Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Mitochondrien sind essentielle Organellen eukaryotischer Zellen, die eine entscheidende Rolle in der Bioenergetik, im Zellstoffwechsel und in Signalwegen ^spielen1. Um diese Aufgaben richtig auszuführen, verlassen sich Die Mitochondrien auf einen einzigartigen Satz von Proteinen und Lipiden, die für ihre Struktur und Funktion verantwortlich sind. Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde häufig als Modellsystem für Untersuchungen an mitochondrialen Prozessen sowie für andere Organellen ^verwendet2. Das mitochondriale Genom kodiert für nur acht Proteine in Hefe; Die überwiegende Mehrheit der mitochondrialen Proteine (~99%) wird von Kerngenen kodiert, die auf zytosolische Ribosomen übersetzt und anschließend von hochentwickelten Proteinimportmaschinen in ihre korrekten submitochondrialen Kompartimente importiert ^werden3,4,5. Somit hängt die mitochondriale Biogenese von der koordinierten Expression sowohl des kernigen als auch des mitochondrialen Genoms ^ab6,7. Genetische Mutationen, die Defekte in der mitochondrialen Biogenese verursachen, sind mit menschlichen Krankheiten assoziiert8,9,10.

In den letzten zwei Jahrzehnten führten Hochdurchsatz-Proteomstudien, die auf hochreine Mitochondrien abzielten, zu einer umfassenden Charakterisierung des hefe-mitochondrialen Proteoms, das schätzungsweise aus mindestens 900 Proteinen besteht11,12,13,14. Obwohl diese Studien wertvolle Informationen lieferten, ist die suborganellare Lokalisation jedes Proteins in den vier mitochondrialen Unterkompartimenten, nämlich der äußeren Membran (OM), dem Intermembranraum (IMS), der inneren Membran (IM) und der Matrix, immer noch erforderlich. Diese Frage wurde teilweise mit proteomweiten Studien der beiden kleineren mitochondrialen Unterkompartimente (OM und IMS)^{15,16 beantwortet}. In jüngerer Zeit haben Vögtle und seine Mitarbeiter einen großen Schritt nach vorne gemacht, indem sie eine qualitativ hochwertige globale Karte der submitochondrialen Proteinverteilung in Hefe erstellt haben. Unter Verwendung eines integrierten Ansatzes, der SILAC-basierte quantitative Massenspektrometrie, verschiedene submitochondriale Fraktionierungsprotokolle und den Datensatz aus den OM- und IMS-Proteomen kombiniert, ordneten die Autoren den vier mitochondrialen Unterkompartimenten 818 Proteine ^zu13 zu.

Trotz der Fortschritte, die durch diese Hochdurchsatz-Proteomstudien erzielt wurden, ist unser Wissen über die Zusammensetzung des submitochondrialen Proteoms noch lange nicht vollständig. Tatsächlich konnten von den 986 Proteinen, von denen Vögtle und Mitarbeiter berichteten, dass sie in Hefemitochondrien lokalisiert sind, 168 keinem der vier submitochondrialen Kompartimente zugeordnet ^werden13. Darüber hinaus lieferten die Autoren keine Informationen über die Membrantopologie von Proteinen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie peripher an die Peripherie mitochondrialer Membranen gebunden sind. Zum Beispiel ist es nicht möglich zu wissen, ob ein Protein, das als peripher an die innere Membran gebunden zugeordnet wurde, der Matrix oder dem Intermembranraum zugewandt ist. Abgesehen von diesen fehlenden Daten aus den proteomweiten Studien gibt es widersprüchliche Informationen über die suborganellare Lokalisation einer signifikanten Anzahl von mitochondrialen Proteinen. Ein Beispiel ist die Protease Prd1, die in den gängigen Datenbanken wie Saccharomyces Genome Database (SGD) und Uniprot als Intermembranraumprotein zugeordnet wurde. Überraschenderweise zeigten Vögtle und seine Mitarbeiter mit einem Subfraktionierungsprotokoll ähnlich dem hier beschriebenen deutlich, dass Prd1 ein echtes Matrixprotein ^ist13. Wie oben erwähnt, muss die submitochondriale Lokalisation vieler mitochondrialer Proteine aufgeklärt oder neu bewertet werden. Hier stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Verfügung, um die suborganellare Lokalisation von hefigen mitochondrialen Proteinen zu bestimmen. Dieses Protokoll wurde von verschiedenen Forschungsgruppen entwickelt und optimiert und wurde routinemäßig verwendet, um die submitochondriale Lokalisation sowie die Membrantopologie vieler mitochondrialer Proteine zu bestimmen.