Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas que desempenham papéis cruciais em bioenergésicos, metabolismo celular e caminhos de ^{sinalização1}. Para executar adequadamente essas tarefas, as mitocôndrias contam com um conjunto único de proteínas e lipídios responsáveis por sua estrutura e função. O fermento saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizado como um sistema modelo para investigações sobre processos mitocondriais, bem como para outras organelas2. Os códigos do genoma mitocondrial para apenas oito proteínas na levedura; a grande maioria das proteínas mitocondriais (~99%) são codificadas por genes nucleares, que são traduzidas em ribossomos citosóicos, e posteriormente importadas em seus compartimentos submitocondriais corretos por máquinas sofisticadas de importação de proteínas3,4,5. Assim, a biogênese mitocondrial depende da expressão coordenada dos genomas nucleares e mitocondriais6,7. Mutações genéticas que causam defeitos na biogênese mitocondrial estão associadas a doenças humanas8,9,10.

Nas últimas duas décadas, estudos proteômicos de alto rendimento direcionados a mitocôndrias altamente purificadas resultaram em uma caracterização abrangente do proteome mitocondrial de levedura, que foi estimado em pelo menos 900 proteínas11,12,13,14. Embora esses estudos tenham fornecido informações valiosas, a localização suborganellar de cada proteína nos quatro subcomentários mitocondriais, ou seja, a membrana externa (OM), o espaço intermembrano (IMS), a membrana interna (IM) e a matriz, ainda são necessários. Esta questão foi parcialmente abordada com estudos proteômicos dos dois subcoentamentos mitocondriais menores (OM e IMS)^15,16. Mais recentemente, Vögtle e colaboradores fizeram um grande passo à frente, gerando um mapa global de alta qualidade de distribuição de proteínas subocondriais na levedura. Usando uma abordagem integrada que combina espectrometria quantitativa de massa baseada em SILAC, diferentes protocolos de fracionamento submitocondrial e o conjunto de dados dos proteomes OM e IMS, os autores atribuíram 818 proteínas nos quatro subcoentamentos ^{mitocondriais13}.

Apesar dos avanços alcançados por esses estudos proteômicos de alto rendimento, nosso conhecimento sobre a composição de proteome subocondrial está longe de ser completo. De fato, entre 986 proteínas relatadas por Vögtle e colaboradores como sendo localizadas em mitocôndrias de levedura, 168 não poderiam ser atribuídas em nenhum dos quatro compartimentos subocondriais13. Além disso, os autores não forneceram informações sobre a topologia da membrana das proteínas que se previu estar periféricamente ligada à periferia das membranas mitocondriais. Por exemplo, não é possível saber se uma proteína que foi atribuída como periféricamente ligada à membrana interna está voltada para a matriz ou o espaço intermembrano. Além desses dados perdidos dos estudos proteome-em toda, há informações conflitantes sobre a localização suborganellar de um número significativo de proteínas mitocondriais. Um exemplo é o prd1 protease, que foi atribuído como uma proteína espacial intermembrana nos bancos de dados comuns, como o Saccharomyces Genome Database (SGD) e o Uniprot. Surpreendentemente, usando um protocolo de subfração semelhante ao descrito aqui, Vögtle e colaboradores mostraram claramente que Prd1 é uma verdadeira proteína ^matricial13. Como mencionado acima, a localização subocondrial de muitas proteínas mitocondriais precisa ser elucidada ou reavaliada. Aqui, fornecemos um protocolo simples e confiável para determinar a localização suborganellar de proteínas mitocondriais de leveduras. Este protocolo foi desenvolvido e otimizado por diversos grupos de pesquisa e tem sido rotineiramente utilizado para determinar a localização subocondrial, bem como a topologia da membrana de muitas proteínas mitocondriais.