نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للتحقيق في التفاعل الورمي-السترومالي في سرطان الكبد
Summary
وهناك نقص في النماذج الشاملة في المختبر التي تلخص بأمانة المرض البشري ذي الصلة. تقدم الدراسة الحالية إنشاء الورم ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) والثقافة ، وهي أداة موثوقة في المختبر لدراسة التفاعل الورمي الحلقي في سرطان الكبد البشري.
Abstract
العدوانية وعدم وجود علاجات جيدة التحمل وفعالة على نطاق واسع لسرطان الكبد المتقدم (HCC)، الشكل السائد لسرطان الكبد، ترشيد رتبته كثاني أكثر الأسباب شيوعا للوفاة المرتبطة بالسرطان. تحتاج النماذج قبل السريرية إلى التكيف لتلخيص الظروف البشرية لاختيار أفضل المرشحين العلاجيين للتنمية السريرية والمساعدة في تقديم الطب الشخصي. تظهر نماذج كروية خلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وعدا كبديل في المختبر الناشئ للثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد). هنا، ونحن نصف نموذج كروية الورم 3D الذي يستغل قدرة الخلايا الفردية لتجميع عند الحفاظ عليها في قطرات معلقة، وأكثر تمثيلا لبيئة في الجسم الحي من monolayers القياسية. وعلاوة على ذلك، يمكن إنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد من خلال الجمع بين الخلايا المثلية أو غير المتغايرة، التي تعكس أكثر التغاير الخلوي في الجسم الحي، مما قد يمكن من دراسة التفاعلات البيئية التي يمكن أن تؤثر على التقدم واستجابات العلاج. البحث الحالي الأمثل كثافة الخلية لتشكيل 3D متجانسة والفيرويدات الورم غير الاستوائية عن طريق شل تعليق الخلايا على أغطية القياسية 10 سم3 أطباق بيتري. تم إجراء تحليل طولي لتوليد منحنيات النمو للورم المثلي مقابل الخلايا الليفية/ الخلايا الليفية. وأخيرا، تم التحقيق في التأثير التكاثري للخلايا الليفية (خلايا COS7) والخلايا العضلية الليفية الكبدية (LX2) على كرويات الورم المثلي (Hep3B). وقد أسفرت كثافة البذر التي تبلغ 000 3 خلية (في 20 وسائط ميكرولتر) بنجاح عن كرويات غير منشطة من نوع Huh7/COS7، أظهرت زيادة مطردة في الحجم حتى يوم الثقافة 8، أعقبها تأخر النمو. تم تأكيد هذه النتيجة باستخدام كرويدات متجانسة Hep3B المستزرعة في LX2 (خط الخلية النجمية الكبدية البشرية) المتوسطة (CM). LX2 CM تسبب في انتشار كرويدات Hep3B مقارنة مع كرويات الورم السيطرة. في الختام، أظهر هذا البروتوكول أنه يمكن استخدام كرويات الورم ثلاثية الأبعاد كأداة بسيطة واقتصادية ومرحلة ما قبل الشاشة في المختبر لدراسة التفاعلات الورمية السترومية بشكل أكثر شمولا.
