リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

1. HPLC-RID定量化のためのCFME反応の開始、停止、および処理時間の経過。 以前に調製した 大腸菌 のライセートを解凍し、残りの反応成分を氷上で調製する。注:ここで報告されたライセートは、2xYPTG(1.8%グルコース)培地で成長した 大腸菌 BL21DE3-Starから中ログ相に由来した。 適切な量のフィルター滅菌(0.20 μmの細孔フィルター)S30バッファー(1 Mトリス-OAcは、氷酢酸、1.4 M Mg(OAc)2、および6 MKOAcでpH 8.2に調整)を準備します。 グルコース、グルタミン酸塩、ATP、補酵素A、NAD+、ビストリスバッファー、およびリン酸ジカリウムを含むエネルギーミックスをS30バッファーに調製します。ここでCFME反応を調製するために使用された所望の反応量の最終濃度は、100 mMグルコース、18 mMマグネシウムグルタミン酸、15mMグルタミン酸、195 mMカリウムグルタミン酸、1mM ATP、0.2 mM補酵素A、1 mMNAD+、150 mMビストリス、および10mのリン酸ジミン酸である。 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに成分を組み合わせて、4.5 mg/mLの全ライセートタンパク質で最終的な反応を調製します。ここで、CFME反応は、時間単位の3重化で50μLの最終体積で調製した。それぞれの時間枠の37 °Cで反応をインキュベートします。注:速く働き、グルコースおよびグルタミン酸塩との早期代謝反応を防ぐために反応ミックスの最終成分としてリゼートを加えます。最小限のグルコース消費量は、反応ミックスが氷上でインキュベートされる時間に応じて発生する可能性があります。 反応を終了し、HPLC-RID分析のためにサンプルを処理します。 適切な時点で三重反応を終了するには、各サンプルの最終反応量に5%のトリクロロ酢酸の等量を直ちに加えます(5%トリクロロ酢酸50μLの50μLを50μL反応に)。各サンプルを無菌水で2倍の反応量(すなわち、100 μL)で希釈します。 時間ゼロを再現するには、残りの反応成分を添加する前に、5%トリクロロ酢酸と全最終反応量(すなわち50μL)と同じ量のリクロロ酢酸をリセートと混合します。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。 11,600 x g のベンチトップマイクロ遠心分離機上のサンプルと遠心分離機を5分間ボルテックスし、有機検体を含む上清をチューブを洗浄します。HPLC分析を別の日に行う場合は、-20 °Cでサンプルを保存してください。次のステップに進む前に、氷の上に保存されたサンプルを解凍することを確認してください。 0.22 μmの細孔フィルターで各上清をフィルターします。シリンジの代わりに、遠心チューブフィルターを使用し、16,300 x g で上澄み物を1分間遠心分離します。 各濾液をクリーンなHPLCガラスバイアルに移します。バイアルを HPLC オートサンプラー トレイに積み込みます。 標準曲線生成用サンプルを準備します。 CFME反応においてグルコースの開始濃度を上回る等量でS30バッファーに溶解した全ての標的検体のストック溶液を調製する。ここで、150μMグルコースからなるストック溶液を、コハク酸塩、乳酸塩、formate、酢酸塩、およびエタノールからなる、調製した。ストック溶液から1:1(v/v)シリアル希釈を行い、0 μMからストック濃度までの最終濃度(すなわち150 μM)までの3重50 μL溶液を得ます。 5%トリクロロ酢酸50μL、滅菌水100μLで各溶液を希釈します。ステップ 1.3.4 から 1.3.5 を繰り返します。注: サンプルの各バッチで標準曲線生成のためのソリューションを実行して、代謝物の濃度を正確に定量化します。 2. 代謝物検出のためのHPLCシステムの準備 ヒュームフードの下で、脱イオンおよびフィルター滅菌水から殺菌された5 mM硫酸溶液を調製します。