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Bioengineering

Caracterização Rápida de Partes Genéticas com Sistemas Livres de Células

Published: August 30, 2021
doi:
10.3791/62816
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1US Army Combat Capabilities Development Command Army Research Laboratory, 2Biology and Biological Engineering,California Institute of Technology, 3Excet, Inc., 4US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center

Summary

Partes genéticas bem caracterizadas são necessárias para o projeto de novos circuitos genéticos. Aqui descrevemos um método econômico e de alto rendimento para caracterizar rapidamente as partes genéticas. Nosso método reduz o custo e o tempo combinando lisatos livres de células, DNA linear para evitar a clonagem e manuseio de líquidos acústicos para aumentar o rendimento e reduzir os volumes de reação.

Abstract

Caracterizar e catalogar partes genéticas são fundamentais para o design de circuitos genéticos úteis. Ter partes bem caracterizadas permite o ajuste fino dos circuitos genéticos, de modo que sua função resulte em resultados previsíveis. Com o crescimento da biologia sintética como um campo, houve uma explosão de circuitos genéticos que foram implementados em micróbios para executar funções relativas à detecção, alteração metabólica e computação celular. Aqui, mostramos um método rápido e econômico para caracterizar partes genéticas. Nosso método utiliza lisado livre de células, preparado internamente como meio para avaliar partes através da expressão de uma proteína repórter. O DNA modelo é preparado por amplificação por PCR usando primers baratos para adicionar partes variantes ao gene repórter, e o molde é adicionado à reação como DNA linear sem clonagem. As peças que podem ser adicionadas dessa maneira incluem promotores, operadores, locais de ligação de ribossomos, isolantes e terminadores. Essa abordagem, combinada com a incorporação de um manipulador de líquidos acústicos e placas de 384 poços, permite que o usuário realize avaliações de alto rendimento de peças genéticas em um único dia. Em comparação, as abordagens de triagem baseadas em células exigem clonagem demorada e têm tempos de teste mais longos devido às etapas de cultura e normalização da densidade de cultura durante a noite. Além disso, trabalhar em lisado livre de células permite que o usuário exija um controle mais rígido sobre as condições de expressão através da adição de componentes exógenos e DNA em concentrações precisas. Os resultados obtidos a partir da triagem livre de células podem ser usados diretamente em aplicações de sistemas livres de células ou, em alguns casos, como uma maneira de prever a função em células inteiras.

Introduction

Um esforço central da biologia sintética é desenvolver kits de ferramentas genéticas contendo partes bem caracterizadas, que podem ser usadas para construir circuitos genéticos1 que realizam funções úteis quando implantados em micróbios ou lisatos livres de células. As áreas em que tais circuitos genéticos ganharam força são a detecção 2,3,4, o desempenho humano5,6, os biocombustíveis7,8, a produção de materiais 9,10 e a computação celular 11. Registros de partes genéticas padronizadas foram estabelecidos12 para catalogar peças novas e existentes em categorias como promotores, operadores, sequências de codificação e terminadores, para citar apenas alguns. Esforços como o concurso iGEM (International Genetically Engineered Machines)13 têm sido fundamentais para caracterizar e catalogar essas partes genéticas. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para facilitar a rápida montagem dessas partes em circuitos genéticos úteis14,15. Um software foi desenvolvido até mesmo para automatizar a composição de peças bem caracterizadas em circuitos que atingem uma função desejada16. No entanto, a montagem de circuitos genéticos úteis com funções previsíveis repousa na presunção de que os kits de ferramentas genéticas contêm partes genéticas bem caracterizadas. Devido à necessidade desses kits de ferramentas para o avanço da biologia sintética, inúmeros esforços para melhor catalogar circuitos e peças com dados de caracterização adequados têm sido descritos 17,18,19,20,21.

