JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Published: September 23, 2021
doi:
10.3791/62852
, , ,
1Graduate School of Genome Science & Technology,University of Tennessee Knoxville, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research,University of Tennessee Knoxville, 3Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Abstract

Engineering cellulair metabolisme voor gerichte biosynthese kan uitgebreide design-build-test-learn (DBTL) -cycli vereisen, omdat de ingenieur werkt rond de overlevingsvereisten van de cel. Als alternatief kan het uitvoeren van DBTL-cycli in celvrije omgevingen dit proces versnellen en zorgen over hostcompatibiliteit wegnemen. Een veelbelovende benadering van celvrije metabole engineering (CFME) maakt gebruik van metabolisch actieve ruwe celextracten als platforms voor biomanufacturing en voor het snel ontdekken en prototypen van gemodificeerde eiwitten en routes. Het realiseren van deze mogelijkheden en het optimaliseren van CFME-prestaties vereist methoden om het metaboloom van op lysaat gebaseerde celvrije platforms te karakteriseren. Dat wil zeggen, analytische instrumenten zijn nodig voor het monitoren van verbeteringen in gerichte metabolietconversies en in het ophelderen van veranderingen in de metabolietflux bij het manipuleren van het lysaatmetabolisme. Hier werden metabolietanalyses met behulp van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) in combinatie met optische of massaspectrometrische detectie toegepast om de metabolietproductie en flux in E. coli S30-lysaten te karakteriseren. In het bijzonder beschrijft dit rapport de voorbereiding van monsters van CFME-lysaten voor HPLC-analyses met behulp van brekingsindexdetectie (RID) om de generatie van centrale metabole tussenproducten en bijproducten te kwantificeren bij de omzetting van goedkope substraten (d.w.z. glucose) in verschillende hoogwaardige producten. De analyse van metabolietconversie in CFME-reacties gevoed met 13C-gelabelde glucose door middel van omgekeerde fase vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie (MS / MS), een krachtig hulpmiddel voor het karakteriseren van specifieke metabolietopbrengsten en lysaat metabole flux uit uitgangsmaterialen, wordt ook gepresenteerd. Al met al maakt het toepassen van deze analytische methoden op cfme-lysaatmetabolisme de vooruitgang van deze systemen mogelijk als alternatieve platforms voor het uitvoeren van snellere of nieuwe metabole engineeringtaken.

Introduction

Beperkingen in het ontwikkelen van microben voor chemische productie kunnen worden aangepakt door biochemische reacties in vitro samen te vatten waarbij concurrerende cellulaire overlevingsfuncties afwezig zijn1. Bovendien is de open reactieomgeving (d.w.z. afwezigheid van een celmembraan) vatbaarder voor manipulatie en is deze gemakkelijker te controleren in vergelijking met levende cellen. Dit fundamentele concept van celvrije metabole engineering (CFME) is elegant aangetoond door de reconstructie van metabole routes om waardevolle chemicaliën zoals waterstof en monoterpenen te synthetiseren met productiestatistieken die ordes van grootte hoger zijn dan gepresenteerd in microbiële celfabrieken tot nu toe1,2,3 . Methoden voor het zuiveren van hele paden worden momenteel echter beperkt door tijd en kosten. Als alternatief kunnen celvrije metabole systemen worden afgeleid van ruwe celextracten door middel van snelle en goedkope methoden ten opzichte van de reconstructie van de hele route4. Het centrale metabolisme dat wordt vastgehouden in celextracten kan worden aangevuld met energiesubstraten (bijv. Glucose en enzymatische cofactoren) en zouten in gebufferde oplossingen om centrale metabole precursoren te genereren gedurende meer dan 24 uur5,6. Het toevoegen van exogene enzymen aan de op lysaat gebaseerde CFME-reactie maakt complexere biotransformaties van glucose in waardevollere chemicaliën bij hoge titers4,6,7mogelijk. Hoewel de opbrengst in deze systemen meestal wordt aangetast vanwege hun celachtige metabole complexiteit, zijn en worden unieke methoden ontwikkeld om lysaatproteomen te cureren voor conversie met een hogere opbrengst7,8.

Het gemak van het uitvoeren van metabole transformaties in op lysaat gebaseerde celvrije systemen maakt deze uitstekende platforms voor het verplaatsen van chemische productie buiten de cel of voor het prototypen van nieuwe routes met een hoge doorvoer voordat deze ontwerpen in vivoworden gebouwd en getest2,9. Voor beide toepassingen zijn hulpmiddelen voor het monitoren van metabole conversies of het observeren van algemene veranderingen in metabole flux in lysaten een integraal onderdeel van de vooruitgang van CFME. High-performance vloeistofchromatografie (HPLC) kan worden gebruikt om de chemische bestanddelen van CFME-reacties met hoge resolutie te scheiden en kan worden gekoppeld aan optische of massaspectrometrische detectoren voor metabolietkwantificering5,10. Het onderliggende principe van HPLC is dat analyten opgelost in een oplosmiddel (d.w.z. mobiele fase) en door een kolom worden gepompt, interageren met het specifieke kolomverpakkingsmateriaal (d.w.z. stationaire fase)11. Afhankelijk van hun chemische eigenschappen vertonen deze analyten verschillende retentietijden voordat ze uiteindelijk uit de stationaire fase worden geëloteerd en door de mobiele fase naar een detector worden gedragen. Dit rapport beschrijft de voorbereiding en analyse van op E. coli lysaat gebaseerde CFME-reacties door middel van HPLC-gebaseerde methoden die gebruikmaken van RID- en MS/MS-detectie.

HPLC gekoppeld aan brekingsindexdetectie (HPLC-RID) is een algemeen toegankelijke methode voor het snel identificeren van centrale metabole precursoren en eindproducten. In het kort meet RID hoe analyten de afbuiging van licht veranderen door de mobiele fase12. RID-signalen die overeenkomen met doelanalyten in monsters kunnen vervolgens worden gekwantificeerd door vergelijkingen met RID-signalen van standaardoplossingen. In CFME-toepassingen is deze detectiemodus het meest gebruikt met HPLC-kolommen die verbindingen scheiden op basis van een combinatie van grootte-uitsluiting en liganduitwisselingsmechanismen, of ion-gemodereerde partitiechromatografie5,6,8,13. Deze specifieke techniek wordt gebruikt om snel de consumptie van suikersubstraten zoals glucose te kwantificeren, evenals de vorming van fermentatieproducten zoals succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol in op lysaat gebaseerde CFME-reacties8. Het registreren van de concentratieveranderingen van deze verbindingen via HPLC is nuttig geweest voor zowel het ophelderen van het potentieel van ruwe celextracten om centrale metabole precursoren te bundelen als voor het begrijpen hoe pathway flux wordt omgeleid via fermentatieve routes tijdens complexe metabole conversies van glucose in lysaten6,8,14. Baanbrekende CFME-studies in E. coli-celextracten bevestigen dat fermentatieverbindingen zich ophopen als eindproducten van glucosekatabolisme en ook voorkomen als ongewenste bijproducten in lysaten die exogene enzymen overexpressie6,15. Er wordt gesuggereerd dat fermentatief metabolisme een noodzakelijke rol speelt bij het regenereren van redoxequivalenten van cofactoren (d.w.z. NAD (P) H en ATP) om glycolytische reacties te ondersteunen8. Daarom is een op HPLC gebaseerde optische detectiemethode die is ontworpen om fermentatieproducten te scheiden een nuttig en vaak toegepast hulpmiddel bij het uitvoeren van verschillende op lysaat gebaseerde CFME-taken.

