عزل البلاعم المشتقة من نخاع العظم واستزراعها في المختبر لدراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال
Summary
تم إنشاء هذا البروتوكول لزراعة رباعي هيدروبيوبتيرين (BH4) – وسينثاز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS) – البلاعم الفئرانية الأولية الناقصة لدراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال. تركز الدراسة على الحد من التلوث المحتمل ل BH4 وغيرها من القطع الأثرية الموجودة في طرق العزل والثقافة التقليدية التي قد تربك النتائج التجريبية وتفسير النتائج.
Abstract
تستمد البلاعم من الخلايا السلفية المكونة للدم في جميع أنحاء الجسم ، وهي مركزية في العمليات الالتهابية ، وتشارك في الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يمكن إجراء دراسة البلاعم في المختبر عن طريق زراعة خارج الجسم الحي من الصفاق أو من خلال تمايز الخلايا السلفية لنخاع العظم النخاعي لتشكيل البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs). ينطوي النهج الشائع لتمايز البلاعم عن السلائف على استخدام وسائط مشروطة من خلايا L929 (LCM). من السهل إنتاج هذه الوسائط ذاتيا ولكنها تعاني من تباين الدفعات ، ومكوناتها غير محددة. وبالمثل ، يستخدم مصل البقر الجنيني (FBS) لدعم النمو ولكنه يحتوي على مزيج كبير من الجزيئات غير المحددة التي قد تختلف بين الدفعات. هذه الطرق ليست كافية لدراسة بيولوجيا أكسيد النيتريك وآليات الأكسدة والاختزال لأنها تحتوي على كميات كبيرة من الجزيئات الصغيرة التي تتداخل إما مع آليات الأكسدة والاختزال أو مستويات تكميلية من العوامل المساعدة ، مثل رباعي هيدروبيوبتيرين (BH4) ، اللازمة لإنتاج NO من سينثاز أكسيد النيتريك القابل للتحريض (iNOS). في هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا محسنا يسمح بالتحكم في بيئة عدم الأكسدة والاختزال عن طريق تقليل مستويات البيوبتيرين الخارجي مع الحفاظ على الظروف المناسبة لنمو الخلايا والتمايز. تساعد الرقابة المشددة على تكوين الوسائط الثقافية على ضمان قابلية الاستنساخ التجريبي وتسهيل التفسير الدقيق للنتائج. في هذا البروتوكول ، تم الحصول على BMDMs من نموذج فأر سيكلوهيدرولاز GTP (GCH) – ناقص. تم إجراء استزراع BMDMs باستخدام وسائط تحتوي إما على (i) LCM مشروط ، أو (ii) مؤتلف M-CSF و GM-CSF لإنتاج الحد الأدنى من القطع الأثرية مع الحصول على ظروف ثقافة BH4 وعدم وجود نقص – مما يسمح بدراسة قابلة للتكرار لبيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال والتمثيل المناعي في المختبر.
Introduction
تم تأسيس البلاعم كنوع من الخلايا المثيرة للاهتمام في مجموعة واسعة من الأمراض والظروف ، ويبدو أن العديد منها لا علاقة له بتركيزها التقليدي على المناعة الفطرية. نظرا لأن فسيولوجيا البلاعم تعتمد اعتمادا كبيرا على الأنسجة أو البيئة التي يقيمون فيها ، فقد نشأت العديد من الطرق والنماذج لدراسة وظيفتها والمسارات المختلفة المعنية. تاريخيا ، هيمنت خطوط الخلايا البعوضية ، مثل RAW264.7 ، على المجال ، ولكن تم استبدالها تدريجيا لصالح نماذج الخلايا الأولية المختلفة. على سبيل المثال ، قد يتم عزل البلاعم الفئرانية من غسل الصفاق بعد العلاج بالثيوغليكولات. في حين توفر نموذجا مفيدا لدراسة الخلايا المقيمة في الأنسجة ، فقد ثبت أن هذه البلاعم البريتونية تظهر استجابة أكثر هدوءا لمختلف المحفزات الخارجية ، مما يحد من ملاءمتها للعديد من التطبيقات النهائية1.
كبديل ، ظهرت البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) ، المشتقة من الخلايا السلفية النخاعية في نخاع العظم ، كنموذج قيم لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا البلاعم ، بما في ذلك النضج والأنماط الظاهرية الكلاسيكية المختلفة المرتبطة بالبلاعم ، M0 (ساذجة ، غير منشطة) ، M1 (مؤيدة للالتهابات ، عادة ما يتم تنشيطها باستخدام LPS / IFN) و M2 (مؤيدة للدقة ، عادة ما يتم تنشيطها باستخدام IL-4)2 ، 3. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا السلفية النخاعية إلى BMDMs يعتمد على وجود عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) في وسائط الثقافة 4,5. يمكن توفير هذا إما في شكل بروتين نقي يضاف إلى الوسائط أو من الوسائط المشروطة L929 (LCM). يجب موازنة مزايا استخدام BMDMs (التكلفة والكفاءة) مقابل القيود التي تمثلها حساسيتها لمختلف المحفزات (السيتوكينات ، والمواد الوسيطة الأيضية ، و RNS / ROS).
