JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Жидкостная хроматография в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для профилирования метаболитов в бесклеточных системах на основе лизата

Published: September 23, 2021
doi:
10.3791/62852
, , ,
1Graduate School of Genome Science & Technology,University of Tennessee Knoxville, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research,University of Tennessee Knoxville, 3Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

Протоколы описывают высокоэффективные методы жидкостной хроматографии в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для изучения метаболических реакций в сложных бесклеточных системах на основе лизата.

Abstract

Инженерия клеточного метаболизма для целевого биосинтеза может потребовать обширных циклов проектирования-сборки-тестирования-обучения (DBTL), поскольку инженер работает над требованиями выживания клетки. В качестве альтернативы, выполнение циклов DBTL в бесклеточных средах может ускорить этот процесс и облегчить проблемы с совместимостью с хостом. Многообещающий подход к бесклеточной метаболической инженерии (CFME) использует метаболически активные экстракты сырых клеток в качестве платформ для биопроизводства и для быстрого обнаружения и прототипирования модифицированных белков и путей. Реализация этих возможностей и оптимизация производительности CFME требует методов для характеристики метаболома бесклеточных платформ на основе лизата. То есть аналитические инструменты необходимы для мониторинга улучшений в целевых превращениях метаболитов и в выяснении изменений потока метаболитов при манипулировании метаболизмом лизата. Здесь анализ метаболитов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с оптическим или масс-спектрометрическим обнаружением был применен для характеристики производства метаболитов и потока в лизатах E. coli S30. В частности, в настоящем отчете описывается подготовка образцов из лизатов CFME для анализа ВЭЖХ с использованием детектирования показателя преломления (RID) для количественной оценки генерации центральных метаболических промежуточных продуктов и побочных продуктов при превращении недорогих субстратов (т.е. глюкозы) в различные ценные продукты. Также представлен анализ превращения метаболитов в реакциях CFME, подаваемых 13С-меченой глюкозой с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (MS/MS), мощным инструментом для характеристики конкретных выходов метаболитов и метаболического потока лизата из исходных материалов. В целом, применение этих аналитических методов к метаболизму лизата CFME позволяет работать с этими системами в качестве альтернативных платформ для выполнения более быстрых или новых задач метаболической инженерии.

Introduction

Ограничения в инженерии микробов для химического производства могут быть устранены путем рекапитуляции биохимических реакций in vitro, где конкурирующие функции выживания клеток отсутствуют1. Более того, открытая реакционная среда (т.е. отсутствие клеточной мембраны) более поддалась манипуляциям и легче контролируется по сравнению с живыми клетками. Эта основополагающая концепция бесклеточной метаболической инженерии (CFME) была элегантно продемонстрирована восстановлением метаболических путей для синтеза ценных химическихвеществ,таких как водород и монотерпены, с производственными метриками, которые на порядки выше, чем представленные на микробных клеточных фабриках до сих пор1,2,3. . Однако методы очистки целых путей в настоящее время ограничены временем и стоимостью. Альтернативно, бесклеточные метаболические системы могут быть получены из сырых клеточных экстрактов с помощью быстрых и недорогих методов относительно восстановления всего пути4. Центральный метаболизм, который сохраняется в клеточных экстрактах, может быть дополнен энергетическими субстратами (например, глюкозой и ферментативными кофакторами) и солями в буферных растворах для генерации центральных метаболических предшественников в течение более 24 ч5,6. Добавление экзогенных ферментов к реакции CFME на основе лизата позволяет более сложные био-превращения глюкозы в более ценные химические вещества при высоких титрах4,6,7. Хотя выход имеет тенденцию быть скомпрометирован в этих системах из-за их клеточной метаболической сложности, уникальные методы курирования протеомов лизата для преобразования более высокого выхода были и разрабатываются7,8.

Простота проведения метаболических преобразований в бесклеточных системах на основе лизата делает эти платформы отличными либо для перемещения химического производства за пределы клетки в целом, либо для прототипирования новых путей с высокой пропускной способностью перед созданием и тестированием этих конструкций in vivo2,9. Для любого применения инструменты для мониторинга метаболических превращений или наблюдения за общими изменениями метаболического потока в лизатах являются неотъемлемой частью продвижения CFME. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может быть использована для разделения химических компонентов реакций CFME с высоким разрешением и может быть соединена с оптическими или масс-спектрометрическими детекторами для количественной оценки метаболитов5,10. Основной принцип ВЭЖХ заключается в том, что аналиты, растворенные в растворителе (т.е. подвижной фазе) и перекачиваемые через колонну, будут взаимодействовать с конкретным упаковочным материалом колонны (т.е. стационарной фазой)11. В зависимости от своих химических свойств эти аналиты демонстрируют различное время удержания, прежде чем они в конечном итоге элюируются из стационарной фазы и переносятся подвижной фазой в детектор. В настоящем докладе подробно описывается подготовка и анализ реакций ХМЭ на основе лизата E. coli с помощью методов на основе ВЭЖХ, использующих обнаружение RID и MS/MS.

ВЭЖХ в сочетании с обнаружением показателя преломления (ВЭЖХ-РИД) является общедоступным методом быстрой идентификации центральных метаболических прекурсоров и конечных продуктов. Вкратце, МПОГ измеряет, как аналиты изменяют отклонение света подвижной фазой12. Затем сигналы RID, соответствующие целевым аналитам в образцах, могут быть количественно определены путем сравнения с сигналами МПОГ стандартных растворов. В приложениях CFME этот способ обнаружения чаще всего используется с колонками ВЭЖХ, которые разделяют соединения на основе комбинации механизмов исключения размера и лигандного обмена, или ионной хроматографии5,6,8,13. Этот конкретный метод используется для быстрой количественной оценки потребления сахарных субстратов, таких как глюкоза, а также для образования продуктов ферментации, таких как сукцинат, лактат, формиат, ацетат и этанол в реакциях CFME на основе лизата8. Регистрация изменений концентрации этих соединений с помощью ВЭЖХ была полезна как для выяснения потенциала экстрактов сырых клеток для объединения центральных метаболических предшественников, так и для понимания того, как поток путей перенаправляется через ферментативные пути во время сложных метаболических превращений из глюкозы в лизатах6,8,14. Семенные исследования CFME в экстрактах клеток E. coli подтверждают, что ферментационные соединения накапливаются в качестве конечных продуктов катаболизма глюкозы, а также встречаются в качестве нежелательных побочных продуктов в лизатах, которые чрезмерно экспрессируют экзогенные ферменты6,15. Предполагается, что ферментативный метаболизм играет необходимую роль в регенерации окислительно-восстановительных эквивалентов кофакторов (т.е. NAD(P)H и АТФ) для поддержания гликолитических реакций8. Следовательно, оптический метод обнаружения на основе ВЭЖХ, предназначенный для разделения продуктов ферментации, является полезным и широко применяемым инструментом при выполнении различных задач CFME на основе лизата.