約550μLのHPLCグレードの硫酸溶液を2Lの水に加え、5mM硫酸を調製します。注意:硫酸は有害な化学物質であり、適切なラボPPEでヒュームフードの下で働くことは吸入、皮膚接触、および眼の接触を防ぐ。濃縮硫酸は水と激しく反応し、逆ではなく水に直接添加する必要があります。直射日光を避けて涼しく乾燥した場所に保管し、実験室で設定された適切な廃棄物処理対策に従ってください。 HPLC装置の隣の水浴で5mM硫酸の2 Lボトルをインキュベートしてください。水浴を35°Cに設定します。 溶剤ボトルに溶剤フィルターを入れ、ポンプモジュールに沿ってもう一方の端を脱ガッサーモジュールに取り付けます。メモ:コラムを取り付ける前に、準備したての溶剤でシステムをパージするのは、楽器の取り扱いの練習です。 Rid モジュールに沿って HPLC カラムを HPLC 装置に装備します。カラムサーモスタットが利用できない場合は、35°Cの水浴にカラムを置きます。 システムコンピュータにインストールされているクロマトグラフィーデータシステム(CDS)ソフトウェアで35 °Cで分析するためにRIDモジュールを準備します。 [表示] メニューの [メソッド] をクリックし、[コントロール ビュー] を実行します。ポンプモジュール>メソッドを右クリックします。流量を0.55 mL·min-1に設定し、ポンプを開始するには[オン]ボタンを選択します。注:HPLCに取り付ける前にカラムがストレージに入っていた場合は、メーカーの指示に従ってカラムを平衡化した後、流量を0.55 mL·min-1に上げます。 RID モジュールに対応するパネルを右クリックし 、>メソッド。RI検出器モジュールの温度を35°Cに設定し 、[オン]を 選択してRI検出器モジュールのウォーミングアップを開始します。 パネルの RID モジュール > コントロールを右クリックします。新鮮な溶媒を使用する場合は少なくとも15分間、またはこのセットアップの前にRI検出器を通して異なる溶媒が流れた場合は1時間パージ参照セルに対してオンを選択します。[オン] ボタンをクリックします。注: ポンプと RI 検出器 をオンに して、オンライン プロットで安定したベースラインを達成します。これは、実験室の温度変動の影響を受け、4時間以上かかることがあります。サンプルの読み込み前にシステムを 一晩オン にします。 3. CDSで有機発酵製品のアイソクラティックHPLC分離法を作成する。 メニュー バーで 、[新しいメソッド>]を選択します。方法> [メソッド名].Mとして保存方法を > >選択します。 [バイナリ ポンプ]タブで、流れを 0.55 mL·min-1に設定します。[ソルベント]で、ポンプモジュールの溶媒入力に対応する文字を選択し、アイソクラティック溶出の場合は100%に設定します。圧力制限を 0 と 400 バーに設定し、入力 30 分をストップタイムとして設定します。 [サンプラー ]タブで、[注入量]を50 μLに設定します。[描画速度]、[取り出し速度]、[ドローポジションの高度な補助設定]を 200 μL·min-1、200 μL·min-1、および -0.5 mm に設定します。 [RID]タブで、光学ユニット温度を35 °Cに設定します。 [シグナル] で、[シグナル] の[取得]を選択し、[ピーク幅] で >0.2 分を選択します。[停止時間] の [ポンプ/インジェクタとして] オプションを選択します。 [RID]タブの [詳細設定] で、[アナログ出力] を [減衰の場合は 5% ゼロ オフセット] と 500,000 nRIUに設定します。[シグナル極性] の[正] オプションを選択し、[分析前に自動ゼロ] の [オン] オプションを選択します。 [メソッドを保存>方法] を選択して 、メソッドを保存します。[メソッド名] > [メソッド>読み込み方法] を選択して、メソッドを読み込みます。M. 4. 自動サンプリング用のシーケンステーブルを作成し、データ取得用のHPLC-RIDシステムを起動します。 メニュー バーで、[シーケンス] をクリックして [新しいシーケンス テンプレート>します。 [シーケンステンプレート名]としてシーケンス>保存シーケンステンプレートを選択します。S. シーケンス>シーケンステーブルを選択します。オートサンプラートレイ上の配置に従って、’n’バイアルに対応する’n’行を追加し、バイアルとサンプル名の下にバイアルの位置とサンプル名を入力します。ステップ 3 で生成されたメソッドを[メソッド名]ドロップダウンメニューから選択し、行ごとに Inj/Vial(Vial あたりのインジェクション)として 50 μL を入力します。 [ 適用 ] をクリックし、[シーケンス テンプレート] を選択 してシーケンス テンプレート>保存します。[ シーケンス>読み込みシーケンス テンプレート] > [SequenceTemplateName] を選択して、シーケンス テンプレートが読み込まれるようにします。S. オンラインプロットで安定したベースラインを達成した後、パネル の「RIDモジュール」>「制御」を右クリックして「オフ・リサイクル・バルブ」を>、RID 検出器を通して溶媒の流れを無駄にします。データ取得を開始するには、メニュー バーの [シーケンス ] メニューの [実行] > [シーケンス] を選択します。 5. データの抽出と分析後の実行。 [表示] メニューから[データ分析ビュー] を選択します。画面左側のファイルリストからシーケンスファイル名を見つけます。画面の中央パネルで、信号ビュー選択> RID シグナルに移動してサンプルクロマトグラムを表示します。 画面上の上部パネルから高濃度標準サンプルに対応する行を選択します。表示されたクロマトグラム上のターゲット検体ピークの保持時間をメモします。標的検地に対応するピークは、グルコース、コハク酸塩、乳酸塩、定型、酢酸塩、およびエタノールとして保持時間軸に沿って配置される(補足図1)。注:クロマトグラムの最初の大きなピークはトリクロロ酢酸に相当します。RI 単位は、すべての標準曲線サンプルで一貫している必要があります。各化合物を別々のサンプルとして実行して、各ターゲットの対象の検体の保持時間を検証します。 各標的検体のピーク領域を、標準のクロマトグラムと反応サンプルから抽出します。 対象となるピークがソフトウェアによって十分に統合されているかどうかを確認します。各ピークの底部として赤線を描き、曲線の下に正確に統合された領域を得る。自動統合が失敗した場合(つまり、赤い線が斜めである)、統合ツールセットから手動統合ボタンを選択し、ピークベースを手動で描画してピークエリアを統合します。注: 1 つのサンプルでターゲット分析対象に対して手動統合を実行する必要がある場合は、一貫性を保ち、すべてのサンプルに同じ分析対象を手動で統合してください。 共通ツールセットからカーソルツールを選択して、適切に統合されたピークをクリックします。選択したピークのピーク領域と対応する保持時間が、画面の下部パネルの表の行として強調表示されます。 ピークエリアをエクスポートするには、[ ファイル>エクスポート>統合結果] を選択します。 標準曲線を使用してターゲットの検体濃度を定量化します。 スプレッドシート内のサンプルの既知の濃度との間にピーク面積の値をプロットします。プロットされたデータを右クリックし、[ 近似曲線を追加>近似曲線の書式設定>数式をチャートに表示します。 別のスプレッドシートで、標準曲線トレンドラインの方程式を使用して、各サンプルから各分析対象のピーク領域値を濃度に変換します。データビジュアライゼーションの三数にまたがる平均ピークエリアと標準誤差値を計算します。 LC-MS/MS 定量化のための CFME 反応をトレースする、開始、停止、および処理時間コースの同位体。 1.1-1.2 で説明されているように氷上のポイント(時間ゼロを除く)ごとに三重反応を設定します。しかし、グルコースの代わりに、反応に100mM13C6-グルコースの最終濃度を使用する。 37°Cで1時間、2時間、3時間の反応をインキュベートする。 終了するには、液体窒素中の反応をフラッシュ凍結し、-80°Cで保存します。 当日の分析では、このストレージステップをスキップします。注:LC-MS/MSを介して一部の中枢炭素代謝物を検出する際に、トリクロロ酢酸は酸からの干渉による反応を止めるために使用されませんでした。