Introduction
استمر معدل الإصابة والوفيات الناجمة عن سرطان الكبد في الازدياد على الصعيد العالمي، على الرغم من التقدم المحرز في علاج أمراض الكبد ومعظم أنواع السرطان الأخرى. في عام 2018، تجاوز سرطان الكبد سرطان القولون والمستقيم والمعدة ليصبح ثاني أكثر الأسباب شيوعا للوفاة المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم1. في عام 2020، كان هناك أكثر من 9,00,000 تشخيص جديد، وهو ما يمثل 4.7٪ من إجمالي حالات السرطان في جميع أنحاء العالم1. وهذا أمر مخيب للآمال بشكل خاص، بالنظر إلى أن عوامل الخطر الهامة لتطوير HCC، الشكل الأكثر شيوعا لسرطان الكبد، تتميز بشكل جيد2. تليف الكبد هو عامل الخطر الأكثر شيوعا لتطوير HCC، مع 80٪ من الحالات النامية على خلفية تليف الكبد المنشأ2. وتشمل أمراض الكبد المزمنة، التي تتقدم إلى تليف الكبد، وبالتالي HCC، فيروس التهاب الكبد B (HBV)، وفيروس التهاب الكبد C (HCV)، وأمراض الكبد المرتبطة بالكحول (ARLD)، وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية (NAFLD) – وهذا الأخير يعزى إلى السمنة وداء السكري من النوع 2 (T2DM)2،3. تعتمد بروتوكولات الإدارة الحالية ل HCC على المرحلة ومحدودة بالنسبة لأولئك الذين يعانون من سرطان متقدم ، والذين غالبا ما تكون نتائجهم ضعيفة4. كانت هناك تطورات كبيرة باستخدام مثبطات كيناز، ومؤخرا، علاجات الأورام المناعية، على الرغم من واقعيا، تستفيد سوى أقلية من المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد المتقدمة5. وعلاوة على ذلك، هناك قلق من أن مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية الناشئة في المرضى الذين يعانون من NAFLD – السبب الكامن الأسرع نموا، الذي يمثل أكثر من 50٪ من حالات HCC التي تم تشخيصها حديثا في الدول الغربية، قد تكون أكثر مقاومة للعلاج المثبط للوفيات المبرمجة 1 (PD1) نقطة تفتيش6.
كان هناك استثمار كبير في التجارب السريرية للمرضى الذين يعانون من HCC ، بما في ذلك تحسينات كبيرة في التجارب السريرية ونقاط النهاية الخاصة بهم7. بعد عقد من الفشل، بدأت هذه الاستثمارات في تغيير الفرص المتاحة للمرضى. ومع ذلك، فإن الواقع هو أن النسبة الإجمالية للمستجيبين لا تزال ضعيفة نسبيا، حيث غالبا ما يمثل المرضى الذين يتم تجنيدهم في التجارب بشكل ضعيف أولئك الذين يتلقون الرعاية في العيادات. و الخطر هو أن التقدم مكلف ويفيد القلة وليس الكثيرين. مع ظهور المزيد من العلاجات المرشحة للاستخدام الفردي أو الجمع ، من الضروري أن يكون هناك نماذج قبل السريرية أكثر تنبؤا باستجابات الجسم الحي. ومن المرجح أن تكون هذه النماذج التي تتضمن عوامل إضافية تسهم في التباين ينظر في استجابات المرضى التي تعكس بشكل أفضل عدم التجانس HCC الإنسان والتعقيد المرضي8. هناك حاجة إلى النظم التي تعيد خلق الظروف المرضية المرضية في الجسم الحي من HCC للمساعدة في فهم بيولوجيا تطور الورم والنمو والتقدم. النماذج التجريبية الحالية لأمراض الكبد المزمنة وHCC تندرج عادة تحت ثلاث فئات رئيسية: في النماذج الحيوانية الحية (استعرضت in9)، في الثقافات المختبرية10، ونماذج vivo11،12 ex. وتستخدم النهج القائمة على الحيوانات على نطاق واسع لدراسة أمراض الكبد المزمنة، بما في ذلك HCC؛ ومع ذلك، فإن التباين الجيني، وارتفاع تكاليف التشغيل، ومختلف أجهزة المناعة بين الأنواع هي من بين القيود الرئيسية لتطبيق مثل هذه النماذج9. في حين أن بعض نماذج الجسم الحي السابق توفر أداة ممتازة للتركيز على الأنسجة البشرية مقارنة مع غيرها من نماذج خط الخلية المختبرية، وتوافر الأنسجة ومسار زمني تجريبي محدود عرقلة استخدامها على نطاق واسع.
من ناحية أخرى ، لا تزال نماذج خط الخلية في المختبر خيارا جيدا للعلماء الذين يعملون بموارد محدودة ، مع حاجة أقل إلى إمدادات مستمرة من الأنسجة البشرية الطازجة10. توفر هذه النماذج أيضا أداة يمكن استخدامها كشاشة أولى للمساعدة في التحقق المستهدف من اختيار الدواء قبل الانتقال إلى نماذج أكثر تعقيدا في الجسم الحي. التعديل الأخير للثقافات أحادية الطبقة 2D التقليدية في الثقافات 3D قد حسن فعالية هذه النماذج في المختبر13,14.