CFME может быть реализован для накопления метаболических конечных продуктов, которые не являются углеводами, органическими кислотами или спиртами4. Измерение промежуточных продуктов, которые потребляются так же быстро, как они синтезируются, также может быть желательным10. Хотя ВЭЖХ-RID доступен с точки зрения стоимости и сложности, этот метод ограничен его способностью различать метаболиты только на основе времени удержания. Более широкий спектр метаболитов может быть проанализирован, когда жидкостная хроматография связана с обнаружением MS/MS (LC-MS/MS)16. С помощью этого метода аналиты в подвижной фазе ионизируются и дифференциально обнаруживаются на основе свойств массы и заряда каждой молекулы. Таким образом, знание как отношения массы к заряду метаболита (м/з), так и времени удержания на колонке облегчает разделение большинства метаболических промежуточных продуктов и конечных продуктов с высоким разрешением16. Этот метод обнаружения также может быть соединен с наножидкой хроматографией, которая обеспечивает гораздо более низкие скорости потока и объемы впрыска образца, что позволяет более чувствительно обнаруживать малые молекулы в сложном лисатном фоне17. LC-MS/MS может дополнительно наноситься с изотопной маркировкой, поскольку встроенные метки передают изменения в значениях m/z аналитов18. Таким образом, измерения временных точек, извлеченные из реакции CFME, дополненной субстратом глюкозы 13C6,могут, таким образом, определять конечные или побочные продукты, полученные конкретно из дополненной глюкозы. Хотя этот метод отслеживания изотопов еще не широко применяется в исследованиях CFME, он является мощным инструментом для понимания метаболических превращений в системах CFME на основе лизата, в частности, поскольку солевые контрионы (т.е. ацетат и глутамат) в этих реакциях также катаболизируются в качестве вторичных субстратов19. Таким образом, использование этой техники может нарисовать всеобъемлющую картину метаболизма глюкозы в лизатах, которая по сей день не полностью понята. Здесь протокол детализирует метод наножидкой хроматографии, связанный с наноэлектросыпной ионизацией (нано ESI) MS / MS, который может быть использован для опроса возможной модели метаболизма глюкозы, в частности в лизатах E. coli (рисунок 1). Модель основана на сообщениях о ферментативных путях и пентозфосфатном пути, активном в лизатах E. coli, полученных изштаммов,выращенных в богатых средах5,6,8,14. Метод дополнительно используется для исследования производства аминокислот, поскольку современные знания об анаболизме аминокислот из глюкозы в лизатах ограничены несколькими примерами, такими как синтез ароматических аминокислот7. Учитывая в основном полярную природу конечных продуктов и промежуточных продуктов в этих путях (т.е. органических кислот, сахарных фосфатов и аминокислот), здесь использовалась обратная фазовая жидкостная хроматография. Этот метод отделяет полярные соединения путем элюирования от неполярной стационарной фазы. Затем эти соединения ионизировали нано ESI в режиме отрицательных ионов, что позволяет обнаруживать аналиты с по меньшей мере одним отрицательным элементарным зарядом и, таким образом, полезно для обнаружения кислотных соединений. Этот метод используется здесь для анализа метаболитов, полученных из глюкозы 13С, и демонстрирует полезность LC-MS / MS для понимания метаболизма глюкозы в лизатах.