代わりに、ギ酸を含む抽出溶媒(ステップ6.3)は、報告されたMS/MS法の検出限界を下回るギ酸の質量であるため、代謝タンパク質を沈殿させるために使用された。 抽出溶媒の50mLを調製する。組み合わせてアセトニトリルの20 mL、メタノールの20 mL、および10 mLの水(全LC-MSグレード)を50 mL遠心管に入れ、0.199mLのギ酸と共に0.1M溶液を作ります。抽出時に溶剤を4°Cに冷やし、使用しない場合は-20°Cで保存します。 LC-MS/MS 分析のサンプルの処理 分析の日に、抽出溶媒の等価な容積(すなわち、50 μL)を各サンプルにピペットします。サンプルを凍結した場合は、サンプルが完全に解凍する前に抽出溶媒を添加して、グルコース代謝の再活性化を防ぎます。氷上ですべてのサンプル処理手順を実行します。 時間ゼロを再現するには、抽出溶媒の最終体積(すなわち、50 μL)を、反応中の所望の最終濃度(すなわち、50 μLの反応量で4.5mg/mLの)に適した溶解液の量にピペットします。残りの反応成分をステップ1.2のように加えます。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。 穏やかな揺れで30分間氷上の抽出溶媒にサンプルをインキュベートし、4°Cで15分間21,000 x g でサンプルを遠心分離し、沈殿したタンパク質から上澄み液を分離します。上清の50 μLをオートサンプラーバイアルに移し、4°Cオートサンプラー内のトレイにバイアルを積み込みます。上清の残りの部分は-20°Cで保存し、今後の分析を行います。 7. LC-MS/MS 分析用の LC システムの設定 950mLの水とイソプロパノール50 mLに酢酸アンモニウム 77.08 mgを完全に溶解して、溶媒Aの1 Lを調製します。アセトニトリル650mL、300mLの水、イソプロパノール50mL、酢酸アンモニウム77.08mgを用いて、1Lの溶媒Bを調製します。すべての溶媒が LC-MS グレードであることを確認します。 ソルベントAとBを含む溶剤ボトルをポンプモジュールに接続します。高い流量でシステムをパージし、溶剤の機器中に発生した空気汚染をLCシステムに除去/制限します。 C18逆相型カラム(カラム長30cm、内径75μm、粒子径5μm)をシステムに装備します。100%の溶媒Bを流し、ゆっくりと溶媒Aを100%まで流れ上げて、LC-MSシステムにカラムを条件にします。注:カラムの先端はマイクロピペットの引き手を使用して社内で準備され、圧力細胞およびヘリウムを詰めた。 8. フーリエ変換とイオントラップ質量分析計にリンクされたLCシステムのLC-MS/MSデータ取得および解釈ソフトウェアの方法を作成します。 チューンプラスソフトウェアを開いて、MSメソッドのチューンファイルを編集します。 メニューバーの ファイル から、プレインストールされたネガティブモードチューンファイルを開きます。 メニュー バー の [スキャン モード ] を選択し、[ スキャン ウィンドウの定義] を選択します。MSn のマイクロスキャン時間設定を、イオン トラップと FT の両方で 1 に設定します。 Nano-ESI ソースの設定に移動し、 スプレー電圧 を 4 kV に設定します。許容できるエレクトロスプレーが生成されるまで、これを調節します。通常、許容できるエレクトロスプレーは、2〜5kVの範囲内で達成することができる。 チューン ファイルを保存します。 計測器のデータ収集および解釈ソフトウェアの セットアップウィザード を使用して、新しいLCメソッドを生成します。 ロードマップ>シーケンスセットアップ ウィザード>開きます。これらのメソッドは列ヒーターの使用を必要としないため、一時制御の手順は省略してください。 [フロー勾配ポンプオプション]で、[マルチステップ] を選択します。次のウィンドウで、7 行を挿入し、各行の流量を 0.1 mL·min-1に設定します。各行に次のパラメータを入力します:0-3分から、100%の溶媒Aを送ります。3〜9分から、100%溶媒Aから20%の溶媒Bへの勾配を導入する。