يمكن للنماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر تلخيص الميزات الحرجة التي شوهدت في الحالات الطبيعية والمرضية للإنسان. في ظل الظروف الفسيولوجية ، يتم بدء تحويل الإشارات من خلال الكلام الخلوي والتفاعل مع جزيئات النسيج الضام الأخرى ، وهي بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وتشكيل شبكة تفاعل ثلاثية الأبعاد15،16. يتطور الورم في شكل كروي ثلاثي الأبعاد أثناء التحول الخبيث ، والذي يكون الأكسجين والمواد المغذية وفيرة بسهولة في مرحلة ما بين الأورام / الأورام. وفي الوقت نفسه، تسود حالات نقص الأكاكس في قلب الورم. هذا التغايرية في توافر المواد الغذائية يؤدي إلى تنشيط الإشارات المتميزة مكانيا والمسارات الأيضية التي تنظم الورم. يتم تلخيص هذه الظروف بشكل سيئ في الثقافات أحادية الطبقة التقليدية 2D14 ، حيث تنمو الخلايا على البلاستيك الثقافي القاسي بطريقة غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. الخلايا السرطانية أيضا التواصل مع الخلايا الأخرى غير parenchymal, المصدر الرئيسي ل ECM, نمو, والغزو الإشارات داخل البيئة الدقيقة الورم. على عكس الثقافات ثنائية الأبعاد، يمكن أن توفر النماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر منصة أكثر ملاءمة لدراسة هذا التفاعل بين الورم والستروم17.
وتستخدم النماذج ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع في مجال HCC، وتختلف في الطريقة التي تتشكل بها الأنسجة الدقيقة18,19,20,21,22,23. معظم هذه النماذج تستخدم إما لوحات الربط منخفضة جدا18,19,20,21,22 أو عبر الآبار23 في عملية تشكيل كروي. البروتوكول الموصوف يقدم تقنية القطيرات المعلقة كنموذج بديل خال من البلاستيك وفعال من حيث التكلفة في المختبر ثلاثي الأبعاد للورم. وهذا قد يسهل تقييم أدوار الغدد الليفية في الغدد الليفية والغدد الصماء على انتشار الخلايا السرطانية في شكل ثلاثي الأبعاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يؤثر السياق الذي تنمو فيه خطوط الخلايا التجريبية على ملف التعبير الجيني وتحليل المسار والمعايير الوظيفية. على سبيل المثال، في خلايا سرطان الثدي، يتم الاحتفاظ بالتنسيق بين المسارات السرطانية المختلفة فقط إذا نمت الخلايا السرطانية في تشكيل ثلاثي الأبعاد27. الجينات غير المنظمة في سرطان الجلد ثلاثي الأبعاد وشفرات سرطان الثدي ، ولكن ليس في الخلايا أحادية الطبقة ، هي أكثر صلة بالورم البشري في الجسم الحي28،29. على سبيل المثال، كانت مستويات integrin β1 في الخلايا الظهارية الثديية ونظراء الورم أقل من المستويات التي نمت في شكل 2D29. وعلاوة على ذلك، تميل الخلايا الليفية في الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى الهجرة بشكل واضح من حيث المورفولوجيا والسرعة مقارنة بتلك المستزرعة على البلاستيك30. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التصلب الميكانيكي لركيزة النمو ينشط مسارات محددة تشجع التحول الخبيث للخلايا الظهارية الطبيعية عن طريق إلغاء تحرير كيناز الإشارة خارج الخلية (ERK) / Rho في الخلايا الظهارية31. هذه العوامل تفضل الانتقال من الثقافة التقليدية 2D إلى نماذج كروية ثلاثية الأبعاد ، حيث أن الثقافات ثلاثية الأبعاد أكثر انسجاما مع الأمراض البشرية.