CFME kan worden geïmplementeerd om metabole eindproducten te accumuleren die geen koolhydraten, organische zuren of alcoholen zijn4. De meting van tussenproducten die net zo snel worden geconsumeerd als ze worden gesynthetiseerd, kan ook wenselijk zijn10. Hoewel HPLC-RID toegankelijk is in termen van kosten en moeilijkheidsgraad, wordt deze methode beperkt door het vermogen om alleen metabolieten te onderscheiden op basis van retentietijd. Een breder scala aan metabolieten kan worden geanalyseerd wanneer vloeistofchromatografie wordt gekoppeld aan MS / MS-detectie (LC-MS / MS)16. Door deze methode worden analyten in de mobiele fase geïoniseerd en differentieel gedetecteerd op basis van de massa- en ladingseigenschappen van elk molecuul. Kennis van zowel de massa-ladingsverhouding (m/z) van de metaboliet als de retentietijd op de kolom vergemakkelijkt zo de scheiding van de meeste metabole tussenproducten en eindproducten met hoge resolutie16. Deze detectietechniek kan ook worden gekoppeld aan nano-vloeistofchromatografie, die veel lagere stroomsnelheden en monsterinjectievolumes biedt, waardoor een gevoeligere detectie van kleine moleculen in de complexe lysaatachtergrond mogelijk is17. LC-MS/MS kan bovendien worden toegepast met isotoopetikettering, aangezien opgenomen labels veranderingen in de m/z-waarden van analytengeven 18. Tijdpuntmetingen geëxtraheerd uit een CFME-reactie aangevuld met een 13C6-glucosesubstraat kunnen dus de eind- of bijproducten bepalen die specifiek zijn afgeleid van aangevulde glucose. Hoewel deze isotooptraceringsmethode nog niet vaak wordt toegepast in CFME-studies, is het een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van metabole conversies in op lysaat gebaseerde CFME-systemen, met name omdat zouttellers (d.w.z. acetaat en glutamaat) in deze reacties ook worden gekataboliseerd als secundaire substraten19. Het gebruik van deze techniek kan dus een uitgebreid beeld schetsen van het glucosemetabolisme in lysaten, dat tot op de dag van vandaag niet volledig wordt begrepen. Hier beschrijft het protocol een methode voor nano-vloeistofchromatografie gekoppeld aan nano-elektrospray ionisatie (nano ESI) MS / MS die kan worden gebruikt om een mogelijk model van glucosemetabolisme te ondervragen, met name in E. coli-lysaten (Figuur 1). Het model is gebaseerd op meldingen van fermentatieve routes en de pentosefosfaatroute die actief is in E. coli-lysaten afgeleid van stammen die zijn gekweekt in rijke media5,6,8,14. De techniek wordt bovendien gebruikt om de productie van aminozuren te onderzoeken, omdat de huidige kennis over aminozuuranabolisme uit glucose in lysaten beperkt is tot enkele voorbeelden zoals de synthese van aromatische aminozuren7. Gezien de meestal polaire aard van eindproducten en tussenproducten in deze routes (d.w.z. organische zuren, suikerfosfaten en aminozuren), werd hier reverse-phased vloeistofchromatografie gebruikt. Deze techniek scheidt polaire verbindingen door elutie van een niet-polaire stationaire fase. Deze verbindingen werden vervolgens geïoniseerd door nano-ESI in negatieve ionenmodus die de detectie van analyten met ten minste één negatieve elementaire lading mogelijk maakt en dus nuttig is voor het detecteren van zure verbindingen. Deze techniek wordt hier gebruikt om glucose-afgeleide 13C-opnemende metabolieten te analyseren en toont het nut van LC-MS / MS voor het begrijpen van glucosemetabolisme in lysaten.