Protocol

1. Время начала, остановки и обработки курсов CFME реакций для количественной оценки ВЭЖХ-RID. Разморозьте предварительно приготовленные лизаты E. coli и подготовьте остальные компоненты реакции на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Лизаты, о которых сообщается здесь, были получены из E. coli BL21DE3-Star, выращенной в среде 2xYPTG (1,8 % глюкозы) до средней фазы. Подготовьте соответствующий объем фильтруемо-стерилизованного (0,20 мкм порового фильтра) буфера S30 (1 М Трис-ОАк с поправкой на рН 8,2 с ледниковой уксусной кислотой, 1,4 М Мг(ОАк)2и 6 М KOAc). Подготовьте энергетическую смесь, содержащую глюкозу, соли глутамата, АТФ, коэнзим А, NAD+, буфер Бис-Триса и дикалийфосфат в буфере S30. Конечные концентрации в желаемом реакционном объеме, используемом для приготовления реакций CFME, здесь составляли 100 мМ глюкозы, 18 мМ глутамата магния, 15 мМ глутамата аммония, 195 мМ глутамата калия, 1 мМ АТФ, 0,2 мМ коэнзима А, 1 мМNAD+,150 мМ бис-триса и 10 мМ дикалийфосфата. Объедините компоненты в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл для получения конечных реакций с 4,5 мг/мл общего белка лизата. Здесь реакции CFME были получены с конечными объемами 50 мкл в трехкратном объеме на одну точку времени. Инкубируйте реакции при 37 °C для соответствующих таймфреймов.ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро и добавляйте лизат в качестве конечного компонента реакционной смеси для предотвращения преждевременных метаболических реакций с солями глюкозы и глутамата. Минимальное потребление глюкозы может произойти в зависимости от того, как долго реакционные смеси инкубируются на льду. Прекратите реакции и обработайте образцы для анализа ВЭЖХ-RID. Чтобы завершить трипликатные реакции в соответствующие моменты времени, немедленно добавьте равный объем 5% трихлоруксусной кислоты к конечному объему реакции каждого образца (т.е. 50 мкл 5% трихлоруксусной кислоты к реакции 50 мкл). Разбавьте каждый образец стерильной водой при 2-кратном объеме реакции (т.е. 100 мкл). Чтобы рекапитулировать нулевое время, смешайте тот же объем 5% трихлоруксусной кислоты, что и общий конечный объем реакции (т.е. 50 мкл) с лизатом перед добавлением остальных компонентов реакции. Эта ступень подкисления осаждает ферменты лизата, прежде чем они значительно метаболизируют глюкозу. Вращать образцы и центрифугу на настоечную микроцентрифугу при 11 600 х г в течение 5 мин и переносить супернатанты, содержащие органические аналиты, в чистые пробирки. Храните образцы при -20 °C, если анализ ВЭЖХ должен проводиться в другой день. Убедитесь, что хранящиеся образцы разморажены на льду, прежде чем переходить к следующему шагу. Фильтруйте каждое супернатант с помощью порового фильтра 0,22 мкм. В качестве альтернативы шприцам используйте центрифужные трубчатые фильтры и центрифугируют супернатанты при 16 300 х г в течение 1 мин. Переложите каждый фильтрат в чистый стеклянный флакон ВЭЖХ. Загрузите флаконы в лоток автопробоотборника HPLC. Подготовьте образцы для создания стандартных кривых. Готовят исходный раствор всех целевых аналитов, растворенных в буфере S30 в эквимолярных количествах выше начальной концентрации глюкозы в реакциях CFME. Здесь готовили стоковый раствор, состоящий из 150 мкМ глюкозы, сукцината, лактата, формата, ацетата и этанола. Выполняют последовательные разбавления 1:1 (v/v) из запасного раствора для получения трехдипликатных растворов 50 мкл с конечными концентрациями в диапазоне от 0 мкМ до концентрации запаса (т.е. 150 мкМ). Разбавить каждый раствор 50 мкл 5% трихлоруксусной кислоты и 100 мкл стерильной воды. Повторите шаги 1.3.4-1.3.5.ПРИМЕЧАНИЕ: Запуск растворов для генерации стандартной кривой с каждой партией образцов для обеспечения точной количественной оценки концентраций метаболитов. 2. Подготовка системы ВЭЖХ к обнаружению метаболитов. Под вытяжным капюшоном приготовьте стерилизованный раствор серной кислоты 5 мМ из деионизированной и фильтруемой воды. Добавьте ~550 мкл 98% раствора серной кислоты класса ВЭЖХ в 2 л воды для приготовления 5 мМ серной кислоты.ВНИМАНИЕ: Серная кислота является опасным химическим веществом, и работа под вытяжным капюшоном с надлежащими лабораторными СИЗ предотвращает вдыхание, контакт с кожей и зрительный контакт. Концентрированная серная кислота активно реагирует с водой и должна добавляться непосредственно в воду, а не наоборот. Хранить в прохладном, сухом месте вдали от прямых солнечных лучей и соблюдать надлежащие меры по утилизации отходов, установленные лабораторией. Держите 2-л бутылку серной кислоты 5 мМ, инкубированную на водяной бане рядом с инструментом ВЭЖХ. Установите водяную баню на 35 °C. Поместите трубку с фильтром растворителя в бутылку растворителя и прикрепите другой конец к модулю дегазатора в соответствии с модулем насоса.ПРИМЕЧАНИЕ: Продувка системы свежеприготовленным растворителем перед установкой колонны является хорошей практикой обращения с прибором. Оснастите прибор ВЭЖХ колонной ВЭЖХ в соответствии с модулем RID. Поместите колонку на водяную баню с 35 °C, если столбчатый термостат недоступен. Подготовьте модуль RID для анализа при 35 °C в программном обеспечении системы хроматографических данных (CDS), установленном на системном компьютере. В меню Вид выберите Метод и запустите Представление элементов управления. Щелкните правой кнопкой мыши на Pump Module > Method. Установите расход на 0,55 мл·мин-1 и нажмите кнопку Вкл., чтобы запустить насос.ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонна находилась на хранении до того, как была установлена на ВЭЖХ, увеличьте расход до 0,55 мл·мин-1 после уравновешивания колонны в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Щелкните правой кнопкой мыши на панели, соответствующей методу > модуля RID. Установите температуру модуля детектора RI на 35 °C и выберите Вкл., чтобы начать прогрев модуля детектора RI. Щелкните правой кнопкой мыши на панели RID Module > Control. Выберите Вкл. для эталонной ячейки продувки в течение не менее 15 мин при использовании свежего растворителя или 1 ч, если различные растворители протекали через детектор RI до этой установки. Нажмите на кнопку В включено. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите насос и детектор RI включены для достижения стабильной базовой линии на онлайн-графике. На это влияют колебания температуры в лаборатории и могут занимать до 4 ч или дольше. Держите систему включенной в течение ночи перед загрузкой образца. 3. Создание метода изократического разделения ВЭЖХ органических продуктов брожения в ЦДС. В строке меню выберите Метод > Новый метод. Выберите метод > Сохранить метод как [MethodName].M. Выберите метод > Изменить весь метод > инструменте/приобретении На вкладке «Бинарный насос» установите расход на 0,55 мл·мин-1. В разделе Растворителивыберите букву, соответствующую входу растворителя на модуле насоса, и установите для нее значение 100% для изократического элюрования. Установите пределы давления на 0 и 400 бар и введите 30 минут в качестве stoptime. На вкладке Пробоотборник установите для параметра Объем впрыска значение 50 мкл. Выберите параметр Как насос/Без ограничения в разделе Время остановки. Установите для дополнительных дополнительных параметров скорость вытягивания, скорость извлеченияи положение вытягивания значение 200 мкл·мин-1,200 мкл·мин-1и -0,5 мм. На вкладке RID установите для установки значение Температура оптического блока на 35 °C. В разделе Сигналвыберите Получить для Сигнала и >0,2 мин для Пиковой широты. Выберите параметр «Как насос/инжектор» для параметра «Время остановки». В разделе Дополнительно на вкладке RID установите для параметра Аналоговый выход значение 5% нулевого смещения и 500 000 нRIU для затухания. Выберите опцию Положительный для полярности сигнала и опцию В включено для автоматического нуля перед анализом. Сохраните метод, выбрав Метод > Сохранить метод. Загрузите метод, выбрав Метод > Метод загрузки > [MethodName]. М. 4. Создание таблицы последовательностей для автовыборки и запуск системы ВЭЖХ-RID для сбора данных. В строке меню выберите Последовательность > Новый шаблон последовательности. Выберите Последовательность > Сохранить шаблон последовательности как [SequenceTemplateName]. С. Выберите