استخدمت الدراسة الحالية أدوات وإمدادات مختبرية تقليدية لإنتاج نموذج كروي للورم ثلاثي الأبعاد. واستجابت الشفرات المتشكلة لإشارات الانتشار الصادرة عن الخلايا الليفية، كما يبين نموها المتزايد بشكل ملحوظ. ينتمي هذا النموذج إلى فئة كرويدات الورم متعدد الخلايا. هناك ثلاث فئات أخرى من كرويات الورم ثلاثي الأبعاد ، بما في ذلك الكائنات السرطانية32 ، ومجالات الورم المشتقة من الأنسجة3334 ، وpheroids متعددة الخلايا العضوية35. في كرويات الأورام متعددة الخلايا ، يتم تعليق الخلايا السرطانية في ظروف التصاق منخفضة للسماح لها بتجميع معا لتشكيل المجالات دون لمس الجزء السفلي من وعاء الثقافة36. وقد استخدمت عدة نهج لتقديم هذه التقنية المستقلة عن المرسى، بدءا من الأنظمة الدوارة، وتقنيات التراكب السائل، والملحقات غير المصقولة منخفضة للغاية على شكل حرف U37. في HCC ، تستخدم معظم الثقافات الكروية في المختبر لوحات المرفق المنخفضة للغاية 24- أو 96-well لتشكيل كرويدات مستديرة18،19،20،21،22. هذه التقنية، ومع ذلك، ليست فعالة من حيث التكلفة ولا تستبعد أي اتصال عرضي بين الخلية والبلاستيك. تستخدم أنظمة أخرى شرائح عبر الآبار23 أو الكبد12 لإنتاج الأنسجة الدقيقة للكبد. استخدام الأنسجة البشرية في العمل التحويلي هو المعيار الذهبي ولكن ليس دائما متاحة أو يمكن الوصول إليها من قبل العديد من مجموعات البحوث. استفاد النهج الحالي من نظرية القطرات المعلقة. يضاف تعليق الخلية بحيث يتم تشكيل كرويدات الورم في واجهة سائلة الهواء يمكن الوصول إليها لتشكيل المجالات واحدة مدورة38. مزايا استخدام هذه التقنية هي عدم وجود أي اتصال بين الخلايا والبلاستيك وسهولة دراسة الحديث المتبادل الأوتوكرين والباراكرين بين الخلايا السرطانية والخلايا الليفية. تم التحقق من صحة هذا النموذج في دراسة أخرى فك أهمية TREM2 غير parenchymal في حماية الكبد من التنمية HCC39. أظهر هذا العمل أن حجم كل من كرويات Hep3B و PLC/PRF5 كان أعلى في التحكم LX2 CM مقابل LX2-overexpressing LX2 CM بطريقة تعتمد على Wnt39.
في الدراسة الحالية ، تم خلط الخلايا الليفية مع الخلايا السرطانية قبل تشكيل كروية للتحقيق في التأثير التكاثري لهذه الثقافة المشتركة. وأضاف آخرون الخلايا الليفية, الخلايا البطانية, والخلايا المناعية مع تعليق الخلايا السرطانية بعد تشكيل كروية الورم لدراسة هجرة الخلايا النجمية إلى tumor40,41. وأظهر النموذج الحالي كروية غير نمطية نمط نمو مماثل للنماذج المبلغ عنها سابقا والأصلي في ورم في الجسم الحي; تظهر كرويدات النمو الأسي تليها مرحلة النمو المتأخرة، على الأرجح بسبب استنفاد المواد الغذائية وتوسيع core42. بدلا من إضافة عوامل النمو والميتوجين للمساعدة في تشكيل كروية، استخدمت هذه الدراسة نهجا أكثر فسيولوجية من خلال وجود عوامل النمو هذه من الاتصال المباشر مع الخلايا الليفية أو إفرازها في CM الخلايا الليفية. من الضروري أن نذكر أن خلايا LX2 يمكن تنشيطها عن طريق العلاج مع TGFβ1 أو PDGF43. وقد عولجت خلايا LX2 مع 10 نانوغرام / مل TGFβ1 لمدة 48 ساعة قبل إزالة وسائل الإعلام لإعدادات تجريبية مختلفة. تم غسل خلايا LX2 ثلاث مرات مع PBS (لاستبعاد أي تأثير TGFβ1 مباشر) ، ثم تمت إضافة وسائط جديدة لمدة 24 ساعة أخرى قبل جمع CM. تسبب CM الذي تم جمعه من LX2 المحفز TGFβ1 في نمو كرويدات Hep3B بمعدل أعلى من CM من التحكم LX2 (البيانات غير المعروضة). هذا النظام المرن يمكن أن تصلح للثقافات المشتركة من الخلايا السرطانية المختلفة زائد / ناقص الخلايا الليفية، فضلا عن خطوط المستمدة من المريض. كما يمكن أن يقدم فحصا متوسط الإنتاجية للأدوية التي يمكن اعتمادها بسرعة وإدراجها في خط أنابيب اكتشاف الأدوية المترجمة لإعلام المخدرات في دراسات الجسم الحي.