9〜19分から、20%の溶媒Bから100%の溶媒Bへの新しい勾配を導入する。19-27分から、100%溶媒Bで保持します。27-28分から、勾配を100%溶媒Aに戻します。28-44分から、100%の溶媒Aで保持して後続の走行のためにカラムのすすいで再調整を行い、LCが使用されていないときに溶媒を節約するために、ランの完了時に流量を0.03 mL·min-1に下げる最終ステップを含めます。 集録オプションとしてポンプ圧力>サンプラーオプションのデフォルト設定を適用し、デフォルトの取得時間を使用し、デフォルトのポンプ圧力オプションを使用します。 「インストゥルメントのセットアップ」ウィンドウのサイドバーからオービトラップ・ベロス・プロMSアイコンを選択して、MS/MS方式を作成します。 [ データ依存 MS/MS >新しい方法] をクリックします。 取得時間 を LC 実行の長さ (つまり 44 分)、 セグメント を 1 に、 スキャン イベント を 11 に設定します。[ファイルを調整]で、ステップ 8.1 から編集したファイルを選択します。注: 最初のイベントは、フーリエ変換 MS(FTMS)を使用した MS1 前駆体スキャンです。後続の 10 個のイベントは、MS2 フラグメンテーションの各前駆体スキャンで最も強烈で一意の 10 個のイオンを選択する MS2 スキャンです。 イベント 1 の場合、[ スキャンの説明 ] で [アナライザー を FTMS に設定し、 極性 を 負に設定します。[MSn 設定]では、 解像度 30,000、 正規化衝突エネルギー 35 V の設定 スキャン範囲 を最初の質量で 50 m/z、最後の質量で 1800 m/z に設定して小分子をキャプチャします。 イベント 2 から 11 の場合は、[ スキャンの説明 ] の下の [アナライザー を イオン トラップに設定します。 [依存スキャン ] を選択し、[ グローバル>動的除外>設定 ] をクリックして、[ 有効]を選択します。30 s の繰り返し継続時間と 120 s の除外期間を設定して、近接での反復スキャンを排除します。 [スキャン イベント] 設定に移動し、すべての MS2 イベント (2 ~ 11) に対して[スキャン イベントから一括判定] を 1 に設定します。最も強いイオンのトップ10をスキャンするには、各MS2スキャンイベントを設定して、1stから10番目までのn番目の最も強いイオンを検出します。したがって、イベント 2を n番目の最も強いイオンとして検出する、イベント 3 が 2 を検出する、などで設定します。 セットアップ ウィンドウを閉じ、[ ファイル] > [名前を付けて保存 ] [Method_Name] に移動します。メモ:LC機器および質量分析計の一般的な使用、メンテナンス、校正については、製造元が提供する取扱説明書とマニュアルを参照してください。 9. 実行シーケンスを設定し、LC-MS/MS 実行を開始します。 LC-MS/MSシステムのデータ取得および解釈ソフトウェアを使用して実行シーケンスを設定します。Roadmap > シーケンス設定内で、テーブルを右クリックして、サンプルと同じ数の行を挿入します。各行に対して 、Inj Vol を5 μLに設定し 、位置 をオートサンプラートレイ上のバイアルのそれぞれの位置に設定します。サンプル名としてファイル名を入力し、実行結果に必要なファイル パスを設定します。注: ソルベント A を含むブランクバイアルは、シーケンスの先頭と、各三重サンプルセット(各時間ポイント)の間で列をすすぐように実行できます。 実行を開始するには、シーケンス内のすべてのファイル名をハイライト表示します。メニュー バーから [ アクション] を選択>[シーケンスの実行] > [OK] を選択します。 10. MZmine 2.53 でファイルを統合し、仮の注釈を検索します。 MZmine を開き、ステップ 9.1 から ‘.raw’ 出力ファイルをインポートします。メニュー バーから [ 生データ のインポート] を選択>データを読み込む。サンプルに対応するファイルを選択します。 