Последовательность > Таблица последовательностей. Добавьте ‘n’ строк, соответствующих ‘n’ флаконам, затем введите позиции флаконов и имена образцов в разделе Флакон и Имя образцасоответственно, в соответствии с их расположением на лотке автосамплера. Выберите Метод, созданный на шаге 3, в раскрывающемся меню Имя метода и введите 50 мкл в виде Inj/Флакона (Инъекция на флакон) для каждой строки. Нажмите кнопку Применить и сохраните шаблон последовательности, выбрав Шаблон последовательности > Сохранить шаблон последовательности. Убедитесь, что шаблон последовательности загружен, выбрав Sequence > Load Sequence Template > [SequenceTemplateName]. С. После достижения стабильного базового уровня на онлайн-графике щелкните правой кнопкой мыши панель RID Module > Control > Off Recycling Valve, чтобы направить поток растворителя через детектор RID в отходы. Чтобы начать сбор данных, выберите Sequence в строке меню Sequence > Run. 5. Извлечение и анализ данных после запуска. Выберите представление Анализ данных в меню Вид. Найдите имя файла последовательности в списке файлов в левой части экрана. На центральной панели экрана перейдите в режим Выбора представления сигнала > сигнал RID, чтобы просмотреть образцы хроматограмм. Выберите строку, соответствующую стандартному образцу высокой концентрации, на верхней панели экрана. Обратите внимание на время удержания пиков целевого анализируемого вещества на отображаемой хроматограмме. Пики, соответствующие целевым аналитам, будут расположены вдоль оси времени удержания в виде глюкозы, сукцината, лактата, формиата, ацетата и этанола(дополнительный рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Первый большой пик на хроматограмме соответствует трихлоруксусной кислоте. Его единицы RI должны быть согласованы во всех стандартных образцах кривых. Проверьте время хранения каждого целевого анализируемого объекта, запустив каждое соединение как отдельный образец. Извлеките пиковые области для каждого целевого аналита из хроматограмм эталонов и образцов реакции. Различайте, хорошо ли интегрированы пики интереса программным обеспечением. Нарисуйте красную линию в качестве основания каждого пика, чтобы получить точно интегрированную область под кривой. Если автоматическая интеграция не удалась (т.е. красная линия неровная), нажмите кнопку «Ручная интеграция» в наборе инструментов интеграции и вручную нарисуйте пиковую базу для интеграции пиковой области.ПРИМЕЧАНИЕ: Если для целевого аналита в одном образце необходимо выполнить ручную интеграцию, сохраняйте согласованность и вручную интегрируйте один и тот же анализируемый анализ во всех образцах. Выберите инструмент «Курсор» из общего набора инструментов, чтобы щелкнуть по правильно интегрированным пикам. Область пика и соответствующее время удержания выбранного пика будут выделены в виде строки таблицы на нижней панели экрана. Чтобы экспортировать пиковые области, выберите Файл > Экспорт > Результаты интеграции. Количественная оценка целевых концентраций анализируемого вещества с использованием стандартных кривых. Построение значений пиковой площади и известных концентраций образцов в электронной таблице. Щелкните правой кнопкой мыши по нанесенным данным, Добавьте линию тренда > Формат Линии тренда > Отобразить уравнение на графике. В отдельной электронной таблице используйте уравнения стандартных линий тренда кривой для преобразования значений пиковой площади в концентрации для каждого анализируемого вещества из каждой выборки. Рассчитайте средние пиковые области и стандартные значения ошибок в трех значениях для визуализации данных. 6. Время запуска, остановки и обработки изотопного отслеживания реакций CFME для количественной оценки LC-MS/MS. Настройте тройные реакции на момент времени (за исключением нулевого времени) на льду, как описано в 1.1-1.2. Однако вместо глюкозы используют конечную концентрацию 100 мМ 13С6-глюкозы в реакциях. Инкубируют реакции при 37 °C в течение 1 ч, 2 ч и 3 ч. Для прекращения вспышкой заморозьте реакции в жидком азоте и храните их при -80 °C. Пропустите этот шаг хранения для анализа в тот же день.ПРИМЕЧАНИЕ: Трихлоруксусная кислота не использовалась для остановки реакций из-за интерференции кислоты при обнаружении некоторых центральных метаболитов углерода через LC-MS/MS. Вместо этого экстракционный растворитель, содержащий муравьиную кислоту (этап 6.3), использовали для осаждения метаболических белков, поскольку масса муравьиной кислоты ниже предела обнаружения, о котором сообщалось способом MS/MS. Приготовьте 50 мл экстракционного растворителя. Соедините и вихрь 20 мл ацетонитрила, 20 мл метанола и 10 мл воды (все марки LC-MS) в 50 мл центрифужной трубки вместе с 0,199 мл муравьиной кислоты, чтобы получить раствор 0,1 мл. Охладите растворитель до 4 °C во время экстракции и храните растворитель при -20 °C, когда он не используется. Обработка образцов для анализа LC-MS/MS В день анализа пипетку на каждый образец набирают эквивалентный объем экстракционного растворителя (т.е. 50 мкл). Если образцы были заморожены, добавьте экстракционный растворитель до того, как образцы полностью разморозятся, чтобы предотвратить реактивацию метаболизма глюкозы. Выполните все этапы обработки образцов на льду. Чтобы рекапитулировать нулевое время, пипеткуют конечный объем экстракционного растворителя (т.е. 50 мкл) до соответствующего объема лизата для желаемой конечной концентрации в реакции (т.е. 4,5 мг/мл в реакционном объеме 50 мкл). Добавьте остальные компоненты реакции, как по состоянию на этапе 1.2. Эта ступень подкисления осаждает ферменты лизата, прежде чем они значительно метаболизируют глюкозу. Инкубируют образцы в экстракционном растворителе на льду в течение 30 мин с легким встряхиванием, затем центрифугируют образцы при 21 000 х г в течение 15 мин при 4 °C, чтобы отделить супернатант от осажденного белка. Переложите 50 мкл супернатанта на флаконы автосамплера и загрузите флаконы на лоток в пределах автопроскровывателя с 4 °C. Храните остальную часть супернатанта при -20 °C для будущих анализов. 7. Настройка системы LC для анализа LC-MS/MS. Готовят 1 л растворителя А, полностью растворив 77,08 мг ацетата аммония в 950 мл воды и 50 мл изопропанола. Приготовьте 1 л растворителя B с 650 мл ацетонитрила, 300 мл воды и 50 мл изопропанола вместе с 77,08 мг ацетата аммония. Убедитесь, что все растворители имеют класс LC-MS. Подключите баллоны с растворителями, содержащие растворители A и B, к насосу. Продувка системы с высокой скоростью потока для удаления/ограничения любого загрязнения воздуха, которое могло произойти во время оборудования растворителей в системе LC. Оснастите систему реверсивной фазированной колонной C18 (длина колонны 30 см, внутренний диаметр 75 мкм и диаметр частиц 5 мкм). Подготовь колонну к системе LC-MS путем протекания 100% растворителя B и медленного перетекания растворителя A до 100%.ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники колонн были подготовлены на месте с использованием съемника микропипетки и упакованы с напорными ячейками и гелием. 