Uma abordagem para caracterizar componentes genéticos faz uso de sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS), que reconstituem funções celulares como transcrição e tradução ex vivo22. Diversos estudos têm demonstrado o potencial da SDFC para prototipagem de componentes genéticos23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 seja para aplicações diretas em sistemas livres de células ou para predizer a função de construtos genéticos em células, como a atividade relativa de partes dentro de uma biblioteca 29 , otimização da via metabólica27 e carga celular30. As vantagens da prototipagem em CFPS versus células destacadas por esses estudos incluem evitar a clonagem demorada, o controle preciso sobre a concentração de DNA e outros componentes de reação e a capacidade de misturar e combinar facilmente múltiplas construções de DNA. A vantagem de evitar a clonagem é especialmente aparente quando se usa modelos lineares de DNA, o que permite que novas construções sejam montadas por métodos in vitro que levam horas em vez de dias33. A capacidade de manipular a concentração de construções de DNA e outros componentes simplesmente por pipetagem torna a abordagem ainda mais atraente, permitindo experimentos de alto rendimento alimentados por robôs de manuseio de líquidos34,35. Embora os sucessos usando CFPS para prototipagem tenham sido relatados, é importante notar que ainda não se sabe em quais contextos os resultados do CFPS podem prever de forma confiável a funcionalidade nas células.

Aqui, apresentamos um método para prototipagem CFPS que enfatiza as vantagens em velocidade, taxa de transferência e custo em comparação com as abordagens tradicionais baseadas em células. A abordagem é derivada de nosso trabalho anterior, onde usamos CFPS para caracterizar rapidamente uma biblioteca de variantes promotoras T7 reguladas pelo fator de transcrição TetR32, expandindo significativamente o pequeno punhado de variantes promotoras T7 reguladas que estavam disponíveis na literatura na época36,37. Outros, desde então, ampliaram ainda mais o leque desses promotores38. Em nosso método, a montagem da construção genética é acelerada usando PCR para amplificar o DNA modelo por meio de primers que adicionam partes genéticas variantes a um gene repórter. O manuseio acústico de líquidos em placas de 384 poços é usado para aumentar o rendimento e diminuir o volume de materiais necessários. Trabalhos anteriores demonstraram o uso bem-sucedido do manuseio de líquidos acústicos em volumes significativamente menores39,40 com variabilidade comparável à pipetagem manual de volumes maiores 41. Além do método, fornecemos informações de solução de problemas e uma avaliação de possíveis economias de custo e tempo. Note-se que, embora incluamos aqui um protocolo para a produção de lisados livres de células baseado em Sun et al.42, inúmeros outros kits e protocolos comerciais 43,44 também devem funcionar. Da mesma forma, enquanto demonstramos o método para a caracterização de variantes promotoras32, outras partes podem ser trocadas por amplificação por PCR, como riboreguladores, Sítios de Ligação de Ribossomas (RBSs), isolantes, etiquetas proteicas e terminadores. Esperamos que esta metodologia possa ajudar a comunidade de biologia sintética a continuar a aumentar o número de partes caracterizadas para a montagem de circuitos genéticos previsíveis com função útil.

