倍率を調整します。 取り付けられたコンピュータで顕微鏡ソフトウェアを開き、すべての回転楕円体の鮮明な画像を持つフォーカスを調整します。取得した画像を保存するには、顕微鏡ソフトウェアの キャプチャツール を使用してください。 7. LX2 CMのホモタイプHep3Bスフェロイド 吊り下げ液滴に3000 Hep3B HCC細胞を懸濁させて球体を形成する。皿の底に10mLの無菌PBSを加えて、スフェロイドに湿度の高い条件を提供します。 10 cm3 皿の蓋を反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にぶら下がることができるようにします。ぶら下がった液滴を3日間放置します。 ヘプ3BスフェロイドをLX2細胞から20μLの新鮮なCMに吊り下げ液滴に移します。注:形成されたスフェロイドへの中断や損傷を避けるために、スフェロイド転送の過程で無菌オートクレーブされた200 μLピペットチップを使用してください。これはまた、メインの単一の回転楕円体に未接続のまま残存細胞を除去する。 トランスファープロセスにはオートクレーブ20μLピペットを使用してください。ピペットのボリュームを2 μLに調整し、ピペットチップをピペットに取り付けます。 スフェロイドが形成された10 cm3 皿の蓋を反転させます。軽い顕微鏡のステージでふたを固定します。顕微鏡の細かい焦点を合わせて、各回転楕円体を見えるようにします。 プランジャーボタンを押して、マイクロピペットから空気を慎重に空にします。移すピペットチップを、回転楕円体を含む液滴に挿入する。先端で触れることなく、スフェロイドに非常に近づく。 プランジャーボタンの圧力を静かに放して、2μLメディアのマイクロピペットチップにスフェロイドを吸い込みます。 新しい10 cm3 皿にぶら下がっている新しい液滴にスフェロイドを移し、新しいメディア/コンディショナ付きのメディア/トリートメントを受けます。メモ:すべての回転楕円体が、光顕微鏡を使用して新しい10 cm3 皿に正常に転送されていることを確認してください。 LX2 CMで転写した日(3日目)から7日目までの逆顕微鏡を使用して、50倍の倍率でスフェロイドの画像を撮ります。 8. スフェロイド体積の計算 一致した回転楕円体の画像を毎日キャプチャできるように、各回転楕円体に一意の数値識別子を割り当てます。 画像解析ソフトウェア パッケージを使用して、成長するスフェロイドの画像を解析します。 ソフトウェア パッケージ内の各回転楕円体イメージを開きます。 フリーハンド 選択ツールを使用して、各回転楕円体の輪郭を描きます。 [分析 ] ドロップダウン ボタンで、[ 測定の設定]、[ 面積] の順に選択します。 [OK] をクリックします。 各回転楕円体の周りに手動で円を描きます。球が丸で囲まれたら、 Ctrl + M を押して、プログラムがピクセル単位で回転楕円体領域を計算できるようにします。回転楕円体の面積をボリュームに変換します。メモ:回転楕円体3=0.09403× イメージ キャプチャの初日の体積に対する回転楕円体体積の変化を計算します。注: これは、回転楕円体の体積を開始ボリュームに正規化し、開始サイズの自然な変動を考慮して精度を向上させるためです。