8. Создание метода получения и интерпретации данных LC-MS/MS для системы LC, связанной с масс-спектрометрами с преобразованием Фурье и масс-спектрометрами ионной ловушки. Откройте программное обеспечение Tune Plus, чтобы отредактировать файл настроек для метода MS. В строке меню откройте предустановленный файл отрицательной настройки режима. Выберите ScanMode в строке меню, затем выберите Определить окно сканирования. Установите для параметра времени микросканирования для MSn значение 1 как для ионной ловушки, так и для FT. Перейдите в настройки источника Nano-ESI и установите напряжение распыления на 4 кВ. Модулируйте это до тех пор, пока не будет получен приемлемый электрораспрей; Как правило, допустимое электрораспылие может быть достигнуто в диапазоне 2-5 кВ. Сохраните файл мелодии. Создайте новый метод LC с помощью мастера настройки программного обеспечения для сбора и интерпретации данных прибора. Откройте > мастер настройки последовательности > > . Поскольку эти методы не требуют использования нагревателя столбцов, пропустите шаг Контроль температуры. В разделе Параметры насоса градиента потокавыберите Многоступенчатый. В следующем окне вставьте 7 строк и установите расход для каждой строки на 0,1 мл·мин-1. Введите следующие параметры для каждого ряда: от 0-3 мин, подать 100% растворитель А; через 3-9 мин вводят градиент от 100% растворителя А до 20% растворителя В; через 9-19 мин вводят новый градиент от 20% растворителя В до 100% растворителя В; от 19-27 мин, выдерживают на 100% растворителе В; через 27-28 мин устанавливают градиент обратно на 100% растворитель А; от 28-44 мин, промывку и повторное обустройство колонны для последующих прогонов путем удержания на 100% растворителе А. Включают заключительную ступень для снижения расхода до 0,03мл·мин-1 по завершении пробега для сохранения растворителя, когда ЛК не используется. Примените настройки по умолчанию для параметров пробоотборников > давление насоса в качестве параметра сбора, используйте время сбора по умолчанию и используйте параметры давления насоса по умолчанию. Создайте метод MS/MS, выбрав значок Orbitrap Velos Pro MS на боковой панели в окне Настройка прибора. Нажмите на Новый метод > зависимого от данных MS/MS. Установите для установки значение времени получения длины выполнения LC (т. е. 44 мин), для сегмента — значение 1 и для событий сканирования — значение 11. В поле Tune File выберите отредактированный файл из шага 8.1.ПРИМЕЧАНИЕ: Первым событием является сканирование предшественника MS1 с использованием преобразования Фурье MS (FTMS). Последующими 10 событиями будут сканирования MS2, выбирающие 10 наиболее интенсивных и уникальных ионов в каждом сканировании предшественника для фрагментации MS2. Для события 1 в разделе Описание сканирования установите для анализатора значение FTMS, а для полярности — значение Отрицательный. В настройках MSn используйте разрешение 30 000 и нормализованную энергию столкновения 35 В. Установите диапазоны сканирования на 50 м/з для первой массы и 1800 м/з для последней массы для захвата малых молекул. Для событий со 2 по 11 в разделе Описание сканирования установите для анализатора значение Ионный треппинг. Выберите «Зависимое сканирование» и нажмите «Настройки» > «Глобальное > динамическое исключение» и выберите «Включить»; установите продолжительность повторения 30 с и продолжительность исключения 120 с, чтобы исключить повторное сканирование в непосредственной близости. Перейдите в настройки событий сканирования и установите значение «Массовое значение от события сканирования» до 1 для всех событий MS2 (со 2 по 11). Чтобы сканировать 10 самых интенсивных ионов, установите каждое событие сканирования MS2 для обнаруженияn-го наиболее интенсивного иона от 1-го до 10-го. Поэтому установите событие 2 для обнаружения 1 какn-го наиболее интенсивного иона, событие 3 для обнаружения 2 и так далее. Закройте окно установки и перейдите в раздел Файл > Сохранить как [Method_Name].meth.ПРИМЕЧАНИЕ: Для общего использования, технического обслуживания и калибровки прибора LC и масс-спектрометра обратитесь к инструкциям по эксплуатации и руководствам, поставляемым производителем. 9. Настройка последовательности выполнения и запуск запуска LC-MS/MS. Настройте последовательность выполнения с помощью программного обеспечения для сбора и интерпретации данных системы LC-MS/MS. В Roadmap > Sequence Setupщелкните правой кнопкой мыши таблицу, чтобы вставить столько строк, сколько образцов. Для каждой строки установите для Inj Vol значение 5 мкл, а для Position — соответствующее положение флакона на лотке автоподборника. Введите имена файлов в качестве имен образцов и задайте требуемый путь к файлу для результатов выполнения.ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые флаконы, содержащие растворитель А, могут быть запущены в начале последовательности и между каждым набором тройных образцов (каждый набор временных точек) для промывки колонны. Чтобы начать запуск, выделите все имена файлов в последовательности. В строке меню выберите Действия > Последовательность выполнения > ОК. 10. Консолидация файлов и поиск предварительных аннотаций на MZmine 2.53. Откройте MZmine и импортируйте выходные файлы ‘.raw’ из шага 9.1. В строке меню выберите Методы необработанных данных > Импорт необработанных данных. Выберите файлы, соответствующие образцам. Создайте список пиков, различающих сканирование MS1 и MS2. В строке меню методы необработанных данных > обнаружение функций > MS/MS Peaklist Builder. Соответствующие настройки включают в себя m/z Window, установленное на 0,01, и Time Window, установленное на длину прогона. В разделе Настройка фильтров выберите Отрицательный как Полярность и Центроидированный как Тип спектра. В строке меню перейдите в список компонентов Методы > Обнаружение компонентов > Peak Extender. Установите допуск m/z на 0,005 м/z или 10 ppm и минимальную высоту на 1E3. Этот шаг создаст полностью конкретизированные пики. Удалите повторяющиеся пики. Вернитесь к списку функций Методы > Фильтрация > Дубликат пикового фильтра. Соответствующие настройки включают допуск m/z, установленный на 0,005 м/z или 10 ppm, и допуск RT, установленный на 5 мин. Чтобы выровнять пики в похожих файлах данных (т. е. трехкратных реакциях), вернитесь к методам списка функций > нормализации > калибровке времени хранения. Обязательно обработайте три образца вместе и не оставляйте заготовки. Соответствующие настройки включают допуск m/z, установленный на 0,005 м/z или 10 ppm, допуск RT, установленный на 3 мин абсолютный (мин), и минимальная стандартная интенсивность, установленная на 1E3. Выравнивание пиков из всех файлов по m/z и время хранения из методов списка объектов > выравнивания > ransAC Aligner. Установите допуск m/z на 0,005 м/z или 10 ppm, допуск RT и допуск RT после коррекции на 44 и 39 мин соответственно, итерации RANSAC на 0, минимальное количество точек до 10% и пороговое значение на 1. Установите флажок Требовать одинаковое состояние заряда. Исправлено для всех точек данных, которые могли быть потеряны на предыдущих шагах в методах списка функций > заполнении пробелов > Peak Finder. Соответствующие настройки включают допуск интенсивности, установленный на 50%, допуск м/з на 0,005 м/з или 10 ppm, и допуск RT, установленный на 3 мин. Включите коррекцию RT. 11. Расчет отрицательных модовых масс 13С-меченых метаболитов, полученных из глюкозы, и поиск m/z признаков этих аналитов в отфильтрованных данных. Рассчитайте массы 13С-меченых метаболитов из метаболизма глюкозы для целенаправленного поиска. Рассчитайте моноизотопную массу каждого целевого соединения из числа атомов в молекулярной формуле соединения и моноизотопных масс каждого элемента20. Вычислите отрицательную модовую массу соединения [M-H], вычитая массу 1 протона (1,007276 Da) из моноизотопной массы. Это масса, обнаруженная отрицательным режимом обнаружения МС после того, как молекулы удаляются от иона водорода во время ионизации. Из отрицательной модовой массы вычислите массу метаболита,включающего 13 С. Здесь были рассчитаны массы изотопологов, которые максимально включают 13С-меток, полученных из глюкозы. Используйте рассчитанные массы 13С-меченых метаболитов для поиска и аннотирования признаков m/z из результатов MZmine. Для каждого возможного попадания вычислите массовую погрешность (ppm), используя следующее уравнение:ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные значения m/z с погрешностью массы <15 ppm рассматривались в качестве м./ч в текущем анализе. Вручную проверьте спектры предполагаемой аннотации в качественном браузере для подтверждения аннотаций. Откройте дорожную карту > Qual Browser. На панели инструментов откройте raw File, чтобы импортировать необработанные MS-данные каждого образца. Провести линию под нужным диапазоном времени удержания (т.е. соответствующим предполагаемой аннотации) на общей ионной хроматограмме (верхняя панель) для просмотра массового спектра (нижняя панель). Щелкните правой кнопкой мыши по спектру и введите диапазон масс, которые охватывают m/z целевого аналита. Проверьте, имеют ли мнимые аннотации отчетливые пиковые сигналы, которые значительно превышают шум(дополнительный рисунок 2). Рассчитайте средние пиковые области и стандартные ошибки положительных аннотаций по биологическим репликам для каждой точки времени. Визуализируйте данные (т.е. на гистограмме) для наблюдения за тенденциями метаболизма глюкозы.