MS1 と MS2 のスキャンを区別するピークのリストを作成します。メニュー バーから、MS/MS ピークリスト ビルダー>機能検出>生データ メソッド 。関連する設定には、m/z ウィンドウが 0.01 に設定され、タイム ウィンドウが実行の長さに設定されるなどがあります。[設定されたフィルタ] で、[極性として負]を選択し、[スペクトル タイプ] として[中心心]を選択します。 メニュー バーから機能 の一覧の方法>機能検出>ピーク エクステンダに移動します。 m/z 許容値 を 0.005 m/z または 10 ppm に設定し、 最小高さを 1E3 に設定します。このステップは完全に肉付きのピークを作成します。 重複したピークを削除します。 [重複ピーク フィルタのフィルタリング>機能リスト方法>戻る。関連する設定には、0.005 m/z または 10 ppm に設定された m/z 許容値 と 、RT 許容値 が 5 分に設定されています。 類似したデータ ファイル (つまり、三重反応のファイル) 内のピークを整列させるには、機能リストの方法>正規化>保持時間の調整に戻ります。サンプルを一緒に三重化し、空白を除外するようにしてください。関連する設定には、0.005 m/z または 10 ppm に設定されたm/z 許容値、RT 許容値を 3 分絶対値(分)に設定、最小標準強度を 1E3 に設定します。 機能リストメソッドの位置合わせ> RANSAC Alignerから m/z と保持時間によって、すべてのファイルからピークを整列>します。 m/z 許容値 を 0.005 m/z または 10 ppm、補正後の RT 許容値 と RT 許容値 をそれぞれ 44 分と 39 分に設定し 、RANSAC 反復を 0、 最小ポイント数 を 10%、 しきい値を 1 に設定します。[ 同じ充電状態が必要]オプションにチェックマークを付けます。 ピークファインダーの「機能一覧方法」の前の手順で失われた可能性のあるデータポイント>ギャップ埋め>修正します。関連する設定には、[強度許容値]が 50%、m/z許容値が 0.005 m/z または 10 ppm に設定され、RT 許容値が 3 分に設定されます。RT 補正を有効にします。 11. 13C標識グルコース由来代謝産物の負のモード質量を計算し、フィルタリングされたデータでこれらの分析物のm/z特徴を検索する。 標的検索のためのグルコース代謝から 13C標識代謝産物の質量を計算する。 各分子式の原子数と各元素20のモノアイソトピック質量から各標的化合物のモノアイソトピック質量を算出する。 化合物の負のモード質量 [M-H]- モノアイソトピック質量から 1 プロトン(1.007276 Da)の質量を減算して計算します。イオン化中に分子が水素イオンを取り除いた後の負モードMS検出で検出される質量です。 負のモード質量から 、13C組み込み代謝産物の質量を計算する。ここでは、グルコース由来の 13Cラベルを最大に組み込んだアイソトポーグの質量を計算した。 MZmine 結果から m/z フィーチャーを検索してアサインするには、計算された 13個の C ラベル化された代謝物の質量を使用します。各ヒットに対して、次の式を使用して質量誤差(ppm)を計算します。注: <15 ppm の質量誤差を持つ実験的な m/z 値は、現在の解析では推定アノテーションと見なされました。 品質ブラウザで推定注釈のスペクトルを手動で確認し、注釈を確認します。 クアルブラウザ>ロードマップを開く。ツール バーからRAW ファイルを開き、各サンプルの生の MS データをインポートします。 全イオンクロマトグラム(上パネル)に所望の保持時間の範囲(すなわち、推定アノテーションに対応する)の下に線を引き、マススペクトル(下部パネル)を表示する。スペクトルを右クリックし、ターゲットの m/z を囲む質量の範囲を入力します。推定アノテーションに、ノイズの上に顕著に高いピーク信号があるかどうかを確認してください(補足図2)。 各時点の生物学的複製全体の平均ピーク領域と正の注釈の標準誤差を計算します。データを可視化(すなわち、棒グラフ上)、グルコース代謝の傾向を観察する。