Protocol

1. Start-, stop- en verwerkingstijd beloop CFME-reacties voor HPLC-RID-kwantificering. Ontdooi eerder bereide E. coli-lysaten en bereid de rest van de reactiecomponenten op ijs.OPMERKING: De hier gerapporteerde lysaten waren afgeleid van E. coli BL21DE3-Star gekweekt in 2xYPTG (1,8% glucose) media tot halverwege de logfase. Bereid een geschikt volume filter-gesteriliseerde (0,20 μm poriefilter) S30-buffer (1 M Tris-OAc aangepast tot pH 8,2 met ijsazijn, 1,4 M Mg (OAc)2en 6 M KOAc). Bereid een energiemix met glucose, glutamaatzouten, ATP, co-enzym A, NAD +, Bis-Tris-buffer en dikaliumfosfaat in de S30-buffer. De uiteindelijke concentraties in het gewenste reactievolume dat hier werd gebruikt om CFME-reacties te bereiden, waren 100 mM glucose, 18 mM magnesiumglutamaat, 15 mM ammoniumglutamaat, 195 mM kaliumglutamaat, 1 mM ATP, 0,2 mM co-enzym A, 1 mM NAD+,150 mM Bis-Tris en 10 mM dipotassiumfosfaat. Combineer de componenten in microcentrifugebuizen van 1,5 ml om eindreacties voor te bereiden met 4,5 mg/ml totaal lysaateiwit. Hier werden CFME-reacties bereid met uiteindelijke volumes van 50 μL in drievoud per tijdspunt. Incubeer de reacties bij 37 °C gedurende hun respectieve tijdframes.OPMERKING: Werk snel en voeg lysaat toe als het laatste onderdeel van de reactiemix om voortijdige metabole reacties met glucose- en glutamaatzouten te voorkomen. Minimale glucoseconsumptie kan optreden, afhankelijk van hoe lang reactiemengsels op ijs worden geïncubeerd. Beëindig de reacties en verwerk de monsters voor HPLC-RID-analyse. Om de drievoudige reacties op hun juiste tijdstippen te beëindigen, voegt u onmiddellijk een gelijk volume van 5% trichloorazijnzuur toe aan het uiteindelijke reactievolume van elk monster (d.w.z. 50 μL 5% trichloorazijnzuur aan een reactie van 50 μL). Verdun elk monster met steriel water op 2x het reactievolume (d.w.z. 100 μL). Om tijd nul samen te vatten, mengt u hetzelfde volume van 5% trichloorazijnzuur als het totale eindreactievolume (d.w.z. 50 μL) met het lysaat voordat u de rest van de reactiecomponenten toevoegt. Deze verzuringsstap slaat lysaatenzymen neer voordat ze glucose aanzienlijk metaboliseren. Vortex de monsters en centrifugeer op een benchtop microcentrifuge bij 11.600 x g gedurende 5 minuten en breng supernatanten die de organische analyten bevatten over om buizen schoon te maken. Bewaar de monsters bij -20 °C als hplc-analyses op een andere dag moeten worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat u de opgeslagen monsters op ijs ontdooit voordat u doorgaat naar de volgende stap. Filter elk supernatant met een poriefilter van 0,22 μm. Gebruik als alternatief voor spuiten centrifugebuisfilters en centrifugeer de supernatanten gedurende 1 minuut bij 16.300 x g. Breng elk filtraat over in een schone injectieflacon met HPLC-glas. Plaats injectieflacons in de HPLC autosampler-lade. Bereid monsters voor voor het genereren van standaardcurven. Bereid een stamoplossing voor van alle doelanalyten opgelost in S30-buffer bij equimolaire hoeveelheden boven de startconcentratie van glucose in de CFME-reacties. Hier werd een stamoplossing bestaande uit 150 μM glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol bereid. Voer 1:1 (v/v) seriële verdunningen uit de stamoplossing uit om driedulaatoplossingen van 50 μL te verkrijgen met eindconcentraties variërend van 0 μM tot de voorraadconcentratie (d.w.z. 150 μM). Verdun elke oplossing met 50 μL 5% trichloorazijnzuur en 100 μL steriel water. Herhaal stap 1.3.4-1.3.5.OPMERKING: Voer oplossingen voor het genereren van standaardcurven uit met elke batch monsters om een nauwkeurige kwantificering van metabolietconcentraties te garanderen. 2. Het HPLC-systeem voorbereiden op de detectie van metabolieten. Bereid onder een zuurkast een gesteriliseerde 5 mM zwavelzuuroplossing uit gedeïoniseerd en filtergesteriliseerd water. Voeg ~550 μL van een 98% HPLC-kwaliteit zwavelzuuroplossing toe aan 2 L water om 5 mM zwavelzuur te bereiden.LET OP: Zwavelzuur is een gevaarlijke chemische stof en werken onder een zuurkast met de juiste laboratorium-PBM’s voorkomt inademing, huidcontact en oogcontact. Geconcentreerd zwavelzuur reageert krachtig met water en moet direct aan water worden toegevoegd, niet andersom. Bewaar op een koele, droge plaats uit de buurt van direct zonlicht en volg de juiste afvalverwijderingsmaatregelen die door het laboratorium zijn ingesteld. Bewaar de 2 L fles met 5 mM zwavelzuur geïncubeerd in een waterbad naast het HPLC-instrument. Stel het waterbad in op 35 °C. Plaats slangen met een oplosmiddelfilter in de oplosmiddelfles en bevestig het andere uiteinde aan een ontgassermodule in lijn met de pompmodule.OPMERKING: Het reinigen van het systeem met een vers bereid oplosmiddel voordat u de kolom installeert, is een goede manier om met het instrument om te gaan. Rust het HPLC-instrument uit met de HPLC-kolom in lijn met de RID-module. Plaats de kolom in het waterbad van 35 °C als er geen kolomthermostaat beschikbaar is. Bereid de RID-module voor op analyse bij 35 °C in chromatografiegegevenssysteemsoftware (CDS) die op de systeemcomputer is geïnstalleerd. Selecteer in het menu Beeld de methode en voer besturingsweergave uit. Klik met de rechtermuisknop op de pompmodule > methode. Stel het debiet in op 0,55 ml min-1 en selecteer de aan-knop om de pomp te starten.OPMERKING: Als de kolom in opslag was voordat deze op de HPLC werd uitgerust, verhoogt u het debiet tot 0,55 ml min-1 na het in evenwicht houden van de kolom volgens de instructies van de fabrikant. Klik met de rechtermuisknop op het paneel dat overeenkomt met de RID-module > methode. Stel de temperatuur van de RI-detectormodule in op 35 °C en selecteer Aan om de RI-detectormodule op te warmen. Klik met de rechtermuisknop op het paneel RID-module > Control. Selecteer Aan voor de Purge-referentiecel gedurende ten minste 15 minuten bij gebruik van een nieuw oplosmiddel of 1 uur als er voorafgaand aan deze installatie verschillende oplosmiddelen door de RI-detector stroomden. Klik op de knop Aan. OPMERKING: Houd de pomp en RI-detector aan om een stabiele basislijn op het online perceel te bereiken. Dit wordt beïnvloed door temperatuurschommelingen in het laboratorium en kan tot 4 uur of langer duren. Houd het systeem ‘s nachts aan voordat het monster wordt geladen. 3. Het creëren van een methode voor de isocratische HPLC-scheiding van organische fermentatieproducten in de CDS. Selecteer in de menubalk Methode > Nieuwe methode. Selecteer Methode > Methode opslaan als [Methodenaam].M. Selecteer Methode > Volledige methode bewerken > instrument/acquisitie Stel op het tabblad Binaire pomp het debiet in op 0,55 ml min-1. Selecteer onder Oplosmiddelende letter die overeenkomt met de oplosmiddelinvoer op de pompmodule en stel deze in op 100% voor isocratische elutie. Stel druklimieten in op 0 en 400 bar en voer 30 minuten in als stoptijd. Stel op het tabblad Sampler het injectievolume in op 50 μL. Selecteer de optie Als pomp/Geen limiet onder Stoptime. Stel de geavanceerde hulpinstellingen voor treksnelheid, uitwerpsnelheiden trekpositie in op 200 μL·min-1,200 μL·min-1en -0,5 mm. Stel op het tabblad RID de temperatuur van de optische eenheid in op 35 °C. Selecteer onder Signaalde optie Acquire voor Signaal en >0,2 min voor Peakwidth. Selecteer de optie Als pomp/injector voor Stoptime. Stel onder Geavanceerd op het tabblad RID analoge uitvoer in op 5% nul offset en 500.000 nRIU voor demping. Selecteer de optie Positief voor Signaalpolariteit en de optie Aan voor Automatische nul vóór analyse. Sla de methode op door Methode > Methode opslaante selecteren . Laad de methode door Methode > Methode laden te selecteren > [MethodName]. M. 4. Maak een volgordetabel voor automatisch bemonsteren en start het HPLC-RID-systeem voor gegevensverzameling. Selecteer in de menubalk Volgorde > Nieuwe reekssjabloon. Selecteer Volgorde > Sequentiesjabloon opslaan als [SequenceTemplateName]. S. Selecteer Volgorde > volgordetabel. Voeg ‘n’-rijen toe die overeenkomen met ‘n’-injectieflacons en voer vervolgens injectieflaconposities en monsternamen in onder respectievelijk injectieflacon en Monsternaam,afhankelijk van hun rangschikking op de autosamplerlade. Selecteer de methode die in stap 3 is gegenereerd in het vervolgkeuzemenu Methodenaam en voer 50 μL in als Inj/injectieflacon (injectieflacon per injectieflacon) voor elke rij. Klik op Toepassen en sla de reekssjabloon op door Reekssjabloon te selecteren > Reekssjabloon opslaan. Zorg ervoor dat de reekssjabloon is geladen door Sequence > Load Sequence Template > [SequenceTemplateName] te selecteren. S. Nadat u een stabiele basislijn op de online plot hebt bereikt, klikt u met de rechtermuisknop op het paneel RID-module > Control > Off Recycling Valve om de oplosmiddelstroom door de RID-detector naar afval te leiden. Als u gegevensverzameling wilt starten, selecteert u Volgorde in de menubalk, Volgorde > Uitvoeren. 