Representative Results

Для количественной оценки бесклеточного синтеза на основе лизата общих продуктов ферментации из глюкозы, лизаты, полученные из штаммов, выращенных в среде 2xYPTG, получали 100 мкМ глюкозы в качестве первичного источника углерода8. Реакции прекращались в течение 24 ч путем подкисления белка. Фильтрованные супернатанты, содержащие пируват, сукцинат, лактат, формат, ацетат и этанол, полученные из катаболизма глюкозы, загружались в модуль автосэмплера системы ВЭЖХ, оснащенной модулем RID. Флаконы с фильтрованными смесями ферментативных конечных продуктов и глюкозы при концентрациях 1,17 мкМ, 2,34 мкМ, 4,69 мкМ, 9,38 мкМ, 18,75 мкМ, 37,50 мкМ, 75 мкМ и 150 мкМ в буфере S30 загружали в качестве эталонов. Аналиты были элюированы из-за изокрешной колонки в МПОГ. Пики глюкозы, сукцината, лактата, фориата, ацетата и этанола в диапазоне от 1 до 150 мкМ могут быть разрешены с помощью RID. Пиковые области для глюкозы были получены путем ручной интеграции на основе данных МПОГ для временных ходов и стандартных кривых выборок. Извлеченные пиковые участки для сукцината, лактата, формата, ацетата и этанола были взяты из автоматически интегрированных сигналов. Все стандартные кривые (пиковая площадь и известная концентрация) имели значенияR2 >0,99 и были линейными во всем диапазоне концентраций, используемых здесь. Молярные концентрации для всех целевых аналитов были рассчитаны на основе их соответствующих стандартных кривых. Глюкозу потребляли в течение первых 3 ч реакции и в основном ферментировали до лактата(фиг.2А,В). Накопление этанола также значительно происходило в течение первых 3 ч реакции и прекращалось после этого(рисунок 2С). Наблюдение за значительным производством лактата и этанола со значительным потреблением глюкозы через 3 ч не было беспрецедентным, поскольку пути производства лактата и этанола позволяют регенерацию 1 чистого моля NAD+ из гликолитического NADH, необходимого для продолжения потребления глюкозы посредством гликолиза(Рисунок 1). Таким образом, лактат и этанол можно рассматривать как основные конечные продукты ферментации в бесклеточном метаболизме глюкозы на основе лисата. Ацетат первоначально присутствовал в реакциях в качестве компонента буфера S30 и неожиданно накапливался только из-за метаболизма через 6 ч, когда потребление глюкозы замедлилось(рисунок 2D). Этот результат говорит о том, что ферментация ацетата не обязательно обеспечивает быстрый гликолитический поток в более ранние временные точки. Между тем, формат и сукцинат синтезировались в виде незначительных продуктов брожения(рисунок 2E,F). В целом, метод позволил пролицентную оценку истощения сахарного субстрата и образования ферментативного продукта в лизатах E. coli S30. Здесь специально применялось обнаружение РС для профилирования метаболизма глюкозы лисата. Лизаты, полученные из штаммов, выращенных в среде 2xYPTG, получали 13C6-глюкозув качестве источника углерода. Реакции CFME проводили в трехместном направлении в течение 0 ч, 1 ч, 2 ч и 3 ч. Образцы из каждой точки времени загружались в систему LC, оснащенную колонной обратной фазы и соединенную с масс-спектрометрами с преобразованием Фурье и масс-спектрометрами ионной ловушки. Спектры отрицательного ионного режима были получены и обработаны для анализа органических кислот, фосфатов сахара и аминокислот. Были проведены поиски расчетных теоретических масс 13С-меченых видов, принадлежащих к центральному метаболизму углерода, для идентификации специфически соединений, полученных из глюкозы. Основываясь на используемых условиях культивирования исходного штамма и предыдущих сообщениях об активных путях в E. coli CFME, здесь предполагается, что протеом лизата содержит метаболическую сеть, которая подает глюкозу в гликолитическую ферментацию, пентозфосфатный путь и, возможно, аминокислотный анаболизм5,6,7,8,14 (фиг.1). Поэтому поиск был сужен до членов этих путей, из которых 16 метаболитов, включающих метки 13С, полученные из глюкозы, были однозначно аннотированы(Дополнительная таблица 1). 13 13 С6-глюкоза потреблялась путем потребления посредством гликолиза, о чем свидетельствуют колебания гликотического промежуточного изобилия(рис. 3А-Е). В соответствии с данными ВЭЖХ-RID глюкоза накапливалась до 13С3-лактата,а также ферментировалась до 13С3-сукцинатав течение первых 3 ч реакции(фиг.4А,В). Образование изотополога 13С3-сукцинатаподдерживает предложенную модель метаболизма глюкозы лизата(фиг.1),где сукцинат, вероятно, будет генерироваться карбоксилированием молекулы 3-углеродного фосфоенолпирувата (PEP), а не входом 2-углеродной молекулы ацетил-КоА в цикл ТЦА. Активация цикла ТЦА предполагалась в предыдущих исследованиях CFME, но другие 13С-меченых промежуточных продуктов ТЦА не были обнаружены здесь8,19,21. 13 13 СинтезС3-аспартата, однако, происходил в течение первого ч и потреблялся, укрепляя идею о том, что ПЭП непосредственно превращается в оксалоацетат(Рисунок 1, Рисунок 6С). Данные отражают протеом лизата из исходных штаммов, собранных во время ферментативного роста на богатых глюкозой средах (2xYPTG). Это также подразумевает, что остальные ферменты TCA, не участвующие в производстве сукцината, образуют окислительную ветвь TCA(рисунок 1). Однако ни один из метаболитов в этом пути не был обнаружен, возможно, потому, что высокие концентрации глутамата, добавленного в реакцию CFME в качестве противоотведения соли, предотвращают прогрессирование этой ветви. Данные ВЭЖХ-RID дополнительно дополняются отсутствием обнаружения 13С2-ацетата в течение 3-часового периода реакции, что свидетельствует об отсутствии накопления ацетата из глюкозы до 3 ч(рисунок 2B). Однако прямой предшественник ацетата, ацетил-фосфат (ацетил-П), накапливается, предполагая, что Pta-плечо пути Pta-AckA для синтеза ацетата из ацетил-КоА является активным(рисунок 4C,D). Катализируемое AckA дефосфорилирование 13C2-ацетил-P до 13C2-ацетата,вероятно, не происходит в течение этого периода времени из-за того, что ацетат является основным компонентом буфера S30, используемого в реакциях(рисунок 1, рисунок 2B). Также наблюдалось включение 13С6-глюкозо-производных углеродов в сахарные фосфаты 6-фосфоглюконолактон (6PGL), 6-фосфоглюконат (6PG), рибулоза-5-фосфат (Ru5P) и седогептулоза-7-фосфат (S7P)(Рисунок 5). Эти результаты подтверждают участие пути пентозофосфата в метаболизме лизатной глюкозы и, вероятно, питают синтез 13С9-тирозина, что было предложеноранеепротеомным исследованием, а также обеспечивают предшественник для производства 13С5-гистидина(Рисунок 6A,B)7. Меченый фенилаланин и триптофан здесь не наблюдались, как и большинство незаменимых аминокислот. Однако это не совсем удивительно, поскольку аминокислотный анаболизм, вероятно, будет обогащен лизатами, полученными из клеток, выращенных в условиях голода питательных веществ или в стационарнойфазе7,22. Более того, полученные на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что промежуточные продукты гликолиза и ферментации направляются к кофакторным регенерирующим конечным реакциям, которые должны исключать синтез многих аминокислот, полученных из глицеральдегида-3-фосфата, пирувата и ацетил-КоА (т.е. глицина, цистеина, серина, аланина, валина, лейцина и лизина)(рисунок 1). Как уже упоминалось, 13С3-аспартат был получен в течение первого часа, тогда как аспартат, полученный из 13С-включающих аминокислот (т.е. треонин, изолейцин, метионин и аспарагин), не наблюдался, возможно, потому, что аспартат, полученный из глюкозы, участвует в ферментации(Фиг.1, Фиг.6С). Наконец, поток в сторону меченого глутамата и аминокислот, полученных из глутамата, возможно, был затруднен высокими уровнями глутамата в реакционной среде(рисунок 1). Рисунок 1:Мтутивная метаболическая модель лизатов, полученных из E. coli BL21DE3-Star, экспоненциально растущих в высоких концентрациях глюкозы. Промежуточные продукты и конечные продукты гликолиза (зеленый), пентозфосфатный путь (темно-оранжевый) и ферментативные пути (синий) из ацетил-КоА были зарегистрированы в CFME на основе лизата. Наличие сукцинатной ферментации подразумевает активацию окислительной ветви ТЦА (серой). Аминокислотный анаболизм (золото) в лизатах не является четко определенным и исследуется здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2:Данные ВЭЖХ-RID по потреблению глюкозы и ферментативному синтезу конечного продукта в реакциях CFME, приготовленных с использованием сырых экстрактов E. coli. (A)Потребление глюкозы и(B)лактата,(C)этанола,(D)ацетата,(E)формата и(F)сукцината в реакциях CFME контролировали в течение 24 ч. Представлены средние концентрации мМ и полосы погрешности (SE), количественно оцененные стандартными кривыми (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3:Тенденции временного течения 13С6-глюкозыи 13С-меченых гликолитических промежуточных продуктов в элизализаторе E. coli ХМЭ. Относительное содержание(A) 13C6-глюкозы,(B) 13C6-глюкозо-6-фосфата / фруктозы-6-фосфата, (C) 13C6-фруктозы-1,6-бисфосфата, (D) 13C3-глицеральдегида-3-фосфата / дигидроксиацетонафосфата и (E) 13C6 -пируват в реакциях CFME в течение 3 ч. Необработанные пиковые области, извлеченные программным обеспечением mzMINE, использовались для расчета средних значений и полос ошибок (SE) для положительных аннотаций (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4:Временные тенденции промежуточных продуктов и конечных продуктов при ферментации глюкозы 13С6в элисате E. coli CFME. Относительное содержание(А) 13С3-лактата,(В)13 С3-сукцината,(С)13С2-ацетил-фосфатаи (D)13С2-ацетил-КоАв реакциях ХМЭ в течение 3 ч. Необработанные пиковые области, извлеченные программным обеспечением mzMINE, использовались для расчета средних значений и полос ошибок (SE) для положительных аннотаций (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5:Временные тенденции течения 13C6-глюкозо-производных пентозфосфатных промежуточных путей в E. coli lysate CFME. Относительное содержание(А) 13С 6-6-фосфоглюконолактона,(В) 13С6-6-фосфоглюконата,(С) 13С5-рибулозы-5-фосфатаи(D) 13С7-седогептулозы-7-фосфатав течение 3 ч. Необработанные пиковые области, извлеченные программным обеспечением mzMINE, использовались для расчета средних значений и полос ошибок (SE) для положительных аннотаций (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6:Временные тенденции обнаруженного 13С6-глюкозообразующих аминокислот в элисате E. coli CFME. Относительное содержание(A) 13C9-тирозина,(B) 13C5-гистидинаи(C) 13C3-аспартатав течение 3 ч. Необработанные пиковые области, извлеченные программным обеспечением mzMINE, использовались для расчета средних значений и полос ошибок (SE) для положительных аннотаций (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1:Репрезентативная хроматограмма ВЭЖХ-RID, показывающая пики для основных ферментативных продуктов в реакции CFME, инкубированной при 37 °C в течение 24 ч. Пики глюкозы, сукцината, лактата, формата, ацетата и этанола достаточно различимы по времени их удержания на колонне ВЭЖХ при изократическом элюровании растворителем серной кислоты 5 мМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2:Репрезентативные масс-спектры для метаболитов, меченных 13C, в частности (А) лактата, глюкозы (В) и (С) 6-фосфоглюконата (6PG) в реакции CFME, инкубированной при 37 °C в течение 1 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная таблица 1:Список обнаруженных 13С-меченых метаболитов, время удержания (выровненное по образцам с использованием MZmine), теоретические полностью 13С-меченых отрицательных значений режима m/z, значения m/z обнаруженных признаков и расчетные массовые погрешности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Изложенный подход ВЭЖХ-RID может быть использован для успешной количественной оценки потребления сахарного субстрата и последующих превращений в основные органические кислоты и спиртовые продукты центрального метаболизма лисата с течением времени. Кроме того, этот протокол использует простой изократический метод, использующий одну мобильную фазу, требует минимальной подготовки образцов и позволяет проводить простой целевой анализ. Аналиты, измеренные методом ВЭЖХ-RID, различают исключительно по времени их удержания и, следовательно, их взаимодействию с выбранной колонной смолой. Колонка ВЭЖХ, используемая здесь, была специально разработана для разделения углеводов, органических кислот и спиртов путем объединения исключения размера и лигандного обмена (т. Е. Хроматография с ионно-умеренным разделением). Поэтому описанный способ полезен для более целенаправленного анализа углеводных субстратов и выбора конечных продуктов путей ферментации глюкозы, которые, как ожидается, в первую очередь облегчат и активируют биоквалирования на основе лизата8,15,21. Однако этот протокол не учитывает активацию других метаболических путей в клеточных экстрактах. Трубопроводы, использующие другие методы хроматографического разделения (например, хроматографию гидрофильного взаимодействия), методы градиентного элюирования, более сложную пробоподготовку (т.е. дериватизацию) и различные оптические детекторы (например, детекторы ультрафиолетового света или испарительного рассеяния света) могут быть использованы для обнаружения других метаболитов, таких как аминокислоты и сахарные фосфаты23,24 . В качестве альтернативы, глобальный подход к изучению метаболизма лисата может быть принят с использованием LC-MS / MS.