تشير البيانات السابقة إلى أن محتويات LCM غير محددة بشكل جيد ومتغيرة في جوهرها ، مما يؤدي إلى كونها غير موثوقة وغير مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، وخاصة تلك المتعلقة تحديدا ببيولوجيا NO أو الأكسدة والاختزال ، لأنها قد تتأثر بشدة بوجود مركبات خارجيةالمنشأ 6. على هذا النحو ، يدعو هذا البروتوكول المفصل إلى استخدام DMEM محدد جيدا: وسائط F12 ذات تباين منخفض من دفعة إلى دفعة وإضافة الفئران المؤتلف M-CSF و GM-CSF (عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم). علاوة على ذلك ، يوفر مصل البقر الجنيني الذي يستخدم عادة كمكمل غذائي في وسائط زراعة الأنسجة مصدرا آخر للمركبات غير المحددة بشكل جيد والتباين المتأصل. لذلك ، من الضروري التحكم في استخدام هذه الإضافات وتحسينها لضمان الثقافة الموثوقة ل BMDMs. باستخدام مصدر محدد منخفض السموم الداخلية من FBS وضمان شراء دفعات واحدة بكميات كبيرة ، يتم تحديد ظروف الثقافة بشكل موثوق به ، ويتم ضمان قابلية التكاثر. وقد ثبت أن البروتوكول الموصوف هنا ينتج مزرعة بلاعم أعلى من نقاء 95٪ عند تقييمه لعلامات سطح البلاعم CD45 و CD11b بواسطة التدفق الخلوي6.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم بروتوكول زراعة BMDMs BH4 و NO-deficient للتحقيق في بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال في البلاعم الأولية من خلال الحد من رباعي هيدروبيوبتيرين (BH4) وغيرها من القطع الأثرية المتداخلة بهدف تعزيز موثوقية وتكرار النتائج التي تم الحصول عليها من هذه النماذج التجريبية.
وتشمل الخطوات الحاسمة استخدام الأواني البلاستيكية الصحيحة. أسلاف البلاعم هي خلايا ملتصقة ولزجة للغاية. لذلك فإن استخدام الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة (TC) أمر بالغ الأهمية في اختيارها وعزلها عن الخلايا السلفية الأخرى ، والتي يمكن أن تلتصق وتقلل من النقاء. في يوم الحصاد ، يتطلب فصل البلاعم عن الألواح PBS باردة الجليد ولكن باستخدام EDTA أو حتى كشط الخلايا بلطف شديد اعتمادا على التطبيق النهائي (تجربة lysed مقابل الخلايا الحية ، على سبيل المثال). وينبغي أيضا إيلاء عناية خاصة فيما يتعلق بالتلوث. أثناء طرد نخاع العظم ، قد يحدث تلوث متقاطع محتمل بالبكتيريا أو الجسيمات الفيروسية من الفراء المتبقي والجلد. ومن الضروري إذن توخي الحذر والعقم قدر الإمكان؛ وبالتالي يتم تشجيع الغطس الساقين تشريح في 70 ٪ من الإيثانول لبضع دقائق. وبالمثل ، يوصى بشدة باستخدام المضادات الحيوية أثناء زراعة البلاعم.
ينشأ قيد آخر لهذا البروتوكول من كثافة طلاء الخلايا في اليوم 0. يحتوي نخاع العظم المحمر على مجموعة متنوعة من الخلايا ، والتي يمكن حسابها بشكل خاطئ وتضمينها كأسلاف للبلاعم ، مما يؤدي إلى عدد إجمالي خاطئ للخلايا. لتجنب التباين اللاحق والمحتمل ، يمكن مسح البلاعم المعزولة بلطف باستخدام PBS الدافئ في اليوم 7 وإعادة طلائها بالكثافة الصحيحة في 2٪ FBS DMEM: F12 قبل 1 ساعة على الأقل من التحفيز للسماح بالالتصاق.
أخيرا ، يعد التحقق من مستويات النتريت عن طريق فحص Griess باستخدام الوسائط من البلاعم المزروعة أمرا ضروريا لتحليل البيانات. على الجانب الإيجابي ، هذا الفحص سريع وغير مكلف للإجراء.
كما هو موضح هنا ، يعد هذا البروتوكول المخصص بديلا أكثر تحديدا وتحسينا للبروتوكول الأكثر شيوعا المستخدم لعزل وزراعة البلاعم باستخدام الوسائط المشروطة بالخلايا L (LCM). في الواقع ، أحد المخاوف الرئيسية باستخدام LCM عند دراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال هو كميات كبيرة من البيوبتيرين المكتشفة ، مما يؤدي إلى تغييرات استقلابية محتملة10. على سبيل المثال ، يمكن ل BH4 الخارجي أن يجدد بسرعة النماذج الناقصة ويعمل كعامل مساعد ل iNOS ، مما يؤدي إلى إنتاج أكسيد النيتريك غير المرغوب فيه. عيب آخر لاستخدام LCM يكمن في إنتاجه – LCM هو مزيج من العوامل المحفزة للمستعمرة ، والسيتوكينات ، وغيرها من المنتجات الثانوية التي تفرزها مباشرة خلايا L-929 ، والتي يمكن أن تؤثر جميعها على فسيولوجيا البلاعم6. على الرغم من إمداداتها الكبيرة في M-CSF ، وهي ضرورية لانتشار البلاعم وبقائها ، فإن اختلاف كل مكون من دفعة إلى أخرى يزيد من خطر التباين عبر التجارب.
