Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae
Summary
Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.
Abstract
Nonostante i recenti progressi nella caratterizzazione del proteoma mitocondriale del lievito, la localizzazione sottocondriale di un numero significativo di proteine rimane sfuggente. Qui, descriviamo un metodo robusto ed efficace per determinare la localizzazione suborganellare delle proteine mitocondriali del lievito, che è considerato un passo fondamentale durante la delucidazione della funzione proteica mitocondriale. Questo metodo prevede un primo passo che consiste nell’ottenere mitocondri intatti altamente puri. Questi preparati mitocondriali vengono poi sottoposti ad un protocollo di subfrazionamento costituito da shock ipotonico (gonfiore) e incubazione con proteinasi K (proteasi). Durante il gonfiore, la membrana mitocondriale esterna viene interrotta selettivamente, consentendo alla proteinasi K di digerire le proteine del compartimento spaziale intermembrana. Parallelamente, per ottenere informazioni sulla topologia delle proteine di membrana, i preparati mitocondriali vengono inizialmente sonicati e quindi sottoposti ad estrazione alcalina con carbonato di sodio. Infine, dopo la centrifugazione, le frazioni di pellet e surnatante di questi diversi trattamenti vengono analizzate da SDS-PAGE e western blot. La localizzazione submitocondriale e la topologia di membrana della proteina di interesse si ottengono confrontando il suo profilo western blot con standard noti.
Introduction
I mitocondri sono organelli essenziali delle cellule eucariotiche che svolgono ruoli cruciali nella bioenergetica, nel metabolismo cellulare e nelle vie di segnalazione1. Per eseguire correttamente questi compiti, i mitocondri si basano su un insieme unico di proteine e lipidi responsabili della loro struttura e funzione. Il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per le indagini sui processi mitocondriali, così come per altri organelli2. Il genoma mitocondriale codifica solo per otto proteine nel lievito; la stragrande maggioranza delle proteine mitocondriali (~99%) sono codificate da geni nucleari, che vengono tradotti su ribosomi citosolici e successivamente importati nei loro corretti compartimenti sottocondriali da sofisticati macchinari per l’importazione di proteine3,4,5. Pertanto, la biogenesi mitocondriale dipende dall’espressione coordinata sia del genoma nucleare che di quello mitocondriale6,7. Le mutazioni genetiche che causano difetti nella biogenesi mitocondriale sono associate a malattie umane8,9,10.
Negli ultimi due decenni, studi proteomici ad alto rendimento mirati a mitocondri altamente purificati hanno portato a una caratterizzazione completa del proteoma mitocondriale del lievito, che è stato stimato essere composto da almeno 900 proteine11,12,13,14. Sebbene questi studi abbiano fornito informazioni preziose, la localizzazione suborganellare di ciascuna proteina nei quattro sottocompartimenti mitocondriali, vale a dire la membrana esterna (OM), lo spazio intermembrana (IMS), la membrana interna (IM) e la matrice, è ancora necessaria. Questa domanda è stata parzialmente affrontata con studi proteomici dei due sottocompartimenti mitocondriali più piccoli (OM e IMS)15,16. Più recentemente, Vögtle e collaboratori hanno fatto un importante passo avanti generando una mappa globale di alta qualità della distribuzione delle proteine submitocondriali nel lievito. Utilizzando un approccio integrato che combina la spettrometria di massa quantitativa basata su SILAC, diversi protocolli di frazionamento submitocondriale e il set di dati dei proteomi OM e IMS, gli autori hanno assegnato 818 proteine nei quattro sottocompartimenti mitocondriali13.
Nonostante i progressi raggiunti da questi studi proteomici ad alto rendimento, la nostra conoscenza della composizione del proteoma submitocondriale è lungi dall’essere completa. Infatti, tra le 986 proteine segnalate da Vögtle e collaboratori come localizzate nei mitocondri del lievito, 168 non potevano essere assegnate in nessuno dei quattro compartimenti sottocondriali13. Inoltre, gli autori non hanno fornito informazioni sulla topologia di membrana delle proteine che si prevedeva fossero attaccate perifericamente alla periferia delle membrane mitocondriali. Ad esempio, non è possibile sapere se una proteina che è stata assegnata come attaccata perifericamente alla membrana interna è rivolta verso la matrice o lo spazio intermembrana. Oltre a questi dati mancanti dagli studi a livello di proteoma, ci sono informazioni contrastanti sulla localizzazione suborganellare di un numero significativo di proteine mitocondriali. Un esempio è la proteasi Prd1, che è stata assegnata come proteina dello spazio intermembrana nei database comuni come Saccharomyces Genome Database (SGD) e Uniprot. Sorprendentemente, utilizzando un protocollo di sottofrazionazione simile a quello qui descritto, Vögtle e collaboratori hanno mostrato chiaramente che Prd1 è una vera e propria proteina della matrice13. Come accennato in precedenza, la localizzazione sottocondriale di molte proteine mitocondriali deve essere chiarita o rivalutata. Qui, forniamo un protocollo semplice e affidabile per determinare la localizzazione suborganellare delle proteine mitocondriali del lievito. Questo protocollo è stato sviluppato e ottimizzato da vari gruppi di ricerca ed è stato regolarmente utilizzato per determinare la localizzazione sottocondriale, nonché la topologia di membrana di molte proteine mitocondriali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato è stato utilizzato con successo e continuamente ottimizzato per un lungo periodo di tempo per determinare la localizzazione delle proteine nei compartimenti sottocondriali13,14,18,21,22,23. L’affidabilità e la riproducibilità di questo protocollo dipendono fortemente dalla purezza e dall’integr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) per aver fornito anticorpi sollevati contro le proteine marcatori submitocondriali Cyt. b2, αKGD e Sco1. Ringraziamo anche il Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) per l’utile discussione e commenti durante l’istituzione di questo protocollo.
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (sovvenzione 2013/07937-8).
Fernando Gomes e Helena Turano sono supportati anche da FAPESP, sovvenzioni 2017/09443-3 e 2017/23839-7, rispettivamente. Angélica Ramos è anche supportata da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
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