Описанный метод LC-MS/MS представляет собой единый рабочий процесс для измерения и идентификации более широкого спектра метаболитов. LC-MS/MS является современным аналитическим инструментом для профилирования метаболомов из-за его чувствительности и способности различать метаболиты по времени удержания и соотношениям m/z с высоким разрешением16. С акцентом на центральные метаболические пути углерода и аминокислотный анаболизм, отрицательный режим MS / MS был реализован для конкретного обнаружения полярных органических кислот, сахарных фосфатов и аминокислот. В сочетании с методом наножидкой хроматографии способ обеспечивает высокую чувствительность для обнаружения малых молекул в сложном лизатном фоне17. Однако с точки зрения профилирования метаболизма CFME на основе лизата ограничением описанного протокола LC-MS/MS является его нижний предел обнаружения 50 м/z, что исключает измерение этанола, основного продукта метаболизма глюкозы лизата, а также формата, которые в противном случае легко поддаются количественной оценке с помощью подробного метода ВЭЖХ-RID. По сравнению с LC-MS/MS, ВЭЖХ-RID имеет дополнительное преимущество относительной доступности с точки зрения стоимости и сложности. В последнем случае устранение неполадок метода LC-MS/MS, описанного здесь, может потребовать некоторой степени знаний в области масс-спектрометрии. Тем не менее, обнаружение РС имеет уникально привлекательные применения по сравнению с RID, поскольку оно может дополнительно различать меченые изотопы в метаболомах, отличный метод для понимания движения углерода из дополненных субстратов через сложную метаболическую сетьлисата 18. Такой подход был применен здесь путем дополнения реакций 13С6-глюкозойи анализа значений относительного изобилия последующих 13С-включающих метаболитов. Анализ позволил дать определение активным и неактивным путям, подкрепив ранее сообщенные предположения и предоставив новое представление о метаболическом потоке в лизатах. Изменения также могут быть сделаны в рамках метода для конкретных анализов. Например, стандартные растворы 13С-меченых целевых соединений могут быть проанализированы вместе с образцами для достижения абсолютных количественных измерений молекул, полученных из глюкозы, с течением времени и сделать выводы о распределении потоков. Лучшее обнаружение положительно заряженных соединений также может быть включено в текущем рабочем процессе путем запуска последовательностей с файлами .meth, настроенными на обнаружение положительного режима.