5. Extraheren en analyseren van gegevens na het uitvoeren. Selecteer Gegevensanalyseweergave in het menu Beeld. Zoek de bestandsnaam van de reeks in de bestandslijst aan de linkerkant van het scherm. Ga op het middelste paneel op het scherm naar de > RID-signaal om de samplechromatogrammen te bekijken. Selecteer een rij die overeenkomt met een standaardmonster met hoge concentratie op het bovenpaneel op het scherm. Noteer de retentietijden voor de doelanalytpieken op het weergegeven chromatogram. Pieken die overeenkomen met de doelanalyten worden langs de retentietijdas gerangschikt als glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol(aanvullende figuur 1).OPMERKING: De eerste grote piek op het chromatogram komt overeen met trichloorazijnzuur. De RI-eenheden moeten consistent zijn voor alle standaardcurvemonsters. Valideer de retentietijd van elke doelanalyt door elke verbinding als een afzonderlijk monster uit te voeren. Extraheer piekgebieden voor elke doelanalyt uit chromatogrammen van de standaarden en de reactiemonsters. Onderscheid of de pieken van interesse goed zijn geïntegreerd door de software. Teken de rode lijn als basis van elke piek om een nauwkeurig geïntegreerd gebied onder de curve te verkrijgen. Als de automatische integratie mislukt (d.w.z. de rode lijn is askew), selecteert u de knop Handmatige integratie in de set integratietools en tekent u handmatig een piekbasis om het piekgebied te integreren.OPMERKING: Als handmatige integratie moet worden uitgevoerd voor een doelanalyt in één monster, blijf dan consistent en integreer handmatig dezelfde analyt in alle monsters. Selecteer het gereedschap Cursor in de Common Tool Set om op correct geïntegreerde pieken te klikken. Het piekgebied en de bijbehorende retentietijd van de geselecteerde piek worden gemarkeerd als een tabelrij op het onderste paneel van het scherm. Als u piekgebieden wilt exporteren, selecteert u Bestand > Resultaten exporteren > integratie. Kwantificeer de doelanalytconcentraties met behulp van standaardcurven. Plot piekgebiedwaarden versus bekende concentraties van monsters in een spreadsheet. Klik met de rechtermuisknop op de uitgezette gegevens, Trendlijn toevoegen > Trendlijn opmaken > Vergelijking weergeven in grafiek. Gebruik in een afzonderlijke spreadsheet de vergelijkingen van standaardcurvetrendlijnen om piekgebiedwaarden om te zetten in concentraties voor elke analyt uit elk monster. Bereken de gemiddelde piekgebieden en standaardfoutwaarden voor drievoud voor gegevensvisualisatie. 6. Starten, stoppen en verwerken van tijdsparen isotooptracering cfme-reacties voor LC-MS/MS kwantificering. Stel drievoudige reacties in per tijdspunt (behalve tijd nul) op ijs zoals beschreven in 1.1-1.2. Gebruik echter in plaats van glucose een eindconcentratie van 100 mM 13C6-glucose in de reacties. Incubeer de reacties bij 37 °C gedurende 1 uur, 2 uur en 3 uur. Om te eindigen, bevriest u de reacties met vloeibare stikstof en bewaart u ze bij -80 °C. Sla deze opslagstap over voor analyse op dezelfde dag.OPMERKING: Trichloorazijnzuur werd niet gebruikt om reacties te stoppen als gevolg van interferentie van het zuur bij het detecteren van sommige centrale koolstofmetabolieten via LC-MS /MS. In plaats daarvan werd extractieoplosmiddel met mierenzuur (stap 6.3) gebruikt om metabole eiwitten neer te slaan, aangezien de massa van mierenzuur onder de detectiegrens van de gerapporteerde MS/MS-methode ligt. Bereid 50 ml van het extractiemiddel. Combineer en vortex 20 ml acetonitril, 20 ml methanol en 10 ml water (alle LC-MS-kwaliteit) in een centrifugebuis van 50 ml samen met 0,199 ml mierenzuur om een oplossing van 0,1 M te maken. Koel het oplosmiddel tijdens de extractie tot 4 °C en bewaar het oplosmiddel bij -20 °C wanneer het niet in gebruik is. Verwerkingsmonsters voor LC-MS/MS-analyse Pipetteer op de dag van de analyse een equivalent volume van het extractiemiddel (d.w.z. 50 μL) naar elk monster. Als de monsters zijn ingevroren, voeg dan het extractiemiddel toe voordat de monsters volledig ontdooien om de reactivering van het glucosemetabolisme te voorkomen. Voer alle monsterverwerkingsstappen op ijs uit. Om tijd nul samen te vatten, pipetteer het uiteindelijke volume extractiemiddel (d.w.z. 50 μL) tot een geschikt volume lysaat voor de gewenste eindconcentratie in de reactie (d.w.z. van 4,5 mg/ml in 50 μL reactievolume). Voeg de rest van de reactiecomponenten toe zoals in stap 1.2. Deze verzuringsstap slaat lysaatenzymen neer voordat ze glucose aanzienlijk metaboliseren. Incubeer de monsters in extractiemiddel op ijs gedurende 30 minuten met zacht schudden en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 21.000 x g om het supernatant van het neergeslagen eiwit te scheiden. Breng 50 μL van het supernatant over naar autosampler-injectieflacons en laad de injectieflacons op de lade binnen de 4 °C autosampler. Bewaar de rest van het supernatant bij -20 °C voor toekomstige analyses. 7. Het LC-systeem instellen voor LC-MS/MS-analyse. Bereid 1 l oplosmiddel A door 77,08 mg ammoniumacetaat volledig op te lossen in 950 ml water en 50 ml isopropanol. Bereid 1 l oplosmiddel B met 650 ml acetonitril, 300 ml water en 50 ml isopropanol samen met 77,08 mg ammoniumacetaat. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen LC-MS-kwaliteit zijn. Sluit de oplosmiddelflessen met oplosmiddelen A en B aan op de pompmodule. Spoel het systeem met een hoog debiet om eventuele luchtverontreiniging die kan zijn opgetreden tijdens de apparatuur van de oplosmiddelen naar het LC-systeem te verwijderen / te beperken. Rust het systeem uit met een C18 omgekeerd gefaseerde kolom (30 cm kolomlengte, 75 μm binnendiameter en 5 μm deeltjesdiameter). Conditioneer de kolom naar het LC-MS-systeem door 100% oplosmiddel B te laten stromen en oplosmiddel A langzaam op te vloeien tot 100%.OPMERKING: Kolomtips werden in eigen huis voorbereid met behulp van een micropipette-trekker en verpakt met drukcellen en helium. 