Protocol

1. Preparação do extrato celular Preparação de meios de comunicaçãoPara meios 2xYT: Adicionar 16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl a 900 mL de água deionizada e ajustar o pH para 7,0 com 5 M de NaOH. Aumentar o volume da solução para 1 L utilizando água desionizada e esterilizar em autoclave ou filtro. Alternativamente, compre mídia 2xYT. Para o tampão S30B: Preparar uma solução de 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato e 5 mM de Tris em 2 L de água deionizada. Use 2 M Tris para ajustar o pH a 8,2, autoclave, e armazenar a 4 °C. Complete a solução adicionando ditiotreitol (TDT) a uma concentração final de 1 mM imediatamente antes da utilização. Preparação de célulasStreak Escherichia coli BL21(DE3) Rosetta2 células ou outra linhagem celular de escolha (ver Cole et al.44 para uma recente revisão abrangente) em uma placa de ágar LB (Caldo de lisogenia) e incubar a 37 °C por 10-14 h. Use uma única colônia de E. coli para inocular 3 mL de meio 2xYT em um tubo de cultura de 10 mL. Incubar este tubo a 37 °C com agitação a 250 rpm durante 8 h. Utilizar 50 μL da cultura de 3 ml para inocular 50 ml de meio 2xYT num balão de 500 ml. Incubar este balão a 37 °C com agitação a 250 rpm durante 8 h. Utilizar 7,5 ml da cultura de 50 ml para inocular cada um dos quatro frascos desconcertados de 4 L contendo 0,75 L de meio 2xYT. Incubar estes frascos a 37 °C com agitação a 220 rpm até atingirem uma densidade óptica a 600 nm de 2 a 4, após aproximadamente 3-4 h. Colher as células de cada balão, transferindo-as para recipientes de 1 L e centrifugando a 5 000 x g durante 12 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante decantando em um recipiente de resíduos. Lave cada pellet celular com 150 mL de tampão S30B gelado, ressuspendendo-os completamente usando uma pipeta para interromper a massa celular e, em seguida, colete as células novamente por centrifugação a 5.000 x g por 12 min. Descarte o sobrenadante. Lave cada pellet celular novamente em 40 mL de tampão S30B gelado, ressuspendendo-os completamente e interrompendo a massa celular usando uma pipeta. Transferir as células para tubos cônicos pré-pesados de 50 mL e coletar as células novamente por centrifugação a 2.000 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação. Pese os pellets de células molhadas. Congelar rapidamente os pellets de células colocando os tubos diretamente no azoto líquido e conservar a -80 °C. Lise celularDescongele as pelotas da célula no gelo. Ressuscite cada pellet celular em 1,4 mL de tampão S30B por 1 g do pellet celular por vórtice. Lisar as células por célula de pressão francesa a 640 psi a 4 °C. Recolher o lisado em tubos de microcentrífuga sobre gelo e adicionar 3 μL de 1 M de TDT por 1 ml de lisado imediatamente após a lise.NOTA: É melhor tocar na válvula de liberação de imprensa francesa com uma pequena haste de metal para manter a pressão uniforme e evitar quedas repentinas de pressão. Limpar o lisado por centrifugação a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C e eliminar o pellet depois de pipetar o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga gelado, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Centrifugar o sobrenadante uma segunda vez a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C. Pipetar o sobrenadante resultante para um tubo de microcentrífuga gelado. Descarte o pellet. Incubar o sobrenadante em banho-maria de 37 °C durante 1 h. Limpar o sobrenadante por centrifugação a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C e transferir o sobrenadante resultante para um tubo de microcentrífuga gelado, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Centrifugar o sobrenadante uma segunda vez a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C e transferir o sobrenadante resultante para um tubo de microcentrífuga gelado, tomando cuidado para não perturbar qualquer pelota restante. Distribuir o sobrenadante em alíquotas de 100 μL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e congelá-los rapidamente, colocando-os