لمعالجة كلتا المشكلتين ، يستخدم هذا البروتوكول الجديد وسائط DMEM: F12 المحددة جيدا والتي تحتوي على مستويات منخفضة من البيوبتيرين التي تضاف إليها كمية خاضعة للرقابة من M-CSF و GM-CSF المنقى إليها. كل من السيتوكينات تساعد في تمايز ونمو البلاعم. يؤدي M-CSF بشكل خاص إلى توليد BMDMs من الخلايا السلفية لنخاع العظم من خلال ضمان تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى البلاعم11. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن GM-CSF يعزز السيتوكين الالتهابي ولا ينتج عند إضافته قبل التحفيز ، وهي فائدة حقيقية عند دراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال12,13.
العامل الرئيسي الآخر الذي تعالجه هذه الطريقة الجديدة هو FBS ، الذي يستخدم عادة كمصدر للمغذيات الضرورية لصحة جيدة ونمو الخلايا. على غرار LCM ، يحتوي FBS على مستويات كبيرة من البيوبتيراين. في حين تم النظر في التجويع الكامل للخلايا في المصل قبل التحفيز في البداية باستخدام OptiMEM + 0.2٪ BSA ، أظهرت البلاعم علامات الانفصال ، مما يدل على انخفاض صلاحية الخلايا كما وصفها بيلي وآخرون 6. ومع ذلك ، نظرا لأن البلاعم أظهرت متطلبات مطلقة للمصل ، فقد تم اختيار FBS منخفض للغاية من السموم الداخلية من BioWest. تم اختبار الدفعات بحثا عن البيوبتيرين واختيارها مسبقا قبل الشراء بالجملة لضمان إمدادات موثوقة ومحددة جيدا. وللمضي قدما في الهدف المتمثل في الحد من المصادر الملوثة للبيوبتيرينز، تم اختبار تركيزات منخفضة من FBS. بدلا من استخدام مصل 10٪ كما هو شائع الاستخدام في زراعة الخلايا ، يتم الاحتفاظ بمستوى FBS إلى 5٪ طوال تمايز نخاع العظم لمدة 7 أيام إلى بلاعم ويتم تخفيضه إلى 2٪ أثناء التحفيز بين عشية وضحاها في اليوم الأخير. وهذا يضمن مستويات ضئيلة من البيوبتيرين المكتشفة ولكن ما يكفي من العناصر الغذائية لصحة جيدة والالتزام بالبلاعم. على الرغم من أن هذا البروتوكول المحسن حديثا باستخدام M-CSF المؤتلف يؤدي إلى بيئة أكثر تحكما لزراعة وتنشيط البلاعم الأولية ، فإن القيد الرئيسي هو أن هذه الطريقة أكثر تكلفة من استخدام طريقة LCM.
مع أخذ كل هذه العوامل في الاعتبار ، تمت مقارنة الطريقتين مباشرة. والأهم من ذلك، أن البروتوكول المعدل حديثا الوارد هنا باستخدام M-CSF المؤتلف و GM-CSF أدى إلى نظام أكثر قابلية للتكرار حيث كانت الوسائط خالية من تلوث BH4. وكانت آثار ذلك ذات شقين؛ كانت الخلايا التي تعاني من نقص BH4 تفتقر حقا إلى BH4 ، مما أدى إلى الحد الأدنى من تراكم النتريت القابل للكشف في الوسائط بعد التحفيز إلى حالة M1 مع LPS. كان هذا على النقيض من نفس خلايا BMDM المستزرعة في LCM ، حيث تم اكتشاف BH4 والنتريت الكبيرين.
في الختام ، تكمن قوة هذه الطريقة في جهد التحكم في مستويات البيوبتيرين من خلال تقييم شامل لكل معلمة يمكن أن تؤثر على إشارات NO والأكسدة والاختزال في البلاعم. على وجه الخصوص ، يضمن هذا أقصى قدر من الاستنساخ والتوحيد القياسي في مجال بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل زمالة مؤسسة القلب البريطانية المتوسطة الممنوحة ل M.J.C. (FS/14/56/31049) ، ومنح برنامج مؤسسة القلب البريطانية (RG/17/10/32859 و RG/12/5/29576) ، و Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) ، ومركز أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (NIHR) مركز أكسفورد للبحوث الطبية الحيوية. يود المؤلفون أيضا أن ينوه بالدعم المقدم من مركز BHF للتميز البحثي ، أكسفورد (RE/13/1/30181 و RE/18/3/34214)
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