8. Het creëren van een methode op LC-MS/MS data acquisitie en interpretatie software voor het LC systeem gekoppeld aan Fourier Transform en Ion Trap Mass Spectrometers. Open de Tune Plus-software om een tune-bestand voor de MS-methode te bewerken. Open in het bestand op de menubalk een vooraf geïnstalleerd negatief modus tune-bestand. Selecteer ScanMode op de menubalk en selecteer vervolgens Scanvenster definiëren. Stel de microscantijdinstelling voor MSn in op 1 voor zowel Ion Trap als FT. Ga naar de instellingen voor Nano-ESI Source en stel Spray Voltage in op 4 kV. Moduleer dit totdat een acceptabele elektrospray is gegenereerd; doorgaans kan een acceptabele elektrospray worden bereikt binnen het bereik van 2-5 kV. Sla het tune-bestand op. Genereer een nieuwe LC-methode met behulp van de installatiewizard van de software voor gegevensverzameling en -interpretatie van het instrument. Open Roadmap > Sequence Setup > Wizard. Aangezien deze methoden geen kolomverwarming vereisen, slaat u de stap Temp Control over. Selecteer onder Opties voor debietgradiëntpompde optie Multistep. Plaats in het volgende venster 7 lijnen en stel het debiet voor elke rij in op 0,1 ml min-1. Voer de volgende parameters in voor elke rij: van 0-3 min, lever 100% oplosmiddel A; van 3-9 minuten, introduceer een gradiënt van 100% oplosmiddel A naar 20% oplosmiddel B; van 9-19 min, introduceer een nieuwe gradiënt van 20% oplosmiddel B naar 100% oplosmiddel B; van 19-27 min, houd op 100% oplosmiddel B; van 27-28 min, stel de gradiënt terug op 100% oplosmiddel A; van 28-44 min, spoel en reconditioneer de kolom voor volgende runs door op 100% oplosmiddel A te houden. Neem een laatste stap op om het debiet te verlagen tot 0,03 mlmin -1 na voltooiing van de run om het oplosmiddel te behouden wanneer de LC niet in gebruik is. Pas standaardinstellingen toe voor sampleropties > pompdruk als acquisitieoptie en gebruik standaardacquisitietijd en gebruik standaardpompdrukopties. Maak een MS/MS-methode door het pictogram Orbitrap Velos Pro MS te selecteren in de navigatiekolom van het venster Instrumentinstellingen. Klik op Nieuwe methode > gegevensafhankelijke MS /MS. Stel Acquire Time in op de lengte van de LC-run (d.w.z. 44 min), Segmenteer op 1 en Scangebeurtenissen op 11. Selecteer bij Tune File het bewerkte bestand in stap 8.1.OPMERKING: De eerste gebeurtenis is een MS1-voorloperscan met behulp van de Fourier Transform MS (FTMS). De volgende 10 gebeurtenissen zijn MS2-scans die de 10 meest intense en unieke ionen selecteren in elke precursorscan voor MS2-fragmentatie. Stel voor gebeurtenis 1 onder Scanbeschrijving Analyzer in op FTMS en Polariteit op Negatief. Gebruik onder MSn-instellingen een resolutie van 30.000 en een genormaliseerde botsingsenergie van 35 V. Stel scanbereiken in op 50 m/z voor de eerste massa en 1800 m/z voor de laatste massa om kleine moleculen vast te leggen. Voor gebeurtenissen 2 tot en met 11 stelt u onder Scanbeschrijving Analyzer in op Ion Trap. Selecteer Afhankelijke scan en klik op Instellingen > Algemene > dynamische uitsluiting en selecteer Inschakelen; stel een herhalingsduur van 30 s en een uitsluitingsduur van 120 s in om herhaalde scans in de buurt te elimineren. Ga naar Instellingen voor scangebeurtenis en stel Massa bepaald van scangebeurtenis in op 1 voor alle MS2-gebeurtenissen (2 tot en met 11). Als u wilt scannen naar de top 10 meest intense ionen, stelt u elke MS2-scangebeurtenis in om een nde meest intense ion van 1st tot 10thte detecteren. Stel daarom gebeurtenis 2 in om 1 te detecteren als hetne meest intense ion, gebeurtenis 3 om 2 te detecteren, enzovoort. Sluit het installatievenster en ga naar Bestand > Opslaan als [Method_Name].meth.OPMERKING: Raadpleeg voor algemeen gebruik, onderhoud en kalibratie van het LC-instrument en de massaspectrometer de gebruiksaanwijzing en handleidingen die door de fabrikant zijn geleverd. 9. Een run-reeks instellen en de LC-MS/MS-run starten. Stel een Run Sequence in met behulp van de data-acquisitie- en interpretatiesoftware van het LC-MS/MS-systeem. Klik in Roadmap > Sequence Setupmet de rechtermuisknop op de tabel om zoveel rijen als voorbeelden in te voegen. Stel voor elke rij de Inj Vol in op 5 μL en de positie op de respectievelijke positie van de injectieflacon op de autosamplerlade. Voer bestandsnamen in als voorbeeldnamen en stel het gewenste bestandspad in voor de resultaten van het uitvoeren.OPMERKING: Lege injectieflacons met oplosmiddel A kunnen aan het begin van de reeks en tussen elke set drievoudige monsters (elke set tijdspunten) worden uitgevoerd om de kolom te spoelen. Als u het uitvoeren wilt starten, markeert u alle bestandsnamen in de reeks. Selecteer in de menubalk Acties > Reeks uitvoeren > OK. 10. Bestanden consolideren en zoeken naar voorlopige annotaties op MZmine 2.53. Open MZmine en importeer de uitvoerbestanden ‘.raw’ uit stap 9.1. Selecteer in de menubalk Raw Data Methods > Raw Data Import. Selecteer bestanden die overeenkomen met de voorbeelden. Maak een lijst met pieken die onderscheid maken tussen MS1- en MS2-scans. Vanuit de menubalk > Raw Data Methods feature detection > MS/MS Peaklist Builder. Relevante instellingen zijn onder meer m/z Window ingesteld op 0.01 en Time Window ingesteld op de lengte van de run. Selecteer onder ingestelde filters negatief als polariteit en centroïde als spectrumtype. Ga in de menubalk naar Methoden voor functielijst > functiedetectie > Peak Extender. Stel de m/z-tolerantie in op 0,005 m/z of 10 ppm en de minimale hoogte op 1E3. Deze stap creëert volledig uitgewerkte pieken. Verwijder dubbele pieken. Ga terug naar Methoden voor functielijst > filteren > dubbele piekfilter. Relevante instellingen zijn onder meer m/z-tolerantie ingesteld op 0,005 m/z of 10 ppm en de RT-tolerantie ingesteld op 5 min. Als u pieken in vergelijkbare gegevensbestanden (d.w.z. die van drievoudige reacties) wilt uitlijnen, gaat u terug naar Methoden voor functielijstmethoden > Normalisatie > Retentietijdkalibratie. Zorg ervoor dat u drievoudmonsters samen verwerkt en lege plekken weglaat. Relevante instellingen zijn onder meer m/z-tolerantie ingesteld op 0,005 m/z of 10 ppm, RT-tolerantie ingesteld op 3 min absoluut (min) en minimale standaardintensiteit ingesteld op 1E3. Lijn pieken van alle bestanden uit met m/z en retentietijd van Feature List Methods > Alignment > RANSAC Aligner. Stel de m/z-tolerantie in op 0,005 m/z of 10 ppm, de RT-tolerantie en RT-tolerantie na correctie op respectievelijk 44 en 39 minuten, ransac-iteraties op 0, het minimumaantal punten op 10% en de drempelwaarde op 1. Vink de optie Dezelfde laadstatus vereisen aan. Corrigeer voor gegevenspunten die mogelijk verloren zijn gegaan in eerdere stappen in Feature List Methods > Gap Filling > Peak Finder. Relevante instellingen zijn onder meer intensiteitstolerantie ingesteld op 50%, m/z-tolerantie ingesteld op 0,005 m/z of 10 ppm en RT-tolerantie ingesteld op 3 min. Schakel RT-correctie in. 11. Berekening van negatieve modusmassa’s van 13C-gelabelde glucose-afgeleide metabolieten en zoeken naar de m/z-kenmerken van deze analyten in gefilterde gegevens. Bereken de massa’s van 13C-gelabelde metabolieten uit het glucosemetabolisme voor de gerichte zoekopdracht. Bereken de mono-isotopische massa van elke doelverbinding uit het aantal atomen in de molecuulformule van de verbinding en de mono-isotopische massa’s van elk element20. Bereken de negatieve massa van de verbinding [M-H]- door de massa van 1 proton (1,007276 Da) af te trekken van de mono-isotoopmassa. Dit is de massa die wordt gedetecteerd door ms-detectie in negatieve modus nadat moleculen tijdens ionisatie van een waterstofion zijn ontdaan. Bereken uit de negatieve massa de massa van de 13C-integrerende metaboliet. Hier werden de massa’s isotopologen berekend die maximaal glucose-afgeleide 13C-labels bevatten. Gebruik berekende massa’s van 13C-gelabelde metabolieten om m/z-kenmerken uit MZmine-resultaten te zoeken en te annoteren. Bereken voor elke mogelijke treffer de massafout (ppm) met behulp van de volgende vergelijking:OPMERKING: Experimentele m/z-waarden met <15 ppm massafout werden in de huidige analyse beschouwd als vermeende annotaties. Controleer handmatig spectra van vermeende annotaties in een kwaliteitsbrowser om annotaties te bevestigen. Open Roadmap > Qual Browser. Open Raw-bestand op de werkbalk om onbewerkte MS-gegevens van elk monster te importeren. Teken een lijn onder het gewenste bereik van retentietijden (d.w.z. overeenkomend met de vermeende annotatie) op het totale ionchromatogram (bovenpaneel) om een massaspectrum (onderste paneel) te bekijken. Klik met de rechtermuisknop op het spectrum en voer een reeks massa’s in die de m/z van de doelanalyt omvatten. Controleer of de vermeende annotaties duidelijke pieksignalen hebben die aanzienlijk boven de ruis liggen(aanvullende figuur 2). Bereken de gemiddelde piekgebieden en de standaardfouten van positieve annotaties over biologische replicaties voor elk tijdstip. Visualiseer de gegevens (d.w.z. op een staafdiagram) om trends in het glucosemetabolisme te observeren.