Аналитическая выборка в обоих описанных методах удобно автоматизирована, обеспечивая высокую воспроизводимость. Кроме того, можно ожидать плавных аналитических запусков при тех пор, пока соблюдаются надлежащие методы обращения с приборами и технического обслуживания. При использовании этих инструментов для анализа реакций CFME следует учитывать более важные соображения до и после отбора проб. Во время подготовки проб важно, чтобы контроль времени курса был репрезентативным для нулевого времени. Здесь белки были осаждены в лизатах путем подкисления, чтобы остановить метаболические реакции. Для образцов с нулевым временем кислотный растворитель соединяли с лисатом перед добавлением реакционной смеси, содержащей глюкозу. Подкисление трихлоруксусной кислотой эффективно обеспечивало, чтобы глюкоза не метаболизировалась в нулевое время, как показано в данных ВЭЖХ-RID(рисунок 2). В то время как процедура, аналогичная утвенчаемого метаболизма глюкозы, была выполнена в отчетном анализе LC-MS / MS, 13С-меченых метаболитов были обнаружены в образцах с нулевым временем, хотя и при значительно низких значениях изобилия по сравнению с образцами, извлеченными в более поздние моменты времени. Причем эти наблюдения ограничивались промежуточными продуктами гликолиза. Данные свидетельствуют о том, что реакции сохраняют некоторую степень гликолитической активности после подкисления экстракционным растворителем, который обнаруживается этим высокочувствительным методом. Вместе с тем масштабы этой деятельности следует количественно оценить. В предыдущем исследовании сообщалось, что кислотные экстракционные растворители могут недостаточно гасять промежуточные гликолитические реакции, но могут остановить значительное потребление глюкозы10. Хотя это еще предстоит дополнительно исследовать в системе, используемой здесь, резкие изменения значений относительного изобилия между образцами с нулевым временем и более поздними временными точками могут быть интерпретированы как тенденции метаболизма глюкозы. Однако изучение альтернативных методов закалки рекомендуется в аналогичных приложениях, в частности для получения абсолютных количеств метаболических промежуточных продуктов10. Кроме того, следует также соблюдать надлежащую практику в ходе анализа программного обеспечения на последующих этапах. Согласованность является обязательным условием при ручной интеграции пиковых областей из сигналов RID для уменьшения количества человеческих ошибок. Ручная интеграция должна также применяться к пиковым областям стандартов всякий раз, когда для количественной оценки концентраций метаболитов в образцах используются интегрированные вручную пиковые районы. На протяжении всего целевого анализа LC-MS/MS предварительные аннотации из анализа MZmine должны быть проверены ручной пиковой проверкой с использованием браузера качества MS, а функции m/z должны быть аннотированы только тогда, когда допускаются ошибки расчетной массы. Здесь эти анализы были выполнены вручную для ограниченного набора целей, поскольку всеобъемлющее и надежное программное обеспечение для поиска изотопов еще не создано. Однако такие автоматизированные методы поиска метаболитов, меченных 13С, в настоящее время появляются и будут оптимизировать более сложные анализы, такие как профилирование лизатов за пределами центрального углеродного метаболизма25.

Усовершенствованная жидкостная хроматография является надежным и широко применяемым методом разделения малых молекул в сложных метаболических смесях11. Описанные методы соединяют этот метод разделения с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для успешного анализа превращений метаболитов в реакциях CFME на основе лизата. ВЭЖХ-РИД и LC-MS/MS являются индивидуально мощными инструментами для профилирования активного метаболизма лизата, и их взаимодополняемость может быть дополнительно использована для устранения ограничений, присущих каждому методу. Представленные методы позволяют применять и разработать CFME, поскольку они могут быть использованы для понимания метаболизма лизата, мониторинга улучшений в целевых превращениях метаболитов и выяснения изменений метаболитов в потоке метаболитов при манипулировании метаболизмом лизата.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было спонсировано Программой геномных наук Министерства энергетики США, Управлением научных, биологических и экологических исследований в рамках научной области взаимодействия микробов растений (http://pmi.ornl.gov). Национальная лаборатория Оук-Ридж управляется компанией UT-Battelle, LLC для Министерства энергетики США по контракту DE-AC05-00OR22725. Эта рукопись была написана UT-Battelle, LLC по контракту DE-AC05-00OR22725 с Министерством энергетики США. Правительство Соединенных Штатов сохраняет за собой, а издатель, принимая статью к публикации, признает, что правительство Соединенных Штатов сохраняет за собой неисключительную, оплаченную, безотзывную всемирную лицензию на публикацию или воспроизведение опубликованной формы этой рукописи или разрешение другим лицам делать это для целей правительства Соединенных Штатов. Министерство энергетики обеспечит публичный доступ к этим результатам исследований, спонсируемых федеральным правительством, в соответствии с Планом общественного доступа Министерства энергетики США (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

Materials

0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) Corning Costar 8160
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 87003-294
1260 Infinity Binary LC Pump Agilent G1312B HPLC-RID system
1260 Infinity High Performance Degasser Agilent G4225A HPLC-RID system
1260 Infinity Refractive Index Detector Agilent G7162A HPLC-RID system
1260 Infinity Standard Autosampler Agilent G1329B HPLC-RID system
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374 CFME reaction mix component (LC-MS/MS)
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter VWR 10040-436
Acetonitrile (LC/MS grade) Fisher Scientific A955 Solvent preparation for LC-MS/MS
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A7699 CFME reaction mix component
Aminex HPX 87-H column Bio-rad 1250140 Chromatography column for HPLC-RID
Ammonium acetate (LC/MS grade) Fisher Scientific A11450 Solvent preparation for LC-MS/MS
Ammonium glutamate Sigma-Aldrich G1376 CFME reaction mix component
Autosampler vial caps (yellow, snap) Thermo Scientific C4011-50Y Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) Wheaton W225181 Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Benchtop microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Bis-Tris Sigma-Aldrich B9754 CFME reaction mix component
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282 CFME reaction mix component
D-dextrose (Glucose) VWR BDH9230 CFME reaction mix component
Dipotassium phosphate Sigma-Aldrich P8281 CFME reaction mix component
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Formic acid (LC/MS grade) Thermo Scientific 85178 Solvent preparation for LC-MS/MS
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) Polymicro Technologies WM22005-ND Chromatography column for LC-MS/MS
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A6283 S30 buffer ingredient
Isopropanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A461 Solvent preparation for LC-MS/MS
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) Phenomenex N/A; special order Chromatography column for LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific N/A; special order Mass spectrometer for LC-MS/MS
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M5661 S30 buffer ingredient
Magnesium glutamate Sigma-Aldrich 49605 CFME reaction mix component
Methanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A456 Solvent preparation for LC-MS/MS
NAD+ Sigma-Aldrich N0632 CFME reaction mix component
Nanospray Ionization Source ThermoFisher Scientific/Proxeon ES071 (newest model) Mass spectrometer for LC-MS/MS
OpenLab CDS (Online) Software Agilent Version 2.15.26 Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software Thermo Version 2.7 Software for tuning the LC-MS/MS system
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190 S30 buffer ingredient
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1501 CFME reaction mix component
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5415 C
Screw caps (with septa, 9 mm) Supelco 29315-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Screwthread glass vials (2 mL) Supelco 29376-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Sodium acetate Sigma-Aldrich 241245 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium formate Sigma-Aldrich 247596 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium lactate Sigma-Aldrich 71716 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Succinic acid Sigma-Aldrich 398055 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105 Solvent preparation for HPLC-RID
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T6399
Tris-acetate GoldBio T-090-100 S30 buffer ingredient
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Solvent Rack: SRD-3600 Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Water (LC/MS grade) Fisher Scientific W6500 Solvent preparation for LC-MS/MS
Xcalibur Software Thermo Version 3.0.63 Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
  2. Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
  3. Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
  4. Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).
  5. Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
  6. Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
  7. Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
  8. Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).
  9. Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
  10. Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).
  11. Coskun, O. . Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).
  12. Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
  13. Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
  14. Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
  15. Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
  16. Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
  17. Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D’Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
  18. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  19. O’Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
  20. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  21. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  22. Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).
  23. Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
  24. Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
  25. Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).

Tags

Liquid ChromatographyRefractive Index DetectionMass SpectrometryMetabolite ProfilingCell-free SystemsCarbon MetabolismCentral MetabolitesLysate-basedHPLCSample PreparationAcidificationFiltration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems. J. Vis. Exp. (175), e62852, doi:10.3791/62852 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image