出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

ミトコンドリアは、生物エネルギー、細胞代謝、およびシグナル伝達経路において重要な役割を果たす真核細胞の重要なオルガネラ^である1。これらのタスクを適切に実行するために, ミトコンドリアは、その構造と機能を担当するタンパク質と脂質のユニークなセットに依存しています。.出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、ミトコンドリアプロセスおよび他のオルガネラ²の研究のためのモデルシステムとして広く使用されています。酵母の8つのタンパク質についてのミトコンドリアゲノムコード;ミトコンドリアタンパク質の大部分(99%)は、細胞質リボソームに翻訳された核遺伝子によってコード化され、その後、高度なタンパク質輸入機によって正しいサブコションコンパートメントに輸入されます^3,4,5。したがって、ミトコンドリアの生生成は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の協調発現に依存する^6,7。ミトコンドリア生検における欠損を引き起こす遺伝子変異は、ヒト疾患^8,9,10と関連^している。

過去20年間で、高精製ミトコンドリアを標的としたハイスループットプロテオミクス研究は、酵母ミトコンドリアプロテオームの包括的な特性化をもたらし、少なくとも900タンパク質^11,12,13,14から構成されると推定されています。これらの研究は貴重な情報を提供したが、4つのミトコンドリアサブコンパートメントにおける各タンパク質のサブオーガネラの局在、すなわち、外膜(OM)、膜間空間(IMS)、内膜(IM)、およびマトリックスが依然として必要である。この質問は、2つの小さなミトコンドリアサブコンパートメント(OMおよびIMS)^15,16のプロテオミオミ全体の研究で部分的に対処された。最近では、Vögtleと共同研究者は、酵母におけるサブコションドリアルタンパク質分布の高品質なグローバルマップを生成することで大きな前進を遂げた。著者らは、SILACベースの定量的質量分析、異なるサブコセンドローム分画プロトコル、およびOMおよびIMSプロテオームからのデータセットを組み合わせた統合アプローチを用いて、818タンパク質を4つのミトコンドリアサブコンパートメント¹³に割り当てた。

これらのハイスループットプロテオーム研究によって達成された進歩にもかかわらず、提出プロテオーム組成に関する我々の知識は決して完全ではないほどです。実際、Vögtleおよび共同研究者によって酵母ミトコンドリアに局在していると報告された986タンパク質のうち、168は4つのサブソキアドリアコンパートメント¹³のいずれにも割り当てることができなかった。さらに、ミトコンドリア膜の周囲に末梢に付着すると予測されたタンパク質の膜トポロジーに関する情報は提供しなかった。例えば、内膜に末梢に付着したタンパク質がマトリックスや膜間空間に向いているかどうかを知ることはできない。プロテオーム全体の研究からこれらの欠けているデータとは別に、かなりの数のミトコンドリアタンパク質のサブオーガネラの局在に関する矛盾する情報があります。その一例が、サッカロマイセスゲノムデータベース(SGD)やユニプロットなどの一般的なデータベースで膜間空間タンパク質として割り当てられたプロテアーゼPrd1です。驚くべきことに、ここで説明したような亜分解析プロトコルを使用して、Vögtleと共同研究者は、Prd1が本物のマトリックスタンパク質¹³であることを明確に示した。前述のように、多くのミトコンドリアタンパク質の局所的な局在化を解明または再評価する必要があります。ここでは、酵母ミトコンドリアタンパク質の副オーガンエリアの局在を決定するための、シンプルで信頼性の高いプロトコルを提供します。このプロトコルは、様々な研究グループによって開発され、最適化され、多くのミトコンドリアタンパク質の膜トポロジーと同様に、サブソクオントリアル局在化を決定するために日常的に使用されてきました。