Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae
Summary
Несмотря на недавние достижения, многие дрожжевые митохондриальные белки по-прежнему остаются со своими функциями совершенно неизвестными. Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод определения субтохондриальной локализации белков, который был основополагающим для выяснения их молекулярных функций.
Abstract
Несмотря на недавние успехи в характеристике митохондриального протеома дрожжей, субпохондриальная локализация значительного числа белков остается неуловимой. Здесь мы описываем надежный и эффективный метод определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков, который считается фундаментальным шагом при выяснении функции митохондриального белка. Этот метод включает в себя начальный этап, который заключается в получении высокочистых интактных митохондрий. Эти митохондриальные препараты затем подвергают протоколу субфракционации, состоящему из гипотонического шока (отека) и инкубации с протеиназой К (протеазой). Во время отека внешняя митохондриальная мембрана избирательно нарушается, позволяя протеиназе К переваривать белки межмембранного космического отсека. Параллельно для получения информации о топологии мембранных белков митохондриальные препараты сначала обрабатывают ультразвуком, а затем подвергают щелочной экстракции карбонатом натрия. Наконец, после центрифугирования фракции гранул и супернатантов из этих различных обработок анализируются с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Постохондриальная локализация, а также мембранная топология интересующего белка получены путем сравнения его западного блот-профиля с известными стандартами.
Introduction
Митохондрии являются важнейшими органеллами эукариотических клеток, которые играют решающую роль в биоэнергетике, клеточном метаболизме и сигнальных путях1. Для правильного выполнения этих задач митохондрии полагаются на уникальный набор белков и липидов, отвечающих за их структуру и функцию. Почковые дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются в качестве модельной системы для исследований митохондриальных процессов, а также для других органелл2. Митохондриальный геном кодирует только восемь белков в дрожжах; подавляющее большинство митохондриальных белков (~99%) кодируются ядерными генами, которые транслируются на цитозольных рибосомах, а затем импортируются в их правильные притохондриальные компартменты сложными механизмами импорта белка3,4,5. Таким образом, митохондриальный биогенез зависит от скоординированной экспрессии как ядерного, так и митохондриального геномов6,7. Генетические мутации, вызывающие дефекты митохондриального биогенеза, связаны с заболеваниями человека8,9,10.
За последние два десятилетия высокопроизводительные протеомные исследования, нацеленные на высокоочищенные митохондрии, привели к всесторонней характеристике дрожжевого митохондриального протеома, который, по оценкам, состоит из не менее 900 белков11,12,13,14. Хотя эти исследования предоставили ценную информацию, суборганелларная локализация каждого белка в четырех митохондриальных подкомпартментах, а именно внешней мембране (OM), межмембранном пространстве (IMS), внутренней мембране (IM) и матрице, все еще требуется. Этот вопрос был частично решен с помощью протеомных исследований двух меньших митохондриальных подкомпартментов (OM и IMS)15,16. Совсем недавно Vögtle и его коллеги сделали большой шаг вперед, создав высококачественную глобальную карту распределения субтохондриального белка в дрожжах. Используя комплексный подход, сочетающий количественную масс-спектрометрию на основе SILAC, различные протоколы фракционирования постохондрий и набор данных из протеомов OM и IMS, авторы выделили 818 белков в четыре митохондриальных подкомпартмента13.
Несмотря на успехи, достигнутые этими высокопроизводительными протеомными исследованиями, наши знания о составе протеома постохондрий далеко не полны. Действительно, среди 986 белков, о которых Vögtle и его коллеги сообщили как локализованные в дрожжевых митохондриях, 168 не могли быть отнесены ни к одному из четырех подсоландохондриальных компартментов13. Более того, авторы не предоставили информацию о мембранной топологии белков, которые, как прогнозировалось, будут периферически прикреплены к периферии митохондриальных мембран. Например, невозможно узнать, обращен ли белок, который был назначен периферически прикрепленным к внутренней мембране, к матрице или межмембранному пространству. Помимо этих недостающих данных из общепротеомных исследований, есть противоречивая информация о суборганелларной локализации значительного числа митохондриальных белков. Одним из примеров является протеаза Prd1, которая была назначена в качестве межмембранного космического белка в общих базах данных, таких как Saccharomyces Genome Database (SGD) и Uniprot. Удивительно, но используя протокол субфракционации, подобный описанному здесь, Фёгтле и его коллеги ясно показали, что Prd1 является подлинным матричным белком13. Как упоминалось выше, необходимо прояснить или переоценить субтохондриальную локализацию многих митохондриальных белков. Здесь мы предоставляем простой и надежный протокол для определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков. Этот протокол был разработан и оптимизирован различными исследовательскими группами и регулярно используется для определения локализации постохондрий, а также мембранной топологии многих митохондриальных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь протокол успешно используется и непрерывно оптимизируется в течение длительного времени для определения локализации белка в притохондриальных компартментах13,14,18,21,22,23.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора А. Цаголова (Колумбийский университет) за предоставление антител, выращенных против субтохондриальных маркерных белков Cyt. b2, αKGD и Sco1. Мы также благодарим д-ра Марио Энрике де Барроса (Университет Сан-Паулу) за полезное обсуждение и комментарии в ходе разработки этого протокола.
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Фонда ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP) (грант 2013/07937-8).
Фернандо Гомес и Хелена Турано также поддерживаются FAPESP, гранты 2017/09443-3 и 2017/23839-7 соответственно. Angélica Ramos также поддерживается Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -. N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