diretamente em nitrogênio líquido. Conservar o sobrenadante a -80 °C. 2. Preparação de modelo linear Design do primerEscolha uma sequência principal como o modelo de PCR. Inclua no mínimo uma sequência de repórter, como sfGFP (superpasta Green Fluorescent Protein), LacZ ou Espinafre aptamer. Inclua outras partes que serão fixadas em variantes filtradas, como terminadores, promotores ou RBSs, conforme apropriado para o design.NOTA: A inclusão de um terminador nem sempre é necessária para a expressão do DNA linear em sistemas livres de células. Para os primers para a frente, escolha um mínimo de 20 pb correspondente à extremidade 5 da sequência principal como a extremidade 3 da iniciadora. Se adicionar partes à extremidade 5′ da construção, projete o restante da extremidade 5ʹ do primer para adicionar as partes genéticas de interesse à sequência central via amplificação por PCR (Figura 1A e Figura 2).NOTA: Como os primers acima de ~60 pb frequentemente aumentam drasticamente de custo, vários primers sobrepostos podem ser projetados para adicionar sequências mais longas ou várias partes. Embora vários primers possam ser usados em uma única reação de PCR, recomenda-se a realização de várias rodadas de PCR. Para os primers reversos, escolha um mínimo de 20 pb para corresponder à extremidade 3′ da sequência principal como a extremidade 3 da cartilha. Se adicionar partes à extremidade 3′ da construção, projete o restante da extremidade 5ʹ do primer para adicionar as partes genéticas de interesse à sequência de núcleos via amplificação por PCR (Figura 1A e Figura 2). Certifique-se de que a temperatura de recozimento do primer reverso está a menos de 5 °C da temperatura de recozimento de todo o primer dianteiro. Amplificação de modelo linearDeterminar o número de reações de PCR a serem executadas com base no número de sequências de núcleos e calcular a quantidade de cada componente necessário usando a Tabela 1. Prepare a mistura mestra de acordo com a Tabela 1 e armazene-a no gelo. Aliquota 30 ou 40 μL (ver Tabela 1) da mistura principal no número determinado de tubos de PCR e adicionar 10 μL de cada primer variável (ou seja, primers que codificam uma mudança de peça, ver Tabela 1) a 5 μM a tubos de PCR adequadamente rotulados. Coloque os tubos de PCR no termociclador e execute o seguinte programa de PCR: 98 °C por 3 min; 30 ciclos de 98 °C para 15 s, XX °C para 20 s, 72 °C para YY min; extensão final a 72 °C durante 10 min. Em seguida, mantenha a reacção a 4 °C.Onde, XX representa a temperatura de recozimento para o primer com a temperatura de recozimento mais baixa e YY representa o tempo de extensão calculado para o comprimento do amplificão com base nas recomendações do fabricante para a polimerase de alta fidelidade utilizada. Otimize essas condições conforme necessário para diferentes primers e/ou modelos. (Opcional) Adicione 1 μL de enzima de restrição DpnI para digerir o modelo original. Incubar a reacção a 37 °C durante 1 h. Execute esta etapa somente se o modelo original for DNA plasmídico. Analisar 5 μL de cada produto de PCR por eletroforese em gel. Separe o produto com um gel de agarose a 1% a 180 V durante 20 min. Verifique o tamanho correto da banda, que varia de acordo com a sequência principal escolhida e o comprimento das peças adicionadas. Purifice o modelo linear usando um kit de purificação de PCR comercial ou pelo método de limpeza de PCR preferido. Se várias bandas estiverem presentes por análise de eletroforese em gel, otimize as condições de PCR ou purifique as bandas de peso molecular corretas usando um kit comercial de extração de gel de acordo com a recomendação do fabricante. Quantifique cada molde de DNA usando um espectrofotômetro. Avalie a qualidade do molde de DNA verificando se a relação de 260 nm/280 nm é de aproximadamente 1,8. (Opcional) Separe novamente uma parte do molde de DNA usando um gel de agarose a 1% a 180 V por 20 min e certifique-se de que todas as bandas indesejadas foram removidas durante a purificação do molde. Use modelos de DNA purificados imediatamente ou armazene a -20 °C. 3. Preparação de proteínas purificadas Expressão proteicaPara cada proteína a ser expressa, monte uma construção de expressão apropriada. Codon-otimizar o gene para expressão em E. coli. Inserir o gene em um vetor de expressão pET-22b ou outro vetor de expressão apropriado através do método de montagem de plasmídeos preferido. Transforme o plasmídeo de expressão em células de expressão BL21(DE3) Rosetta2 ou outra linhagem celular apropriada. Para cada proteína, use uma única colônia para inocular 3 mL de meio LB em um tubo de cultura de 10 mL. Incubar estes tubos a 37 °C com agitação a 250 rpm durante a noite. Inocular um balão de 2 L contendo 750 ml de meio LB com 1 ml da cultura nocturna. Incubar estes frascos a 37 °C com agitação a 250 rpm até atingirem uma OD600 de 0,6-1,0. Induzir a expressão proteica adicionando 0,75 ml de isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) em água a cada balão e continuar a incubar estes frascos a 37 °C com agitação a 250 rpm durante 4 h. Colher as células de cada balão, utilizando um frasco de centrifugação de 1 L, por centrifugação a 5 000 x g durante 12 min. Descarte o sobrenadante. Transfira os pellets para um tubo cônico de 50 mL e pese cada pellet. Congelar rapidamente as células em azoto líquido e armazená-las a -80 °C ou passar para o passo 3.2.NOTA: Espera-se que 2-5 g de células por 0,75 mL resultem desta etapa. Purificação de proteínas por cromatografia em coluna de afinidade de níquelPrepare o tampão de lise combinando 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl e 5 mM imidazol. Ajuste para pH 8,0. Prepare o tampão de lavagem combinando 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl e 25 mM imidazol. Ajuste para pH 8,0. Prepare o tampão de eluição combinando 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl e 250 mM imidazol. Ajuste para pH 8,0. Prepare o tampão de diálise combinando 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl e 2% de DMSO. Ajuste para pH 7,5. Descongele os pellets de células colocando os tubos em água à temperatura ambiente. Adicionar 5 mL do tampão de lise por 1 g do pellet celular e ressuspender por vórtice. Lise as células por sonicação. Separe a célula homogeneizada de modo que não haja mais de 30 mL por tubo cônico de 50 mL e mantenha cada tubo no gelo. Lise as células usando um sonicator com uma sonda de 0,16 cm de diâmetro em rodadas de 15 s com quebras de 30 s, 10 vezes.NOTA: Evite a formação de espuma, pois isso desnatura a proteína. A formação de espuma pode ser evitada mantendo a ponta do sonicador pelo menos 2/3 submersa no lisado enquanto estiver operacional. Outros métodos de lise celular além da sonicação também são possíveis44. Limpar o lisado por centrifugação a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C e colocar o sobrenadante num novo tubo cónico de 50 ml. Adicionar 1 mL de resina de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) para cada 5 mL de sobrenadante. Divida a pasta de lisado celular/Ni-NTA de modo que não haja mais de 36 mL por tubo cônico de 50 mL. Incubar a 4 °C num rotador de tubo a 10 rpm durante 1 h. Carregar a resina decantando a pasta de lisado celular/Ni-NTA numa coluna de cromatografia de volume de leito de 2 ml e recolher o eluante, se necessário, para análise posterior, caso contrário, eliminar. Lave a resina com 10 volumes de cama de resina de tampão de lavagem. Recolher a proteína adicionando três volumes de tampão de eluição em resina à coluna e concentrar o volume em 1,5 ml utilizando um concentrador centrífugo com a membrana de corte de peso molecular adequada para cada proteína. Dializar a proteína contra 2 L de tampão de diálise a 4 °C durante 1 h. Dializar novamente a proteína contra 2 L de tampão de diálise durante a noite a 4 °C. Quantificar a proteína utilizando o seu coeficiente de extinção molar e absorvância a 280 nm. Analise a proteína quanto à pureza, separando-a usando eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Conservar a proteína a -80 °C. 4. Síntese proteica livre de células Preparação da mistura de