Representative Results

Om de op lysaat gebaseerde celvrije synthese van gangbare fermentatieproducten uit glucose te kwantificeren, kregen lysaten afgeleid van stammen gekweekt in 2xYPTG-media 100 μM glucose als primaire koolstofbron8. Reacties werden gedurende een tijdsverloop van 24 uur gestopt door eiwitverzuring. Gefilterde supernatanten die pyruvaat, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol bevatten, geproduceerd uit glucosekatabolisme, werden geladen op de autosamplermodule van een HPLC-systeem uitgerust met een RID-module. Injectieflacons met gefilterde mengsels van fermentatieve eindproducten en glucose bij 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM en 150 μM in S30-buffer werden als normen op het instrument geladen. Analyten werden isocratisch van een HPLC-kolom naar de RID elutisch afgeleid. Pieken voor glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol binnen het bereik van 1 tot 150 μM kunnen worden opgelost door RID. Piekgebieden voor glucose werden afgeleid door handmatige integratie van de RID-gegevens voor tijdsverloop- en standaardcurvemonsters. Geëxtraheerde piekgebieden voor succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol werden genomen uit automatisch geïntegreerde signalen. Alle standaardcurven (piekgebied versus bekende concentratie) hadden R2-waarden >0,99 en waren lineair over het hele hier gebruikte concentratiebereik. Molaire concentraties voor alle doelanalyten werden berekend op basis van hun respectieve standaardcurven. Glucose werd binnen de eerste 3 uur van de reactie geconsumeerd en voornamelijk gefermenteerd tot lactaat (figuur 2A, B). Ethanolaccumulatie trad ook significant op binnen de eerste 3 uur van de reactie en stopte daarna (figuur 2C). De waarneming van significante lactaat- en ethanolproductie met een significant glucoseverbruik na 3 uur was niet ongekend, aangezien lactaat- en ethanolproductieroutes de regeneratie van 1 netto mol NAD + van glycolytische NADH mogelijk maken die nodig is voor voortgezet glucoseverbruik door glycolyse (figuur 1). Lactaat en ethanol kunnen dus worden beschouwd als de eindproducten van grote fermentatie in het celvrije glucosemetabolisme op basis van lysaat. Acetaat was aanvankelijk aanwezig in de reacties als onderdeel van de S30-buffer en hoopte zich onverwacht pas op als gevolg van het metabolisme na 6 uur toen het glucoseverbruik was vertraagd (figuur 2D). Dit resultaat suggereert dat acetaatfermentatie niet noodzakelijkerwijs een snelle glycolytische flux in eerdere tijdspunten mogelijk maakt. Ondertussen werden formate en succinaat gesynthetiseerd als kleine fermentatieproducten (Figuur 2E, F). Al met al maakte de methode de absolute kwantificering van suikersubstraatdepletie en fermentatieve productvorming in E. coli S30-lysaten mogelijk. MS-detectie om het lysaatglucosemetabolisme specifiek te profileren, werd hier specifiek toegepast. Lysaten afgeleid van stammen gekweekt in 2xYPTG media kregen 13C6-glucose als koolstofbron. CFME-reacties werden in drievoud uitgevoerd gedurende 0 uur, 1 uur, 2 uur en 3 uur. Monsters van elk tijdspunt werden geladen op een LC-systeem uitgerust met een kolom met omgekeerde fase en gekoppeld aan Fouriertransformatie- en ionenvalmassaspectrometers. Negatieve ionenmodusspectra werden verkregen en verwerkt om organische zuren, suikerfosfaten en aminozuren te analyseren. Berekende theoretische massa’s van 13C-gelabelde soorten die behoren tot het centrale koolstofmetabolisme werden doorzocht om specifiek glucose-afgeleide verbindingen te identificeren. Op basis van de gebruikte bronstamkweekomstandigheden en eerdere rapporten van actieve routes in E. coli CFME, wordt hier aangenomen dat het lysaateproteoom een metabolisch netwerk omvat dat glucose voedt in glycolytische fermentatie, de pentosefosfaatroute en mogelijk aminozuuranabolisme5,6,7,8,14 ( Figuur1). Daarom werd de zoekopdracht beperkt tot leden van deze routes, waarvan 16 metabolieten met glucose-afgeleide 13C-labels ondubbelzinnig werden geannoteerd (Aanvullende tabel 1). 13 C6-glucose werd waarneembaar geconsumeerd door glycolyse, zoals blijkt uit de fluctuaties in glycolytische intermediaire abundanties (Figuur 3A-E). In overeenstemming met de HPLC-RID-gegevens accumuleerde glucose tot 13C3-lactaaten werd het ook gefermenteerd tot 13C3-succinaat binnen de eerste 3 uur van de reactie(figuur 4A, B). De vorming van 13C3-succinaatisotopoloog ondersteunt het voorgestelde model van lysaatglucosemetabolisme (figuur 1), waarbij succinaat waarschijnlijk wordt gegenereerd door de carboxylering van 3-koolstoffosfoenolpyruvaat (PEP) molecuul en niet door de binnenkomst van een 2-koolstofacetyl-CoA-molecuul in de TCA-cyclus. Activering van de TCA-cyclus is verondersteld in eerdere CFME-studies, maar andere 13C-gelabelde tussenproducten van TCA werden hier niet gedetecteerd8,19,21. 13 C3-aspartaatsynthese vond echter plaats binnen de eerste h en werd geconsumeerd, wat het idee versterkt dat PEP direct wordt omgezet in oxaalacetaat (Figuur 1, Figuur 6C). De gegevens weerspiegelen een lysaatproteoom van bronstammen geoogst tijdens fermentatieve groei op glucoserijke media (2xYPTG). Dit zou verder impliceren dat de rest van de TCA-enzymen die niet deelnemen aan de productie van succinaat een oxidatieve TCA-tak vormen(figuur 1). Geen van de metabolieten in deze route werd echter gedetecteerd, mogelijk omdat hoge concentraties glutamaat toegevoegd aan de CFME-reactie als zoutteller de progressie van deze tak voorkomen. De HPLC-RID-gegevens worden bovendien aangevuld door het ontbreken van 13C 2-acetaatdetectie binnen het reactietijdframe van 3 uur, wat suggereert dat er geen opbouw van acetaat van glucose tot 3 uur is(figuur 2B). De directe voorloper van acetaat, acetylfosfaat (acetyl-P), heeft zich echter opgehoopt, wat suggereert dat de Pta-arm van de Pta-AckA-route voor acetaatsynthese uit acetyl-CoA actief is(Figuur 4C,D). De AckA gekatalyseerde defosforylering van 13C2-acetyl-P tot 13C2-acetaat treedt waarschijnlijk niet binnen dit tijdsbestek op omdat acetaat een belangrijk onderdeel is van de S30-buffer die in de reacties wordt gebruikt (Figuur 1, Figuur 2B). De opname van 13C6-glucose-afgeleide koolstofatomen in suikerfosfaten 6-fosfogluconolacton (6PGL), 6-fosfosogluconaat (6PG), ribulose-5-fosfaat (Ru5P) en sedoheptulose-7-fosfaat (S7P) werd ook waargenomen(figuur 5). Deze resultaten bevestigen de deelname van de pentosefosfaatroute in het lysaatglucosemetabolisme en voeden waarschijnlijk 13C9-tyrosinesynthese, wat eerder is gesuggereerd door een proteomische studie, terwijl het ook een voorloper biedt voor de productie van 13C5-histidine (Figuur 6A,B)7. Gelabelde fenylalanine en tryptofaan werden hier niet waargenomen, en de meeste essentiële aminozuren ook niet. Dit is echter niet helemaal verrassend, aangezien aminozuuranabolisme waarschijnlijk wordt verrijkt in lysaten die zijn afgeleid van cellen die zijn gekweekt in voedingsstofarme omstandigheden of in de stationaire fase7,22. Bovendien suggereren de gegevens tot nu toe dat tussenproducten van glycolyse en fermentatie worden geleid naar cofactorregeneratieve eindreacties, die de synthese van veel aminozuren afgeleid van glyceraldehyde-3-fosfaat, pyruvaat en acetyl-CoA (d.w.z. glycine, cysteïne, serine, alanine, valine, leucine en lysine) moeten uitsluiten (figuur 1). Zoals vermeld, werd 13C3-aspartaatgeproduceerd binnen het eerste uur, terwijl aspartaat afgeleide 13C-bevattende aminozuren (d.w.z. threonine, isoleucine, methionine en asparagine) niet werden waargenomen, mogelijk omdat glucose-afgeleid aspartaat deelneemt aan fermentatie ( Figuur1, Figuur 6C). Ten slotte kan de flux naar gelabeld glutamaat en aminozuren afgeleid van glutamaat zijn belemmerd door hoge niveaus van glutamaat in de reactieomgeving(figuur 1). Figuur 1: Een voorlopig metabolisch model van lysaten afgeleid van E. coli BL21DE3-Star die exponentieel groeien in hoge glucoseconcentraties. Tussenproducten en eindproducten van glycolyse (groen), de pentosefosfaatroute (donkeroranje) en fermentatieve routes (blauw) van acetyl-CoA zijn gemeld in op lysaat gebaseerde CFME. De aanwezigheid van succinaatfermentatie impliceert de activering van de oxidatieve TCA-tak (grijs). Aminozuuranabolisme (goud) in lysaten is niet goed gedefinieerd en wordt hier onderzocht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: HPLC-RID-gegevens voor glucoseconsumptie en fermentatieve eindproductsynthese in CFME-reacties bereid met ruwe E. coli-extracten. (A) Glucoseverbruik en (B) lactaat, (C) ethanol, (D) acetaat, (E) formate en (F) succinaatproductie in CFME-reacties werden gedurende 24 uur gecontroleerd. Gemiddelde mM-concentraties en foutstaven (SE) gekwantificeerd met standaardcurven worden gepresenteerd (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Tijdsverlooptrends van 13C6-glucose en 13C-gelabelde glycolytische tussenproducten in E. coli-lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C6-glucose, (B) 13C6-glucose-6-fosfaat/fructose-6-fosfaat, (C ) 13C6-fructose-1,6-bisfosfaat, (D) 13C3-glyceraldehyde-3-fosfaat/dihydroxyacetonfosfaat, en (E) 13C6 -pyruvaat bij CFME-reacties gedurende 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Tijdsverlooptrends van tussenproducten en eindproducten in 13C6-glucosefermentatie in E. coli lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C3-lactaat, (B) 13C3-succinaat, (C) 13C2-acetylfosfaat en (D) 13C2-acetyl-CoA in CFME-reacties gedurende 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Tijdsverlooptrends van 13C6-glucose afgeleide pentosefosfaat pathway intermediates in E. coli lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C6-6-fosfogluconolacton, (B) 13C6-6-fosfosogluconaat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfaat en (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfaat over 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Tijdsverlooptrends van gedetecteerde 13C6-glucose afgeleide aminozuren in E. coli lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C9-tyrosine, (B) 13C5-histidine en (C) 13C3-aspartaat gedurende 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur 1: Representatief HPLC-RID-chromatogram met pieken voor belangrijke fermentatieve producten in een CFME-reactie geïncubeerd bij 37 °C gedurende 24 uur. Pieken van glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol zijn voldoende te onderscheiden door hun retentietijden op een HPLC-kolom tijdens isaccratische elutie met 5 mM zwavelzuuroplosmiddel. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur 2: Representatieve massaspectra voor 13C-gelabelde metabolieten, met name (A) lactaat, (B) glucose en (C) 6-fosfosogluconaat (6PG) in een CFME-reactie geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1 uur. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel 1: Lijst van gedetecteerde 13C-gelabelde metabolieten, retentietijden (uitgelijnd over monsters met MZmine), theoretisch volledig 13C-gelabelde negatieve modus m/z-waarden, m/z-waarden van gedetecteerde kenmerken en berekende massafouten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De geschetste HPLC-RID-aanpak kan worden gebruikt om de consumptie van suikersubstraat en daaropvolgende conversies naar belangrijke organische zuur- en alcoholproducten van het centrale metabolisme van lysaat in de loop van de tijd met succes te kwantificeren. Bovendien maakt dit protocol gebruik van een eenvoudige isocratische methode met behulp van een enkele mobiele fase, vereist minimale monstervoorbereiding en maakt een eenvoudige gerichte downstream-analyse mogelijk. Analyten gemeten met de HPLC-RID-methode onderscheiden zich uitsluitend door hun retentietijden en dus hun interacties met de geselecteerde kolomhars. De HPLC-kolom die hier wordt gebruikt, is met name ontworpen om koolhydraten, organische zuren en alcoholen te scheiden door grootte-uitsluiting en liganduitwisseling te combineren (d.w.z. ion-gemodereerde partitiechromatografie). De beschreven methode is daarom nuttig voor een meer gerichte analyse van koolhydraatsubstraten en geselecteerde eindproducten van glucosefermentatieroutes die naar verwachting voornamelijk op lysaat gebaseerde biotransformaties8,15,21zullen vergemakkelijken en stimuleren. Dit protocol houdt echter geen rekening met de activering van andere metabole routes in celextracten. Pijpleidingen met andere chromatografische scheidingstechnieken (d.w.z. hydrofiele interactiechromatografie), gradiëntelutiemethoden, meer gecompliceerde monstervoorbereiding (d.w.z. derivatisatie) en verschillende optische detectoren (bijv. ultraviolet licht of verdampingslichtverstrooiingsdetectoren) kunnen worden gebruikt om andere metabolieten zoals aminozuren en suikerfosfaten te detecteren23,24 . Als alternatief kan een globale benadering voor het bestuderen van het lysaatmetabolisme worden gevolgd met behulp van LC-MS / MS.