أحد قيود الدراسة الحالية هو استخدام خطوط الخلايا الخالدة في تكوين كروي بدلا من الخلايا السرطانية HCC المعزولة حديثا والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. وهناك قيد آخر هو مقارنة نمو كروية Hep3B المثلية بين CM من LX2 وفي الوسائط الطازجة بدلا من CM من خطوط الخلايا غير الليفية الأخرى. ويمكن معالجة هذا القيد الأخير عن طريق التعديل الوراثي لجين من الاهتمام في الخلايا الليفية تليها تطبيق CM من نوع البرية مقابل الخلايا الليفية المعدلة وراثيا إلى كرويات متجانسة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل MYWZ من قبل وزير الدولة للأعمال والطاقة والاستراتيجية الصناعية وجائزة نيوتن 2020 كجزء من صندوق المساعدة الإنمائية الرسمية في المملكة المتحدة “ODA” وصندوق نيوتن. ويدعم SS من قبل أبحاث السرطان المملكة المتحدة المتقدمة زمالة عالم السريرية C53575/A29959. SS, FO, والموارد البشرية تلقي التمويل كجزء من هنتر, بتمويل من خلال شراكة بين أبحاث السرطان في المملكة المتحدة, Fondazione AIRC, و Fundacion Cientifica دي لا Asociacion إسبانولا كونترا إل السرطان.
Materials
| 1x Trypsin | Sigma Aldrich | 59429C | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | ||
| Biorender | Biorender.com | Online | |
| Class II laminar flow BioMAT2 hood | Medair Technologies | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Biosera | M-D1107 | |
| Excel sofware | Microsoft office 365 | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) | life tech | 105000064 | |
| Image J software | Fiji | ||
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513-100ml | |
| Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| Petri dish 90 mm, triple vented | Greiner | 633175 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket | Rely+On™ | SCI-129999 | |
| Ziess inverted microscope | Ziess |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. International Journal of Cancer. , (2021).
- Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6 (2021).
- Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD. Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).
- Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
- Reig, M., et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH. Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).
- Pfister, D., et al. NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC. Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).
- Llovet, J. M., et al. Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference. Hepatology. 73, 158-191 (2021).
- Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design. Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).
- Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).
- Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120 (2018).
- Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models. Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).
- Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903 (2020).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells. Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).
- Shao, H., et al. A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660 (2020).
- Song, Y., et al. Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids. Scientific Reports. 6, 36750 (2016).
- Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
- Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Scientific Reports. 8 (1), 14297 (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Feaver, R. E., et al. Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis. Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954 (2016).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Chen, R., et al. Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).
- Venkataraman, G., et al. Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).
- Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).
- Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
- Delcommenne, M., Streuli, C. H. Control of integrin expression by extracellular matrix. Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).
- Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
- Weiswald, L. B., et al. Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness. British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).
- Rajcevic, U., et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sciences. 12, 39 (2014).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids–old hat or new challenge. International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Esparza-Baquer, A., et al. TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms. Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).
- Dangles-Marie, V., et al. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation. Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Mayer, B., et al. Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas. Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54 (1), 142-151 (2005).