reação CFPSPrepare a Mistura de Suplementos seguindo as etapas de Preparação de Solução de Aminoácidos, Preparação de Solução Energética e Preparação de Tampão em Sun et al.42. Conservar separadamente ou combinado a -80 °C em alíquotas. Garantir que as concentrações finais correspondam às descritas em Sun et al.42 na seção Execução Experimental de uma Reação TX-TL. Prepare um aditivo para proteger o DNA linear da degradação. Se estiver usando o GamS33,45, prepare-se por meio das etapas da seção 3 acima ou obtenha de um fornecedor comercial; para outras abordagens, verificar a literatura correspondente46,47,48. Alternativamente, use um sistema CFPS que não exija aditivos49. Preparar a polimerase T7, proteínas repressoras e outros aditivos usando as etapas da seção 3 acima ou obter de um fornecedor comercial. Determinar o número de reações CFPS a serem realizadas e calcular a quantidade de cada componente necessário usando a Tabela 2. Modificar as concentrações dos componentes, incluindo a adição ou remoção de componentes, conforme necessário, e ajustar a quantidade de água de modo que o volume final de cada mistura de reação seja sempre de 10 μL. Da mesma forma, modifique a mistura mestra para facilitar a dispensação de outros componentes pelo manuseio de líquidos acústicos, conforme desejado (consulte a seção Discussão ). Descongele todos os componentes no gelo e prepare uma mistura mestra misturando cada componente conforme calculado acima. Misture bem todos os componentes por pipeta. Preste muita atenção para evitar a precipitação, especialmente para a mistura de aminoácidos. Mantenha a mistura mestra no gelo. Resfrie uma placa de 384 poços no gelo e distribua a mistura mestra em alíquotas de 9 μL em cada poço.NOTA: É possível distribuir esses componentes por manuseio acústico de líquidos, embora se deva tomar cuidado para garantir a dispensação adequada (consulte a seção Discussão para solução de problemas). Distribuição de componentes adicionais por manuseamento acústico de líquidosCalcule a quantidade de proteína repressora (e outros componentes opcionais) necessária para todas as reações CFPS. Descongele a proteína repressora no gelo e distribua-a em uma placa fonte acústica de manuseio de líquidos ou outra placa apropriada. Certifique-se de que a quantidade apropriada de volume morto necessária para o tipo de placa de origem usada esteja incluída. Distribuir a proteína repressora em volumes de 1 μL nos poços apropriados através do manipulador de líquidos. Para obter mais informações sobre a solução de problemas de distribuição, consulte a seção Discussão . Curvas padrãoIncluir uma diluição em série do reportador purificado (ver secção 3 para purificação de proteínas)41 ou uma norma química adequada50 na placa, a fim de permitir a comparação dos resultados com outros estudos e outros laboratórios. Escolha uma faixa de concentrações apropriada para o repórter usado e a faixa de expressão esperada dos experimentos. Executando reações CFPSPré-aqueça o leitor de placas a 30 °C. Defina o leitor de placas para ler nas configurações apropriadas para o repórter usado na sequência principal sem agitar as etapas.NOTA: Enquanto 30 °C é usado aqui, 29 °C e 37 °C também são comumente usados e funcionam bem com este protocolo. Outras temperaturas podem ser preferidas para preparações alternativas de reação livre de células. Para intervalos de leitura, 10 min é suficiente para alcançar uma boa resolução para os dados representativos aqui apresentados; no entanto, outras resoluções podem ser melhores dependendo da proteína do repórter e da receita específica de CFPS. (Opcional) Execute uma reação de teste primeiro para definir a configuração apropriada de ganho ou sensibilidade para capturar a mudança na fluorescência sem estouro de sinal. Sele a placa de 384 poços com uma tampa selável de plástico impermeável para evitar a evaporação. Se possível, no instrumento, defina um gradiente de temperatura vertical de 1 °C para limitar a condensação na vedação. Coloque a placa de 384 poços no suporte da placa e comece a ler.