De beschreven LC-MS/MS-methode is een enkele workflow voor het meten en identificeren van een breder scala aan metabolieten. LC-MS/MS is een state-of-the-art analytisch instrument voor metaboloomprofilering vanwege de gevoeligheid en het vermogen om metabolieten te onderscheiden door retentietijd en m/z-verhoudingen met hoge resolutie16. Met een focus op centrale koolstof metabole routes en aminozuuranabolisme, werd de negatieve modus MS / MS geïmplementeerd om specifiek polaire organische zuren, suikerfosfaten en aminozuren te detecteren. In combinatie met een nano-vloeistofchromatografietechniek biedt de methode een hoge gevoeligheid voor het detecteren van kleine moleculen in de complexe lysaatachtergrond17. In termen van profilering van het op lysaat gebaseerde CFME-metabolisme is een beperking van het beschreven LC-MS / MS-protocol echter de onderste detectiegrens van 50 m / z, die de meting van ethanol, een belangrijk product in het lysaatglucosemetabolisme, evenals formate, die beide anders gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd door de gedetailleerde HPLC-RID-methode, uitsluit. In vergelijking met LC-MS/MS heeft HPLC-RID het extra voordeel van relatieve toegankelijkheid in termen van kosten en moeilijkheidsgraad. Tot op dit laatste punt kan het oplossen van problemen met de hier beschreven LC-MS/MS-methode enige mate van expertise in massaspectrometrie vereisen. Niettemin heeft MS-detectie uniek aantrekkelijke toepassingen ten opzichte van RID, omdat het bovendien gelabelde isotopen in metabolomen kan onderscheiden, een uitstekende techniek voor het begrijpen van koolstofbewegingen van aangevulde substraten via het complexe lysaatmetabool netwerk18. Een dergelijke benadering werd hier toegepast door reacties aan te vullen met 13C6-glucose en de relatieve abundantiewaarden van stroomafwaarts 13C-opnemende metabolieten te analyseren. De analyse maakte de definitie van actieve en inactieve routes mogelijk, ondersteunde eerder gerapporteerde aannames en leverde nieuwe inzichten op over metabole flux in lysaten. Ook voor specifieke analyses kunnen binnen de methode wijzigingen worden aangebracht. Standaardoplossingen van 13C-gelabelde doelverbindingen kunnen bijvoorbeeld samen met monsters worden geanalyseerd om absolute kwantitatieve metingen van glucose-afgeleide moleculen in de loop van de tijd te bereiken en conclusies te trekken over fluxverdelingen. Betere detectie van positief geladen verbindingen kan ook worden ingeschakeld binnen de huidige workflow door reeksen uit te voeren met .meth-bestanden die zijn aangepast voor detectie in de positieve modus.

