Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryote cellen die een cruciale rol spelen in bio-energetica, cellulair metabolisme en ^{signaalroutes1}. Om deze taken goed uit te voeren, vertrouwen mitochondriën op een unieke set eiwitten en lipiden die verantwoordelijk zijn voor hun structuur en functie. De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is veel gebruikt als modelsysteem voor onderzoek naar mitochondriale processen, evenals voor andere ^organellen2. Het mitochondriale genoom codeert voor slechts acht eiwitten in gist; de overgrote meerderheid van mitochondriale eiwitten (~99%) wordt gecodeerd door nucleaire genen, die worden vertaald op cytosolische ribosomen, en vervolgens geïmporteerd in hun juiste submitochondriale compartimenten door geavanceerde eiwitimportmachines3,4,5. Mitochondriale biogenese hangt dus af van de gecoördineerde expressie van zowel het nucleaire als het mitochondriale ^genoom6,7. Genetische mutaties die defecten in mitochondriale biogenese veroorzaken, zijn geassocieerd met ziekten bij de mens8,9,10.

In de afgelopen twee decennia resulteerden proteomische studies met hoge doorvoer gericht op sterk gezuiverde mitochondriën in een uitgebreide karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, dat naar schatting bestaat uit ten minste 900 eiwitten11,12,13,14. Hoewel deze studies waardevolle informatie opleverden, is de suborganellaire lokalisatie van elk eiwit in de vier mitochondriale subsecties, namelijk het buitenmembraan (OM), de intermembraanruimte (IMS), het binnenmembraan (IM) en de matrix, nog steeds vereist. Deze vraag werd gedeeltelijk beantwoord met proteomische studies van de twee kleinere mitochondriale subcompartementen (OM en IMS)^15,16. Meer recent hebben Vögtle en medewerkers een grote stap voorwaarts gezet door een hoogwaardige wereldwijde kaart van de distributie van submitochondriale eiwitten in gist te genereren. Met behulp van een geïntegreerde aanpak die SILAC-gebaseerde kwantitatieve massaspectrometrie, verschillende submitchondriële fractioneringsprotocollen en de dataset van de OM- en IMS-proteomen combineert, hebben de auteurs 818 eiwitten toegewezen aan de vier mitochondriale subcompartmenten13.

Ondanks de vooruitgang die deze high-throughput proteomische studies hebben geboekt, is onze kennis over de samenstelling van het submitochondriale proteoom verre van compleet. Inderdaad, van de 986 eiwitten die door Vögtle en medewerkers werden gerapporteerd als gelokaliseerd in gist mitochondriën, konden er 168 niet worden toegewezen in een van de vier submitchondriële ^{compartimenten13}. Bovendien gaven de auteurs geen informatie over de membraantopologie van eiwitten waarvan werd voorspeld dat ze perifeer aan de periferie van mitochondriale membranen waren bevestigd. Het is bijvoorbeeld niet mogelijk om te weten of een eiwit dat is toegewezen als perifeer bevestigd aan het binnenmembraan zich naar de matrix of de intermembraanruimte bevindt. Afgezien van deze ontbrekende gegevens uit de proteoombrede studies, is er tegenstrijdige informatie over de suborganellaire lokalisatie van een aanzienlijk aantal mitochondriale eiwitten. Een voorbeeld is het protease Prd1, dat is toegewezen als een intermembraan ruimte-eiwit in de gemeenschappelijke databases zoals Saccharomyces Genome Database (SGD) en Uniprot. Verrassend genoeg toonden Vögtle en medewerkers met behulp van een subfractionatieprotocol vergelijkbaar met het hier beschreven protocol duidelijk aan dat Prd1 een echt ^{matrixeiwit13} is. Zoals hierboven vermeld, moet de submitchondrial lokalisatie van veel mitochondriale eiwitten worden opgehelderd of opnieuw geëvalueerd. Hier bieden we een eenvoudig en betrouwbaar protocol om de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten te bepalen. Dit protocol is ontwikkeld en geoptimaliseerd door verschillende onderzoeksgroepen en is routinematig gebruikt om de submitchondrial lokalisatie te bepalen, evenals de membraantopologie van veel mitochondriale eiwitten.