Analytische bemonstering in beide beschreven methoden is handig geautomatiseerd, waardoor een hoge reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd. Bovendien kunnen soepele analytische runs worden verwacht zolang de juiste instrumentbehandelingspraktijken en onderhoud in acht worden genomen. Bij het gebruik van deze instrumenten om CFME-reacties te analyseren, moeten meer kritische overwegingen worden gemaakt vóór en na de bemonstering. Tijdens de monstervoorbereiding is het belangrijk dat tijdsverloopcontroles representatief zijn voor tijd nul. Hier werden eiwitten in lysaten neergeslagen door verzuring om metabole reacties te stoppen. Voor tijd-nulmonsters werd het zure oplosmiddel gecombineerd met lysaat voordat het reactiemengsel met glucose werd toegevoegd. Verzuring met trichloorazijnzuur zorgde er effectief voor dat glucose niet op tijd nul wordt gemetaboliseerd, zoals blijkt uit de HPLC-RID-gegevens (figuur 2). Terwijl een vergelijkbare procedure om het glucosemetabolisme te dempen werd uitgevoerd in de gerapporteerde LC-MS / MS-analyse, werden 13C-gelabelde metabolieten gedetecteerd in tijd-nulmonsters, zij het bij significant lage abundantiewaarden ten opzichte van monsters geëxtraheerd op latere tijdstippen. Bovendien waren deze waarnemingen beperkt tot tussenproducten van glycolyse. De gegevens suggereren dat de reacties een zekere mate van glycolytische activiteit behouden na verzuring met het extractiemiddel dat wordt gedetecteerd door deze zeer gevoelige methode. De omvang van deze activiteit moet echter worden gekwantificeerd. Een eerdere studie meldde dat zure extractiemiddelen intermediaire glycolytische reacties mogelijk niet voldoende doven, maar een significant glucoseverbruik kunnen stoppen10. Hoewel dit nog verder moet worden onderzocht in het hier gebruikte systeem, kunnen drastische veranderingen in relatieve abundantiewaarden tussen tijd nul en latere tijdpuntmonsters worden geïnterpreteerd als trends in het glucosemetabolisme. Het verkennen van alternatieve blusmethoden wordt echter aanbevolen in vergelijkbare toepassingen, met name voor het verkrijgen van absolute hoeveelheden metabole tussenproducten10. Bovendien moeten ook goede praktijken tijdens downstream-softwareanalyses in acht worden genomen. Consistentie is noodzakelijk bij het handmatig integreren van piekgebieden van RID-signalen om menselijke fouten te verminderen. Handmatige integratie moet ook worden toegepast op piekgebieden van normen wanneer handmatig geïntegreerde piekgebieden worden gebruikt om metabolietconcentraties in monsters te kwantificeren. Gedurende de gerichte LC-MS/MS-analyse moeten voorlopige annotaties van MZmine-analyse worden gevalideerd door handmatige piekcontrole met behulp van een MS-kwaliteitsbrowser, en m/z-functies mogen alleen worden geannoteerd wanneer berekende massafouten aanvaardbaar zijn. Hier werden deze analyses handmatig uitgevoerd voor een beperkte reeks doelen, omdat uitgebreide en robuuste software voor het zoeken naar isotopen nog niet is vastgesteld. Dergelijke geautomatiseerde methoden voor het doorzoeken van 13C-gelabelde metabolieten zijn momenteel echter in opkomst en zouden ook meer gecompliceerde analyses stroomlijnen, zoals profileringslysaten voorbij het centrale koolstofmetabolisme25.

Geavanceerde vloeistofchromatografie is een robuuste en veel toegepaste methode voor het scheiden van kleine moleculen in complexe metabole mengsels11. De beschreven methoden koppelen deze scheidingstechniek aan de refractieve index of massaspectrometrische detectie om met succes metabolietconversies in op lysaat gebaseerde CFME-reacties te analyseren. HPLC-RID en LC-MS/MS zijn individueel krachtige hulpmiddelen voor het profileren van het actieve lysaatmetabolisme, en hun complementariteit kan verder worden gebruikt om de inherente beperkingen van elke techniek aan te pakken. De gerapporteerde methoden maken de toepassing en ontwikkeling van CFME mogelijk, omdat ze kunnen worden gebruikt om het lysaatmetabolisme te begrijpen, verbeteringen in gerichte metabolietconversies te volgen en veranderingen in de metabolietflux op te helderen bij het manipuleren van het lysaatmetabolisme.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesponsord door het Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, als onderdeel van het Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC, voor het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract DE-AC05-00OR22725. Dit manuscript is geschreven door UT-Battelle, LLC onder contract DE-AC05- 00OR22725 met het Amerikaanse ministerie van Energie. De regering van de Verenigde Staten behoudt en de uitgever erkent, door het artikel voor publicatie te accepteren, dat de regering van de Verenigde Staten een niet-exclusieve, betaalde, onherroepelijke, wereldwijde licentie behoudt om de gepubliceerde vorm van dit manuscript te publiceren of te reproduceren, of anderen toe te staan dit te doen, voor doeleinden van de Regering van de Verenigde Staten. Het ministerie van Energie zal openbare toegang bieden tot deze resultaten van federaal gesponsord onderzoek in overeenstemming met het DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

Materials

0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) Corning Costar 8160
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 87003-294
1260 Infinity Binary LC Pump Agilent G1312B HPLC-RID system
1260 Infinity High Performance Degasser Agilent G4225A HPLC-RID system
1260 Infinity Refractive Index Detector Agilent G7162A HPLC-RID system
1260 Infinity Standard Autosampler Agilent G1329B HPLC-RID system
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374 CFME reaction mix component (LC-MS/MS)
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter VWR 10040-436
Acetonitrile (LC/MS grade) Fisher Scientific A955 Solvent preparation for LC-MS/MS
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A7699 CFME reaction mix component
Aminex HPX 87-H column Bio-rad 1250140 Chromatography column for HPLC-RID
Ammonium acetate (LC/MS grade) Fisher Scientific A11450 Solvent preparation for LC-MS/MS
Ammonium glutamate Sigma-Aldrich G1376 CFME reaction mix component
Autosampler vial caps (yellow, snap) Thermo Scientific C4011-50Y Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) Wheaton W225181 Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Benchtop microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Bis-Tris Sigma-Aldrich B9754 CFME reaction mix component
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282 CFME reaction mix component
D-dextrose (Glucose) VWR BDH9230 CFME reaction mix component
Dipotassium phosphate Sigma-Aldrich P8281 CFME reaction mix component
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Formic acid (LC/MS grade) Thermo Scientific 85178 Solvent preparation for LC-MS/MS
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) Polymicro Technologies WM22005-ND Chromatography column for LC-MS/MS
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A6283 S30 buffer ingredient
Isopropanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A461 Solvent preparation for LC-MS/MS
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) Phenomenex N/A; special order Chromatography column for LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific N/A; special order Mass spectrometer for LC-MS/MS
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M5661 S30 buffer ingredient
Magnesium glutamate Sigma-Aldrich 49605 CFME reaction mix component
Methanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A456 Solvent preparation for LC-MS/MS
NAD+ Sigma-Aldrich N0632 CFME reaction mix component
Nanospray Ionization Source ThermoFisher Scientific/Proxeon ES071 (newest model) Mass spectrometer for LC-MS/MS
OpenLab CDS (Online) Software Agilent Version 2.15.26 Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software Thermo Version 2.7 Software for tuning the LC-MS/MS system
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190 S30 buffer ingredient
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1501 CFME reaction mix component
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5415 C
Screw caps (with septa, 9 mm) Supelco 29315-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Screwthread glass vials (2 mL) Supelco 29376-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Sodium acetate Sigma-Aldrich 241245 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium formate Sigma-Aldrich 247596 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium lactate Sigma-Aldrich 71716 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Succinic acid Sigma-Aldrich 398055 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105 Solvent preparation for HPLC-RID
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T6399
Tris-acetate GoldBio T-090-100 S30 buffer ingredient
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Solvent Rack: SRD-3600 Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Water (LC/MS grade) Fisher Scientific W6500 Solvent preparation for LC-MS/MS
Xcalibur Software Thermo Version 3.0.63 Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
  2. Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
  3. Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
  4. Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).
  5. Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
  6. Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
  7. Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
  8. Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).
  9. Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
  10. Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).
  11. Coskun, O. . Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).
  12. Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
  13. Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
  14. Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
  15. Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
  16. Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
  17. Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D’Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
  18. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  19. O’Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
  20. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  21. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  22. Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).
  23. Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
  24. Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
  25. Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).

Tags

Liquid ChromatographyRefractive Index DetectionMass SpectrometryMetabolite ProfilingCell-free SystemsCarbon MetabolismCentral MetabolitesLysate-basedHPLCSample PreparationAcidificationFiltration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems. J. Vis. Exp. (175), e62852, doi:10.3791/62852 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image