Representative Results

Para demonstrar a utilidade de nossos métodos, apresentamos resultados que descrevem os efeitos da proximidade da sequência tetO com o promotor T7 na regulação da expressão impulsionada por RNAP T7. Os resultados completos e suas implicações podem ser encontrados no trabalho de McManus et al.32. O fluxo de trabalho é descrito na Figura 1. Quinze modelos lineares, variando apenas na distância do promotor T7 em relação à sequência tetO , foram preparados por PCR-amplificando o repórter sfGFP com primers projetados para adicionar cada variante promotora (Figura 2), conforme descrito na seção 2 do protocolo. Os componentes e reações da reação da CFPS foram preparados seguindo o protocolo. A expressão da TFGsf foi medida a partir de cada modelo com titulação de 12 concentrações diferentes da proteína TetR, em triplicata, utilizando-se um manipulador acústico de líquidos. Em 36 reações CFPS por modelo e 15 modelos, um total de 540 reações para todo o conjunto de combinações de T7-tetO foram realizadas. Toda a avaliação foi realizada em duas placas em dois leitores de placas. A análise desses dados mostrou que o RNAP T7 regula negativamente a expressão impulsionada por T7 igualmente até 13 pb a jusante desde o início do transcrito T7 (Figura 3). Este resultado tem implicações para o projeto futuro de circuitos gênicos reguláveis acionados por T7, descrevendo uma suposta janela para uma repressão efetiva de T7 por outros repressores. A comparação dos resultados do protocolo aqui descrito com o DNA preparado pela clonagem tradicional revelou uma diferença pequena, mas estatisticamente significativa, no grau de repressão do TetR entre os formatos. Levantamos a hipótese de que a ligação não específica do TetR ao DNA vetorial poderia explicar a diferença observada. Os resultados experimentais mostraram que a adição de DNA vetorial linear às reações com DNA molde linear reduziu a diferença para significância não estatística, embora não tenha descartado contribuições de outros fatores, como diferenças na periodicidade da hélice do DNA para formatos lineares versus circulares, o que, por sua vez, poderia afetar a ligação do TetR. Dependendo do aplicativo, o uso de modelo linear pode exigir validação adicional. Além disso, incluímos dados representativos sobre possíveis problemas com a dispensação precisa usando o manuseio de líquidos acústicos (Figura 4). Uma solução de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x, pH 7,4 contendo corante tartrazina 0,25 mM, foi utilizada para avaliar dois métodos de programação de um manipulador de líquidos acústicos para dispensar volumes >1 μL. Após a dispensação do líquido, a placa de destino foi selada e centrifugada a 1.500 x g por 1 min, e a absorbância a 425 nm medida com um leitor de placas. Resultados representativos de nove experimentos são mostrados e demonstram uma dosagem mais consistente em toda a série de oito poços de destino quando a transferência de 5 μL é dividida em dispensas separadas de 1 μL. Com base nessas observações, recomenda-se que as transferências >1 μL sejam divididas em múltiplas transferências de ≤1 μL. Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes sobre como solucionar esse aspecto importante do protocolo. Figura 1: Fluxo de trabalho de um dia para a avaliação de partes promotoras em extrato livre de células. (A) Um repórter é amplificado por PCR usando primers contendo partes genéticas a serem avaliadas (2-5 h). (B) A mistura de reação livre de células é preparada conforme detalhado no protocolo e distribuída em uma placa de 384 poços com os modelos amplificados por PCR (30 min). (C) O manuseio de líquidos acústicos é usado para distribuir componentes adicionais, que podem incluir proteínas repressoras, moléculas efetoras e quaisquer outros efetores condicionais (10 min). (D) A expressão da proteína repórter de cada reação é medida em um leitor de placas (2-16 h, dependendo da receita e do construto do CFPS). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Desenho do primer para adicionar partes genéticas a um gene repórter por amplificação por PCR . (A) O gene repórter sfGFP (verde) será amplificado para adicionar um RBS (vermelho) e um promotor T7 (azul) por PCR. (B) O sfGFP (verde) e um RBS (vermelho) serão amplificados para adicionar uma sequência tetO (ouro) e um promotor T7 (azul) por PCR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: O efeito da posição tetO na regulação de uma expressão acionada por T7. Valores de repressão máxima normalizados para o modelo linear e circular em função da posição do tetO . Os traços representam a média e os desvios-padrão para três repetições. Esta figura foi modificada de McManus et al.32 sob uma licença Creative Commons CC-BY. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Usando corante de tartrazina para validar a dispensação de líquidos com um manipulador de líquidos acústico. Barras pretas indicam a distribuição de 5 μL de solução de tartrazina de um único poço de fonte em cada um dos oito poços de destino consecutivos de uma placa de 384 poços usando um único comando de programação. As barras cinzas indicam a distribuição de 1 μL de um único poço de origem em cada um dos oito poços de destino consecutivos usando um único comando de programação e, em seguida, repetindo essa etapa quatro vezes para um total de 5 μL dispensados em cada poço de destino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nome do componente Volume para 1 reação (μL) Volume para 110% do número X de reações (μL) Q5 PCR Premix 25 Água 4 Modelo (1–3 ng/μL) 1 (se fixado1) Primer para a frente (5 μM) 0 ou 10 (se fixado1) Primer reverso (5 μM) 0 ou 10 Master Mix Total: 30 ou 40 (se variável1) Primer para a frente (5 μM) 0 ou 10 (se variável1) Primer reverso (5 μM) 0 ou 10 Tabela 1: Planilha para a preparação de reagentes para reações de PCR. Os valores na coluna mais à direita podem ser preenchidos pelos usuários, dependendo do número pretendido de reações. 1 Os primers variáveis contêm uma parte específica a ser adicionada na reação de PCR e podem ser o primer para frente, o primer reverso ou ambos. Os primers fixos não adicionam uma peça e podem ser o primer dianteiro ou o primer reverso, mas não ambos. Nome do componente Volume para 1 reação (μL) Volume para 110% do número X de reações (μL) Extrato de célula 4.2 Suplemento Mix 3.3 Proteína GamS (207 μM) 0.15 DNA modelo (20 nM) 1 T7 Polimerase (13 mg/mL) 0.12 Água 0,73 (este número pode variar) Master Mix Total: 9 Proteína Repressora: 1 Tabela 2: Planilha para a preparação de reagentes para reações de CFPS. Os valores na coluna mais à direita podem ser preenchidos pelos usuários, dependendo do número pretendido de reações. Tabela Suplementar. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussion

Os protocolos aqui descritos fornecem um meio rápido e econômico de rastrear partes genéticas através da expressão de uma proteína repórter por CFPS. Partes genéticas bem caracterizadas são cruciais para o projeto de circuitos genéticos previsíveis com função útil. Essa metodologia aumenta a produtividade e diminui o tempo necessário para rastrear novas partes genéticas, removendo a necessidade de trabalhar em células vivas, mantendo a funcionalidade que espelha o ambiente celular, retendo o processo metabólico de expressão de proteínas no lisado celular. Nosso protocolo pode ser realizado em 1 dia após o recebimento dos primers (~2,5-6 h para preparação da reação, 2-16 h para a reação da CFPS; Figura 1), em comparação com pelo menos 3 dias para a clonagem tradicional (1 dia cada para montagem e transformação da construção, verificação da sequência de clones e cultura de células para avaliação). Estimamos ainda que o custo por construção usando DNA linear é aproximadamente um terço da clonagem tradicional (US $ 78 versus US $ 237; Quadro Complementar 1) Métodos. Os serviços de síntese comercial atualmente cotam um mínimo de 4 dias úteis, dependendo do tamanho, embora tenham custos semelhantes ao nosso método se os fragmentos lineares forem rastreados diretamente no CFPS (US $ 78 versus US $ 91); não verificámos esta abordagem. O custo para avaliar uma peça com CFPS é pequeno em comparação com a geração do DNA do modelo (US $ 0,05 / reação22 versus US $ 78 por modelo), embora deva ser notado que os custos de inicialização para reagentes a granel e equipamentos de lise são de pelo menos vários milhares de dólares. O uso de um manipulador de líquidos acústico melhora apenas marginalmente os custos, permitindo volumes menores até 0,5 μL40; a vantagem mais significativa é a redução do tempo para preparar reações (~ 10 min vs. até 1 h, dependendo do número de reações), especialmente quando a preparação de um grande número de reações levanta preocupações de reação preparada sentada por longos tempos antes da incubação.

Embora rápidas e econômicas, as limitações sobre quando a prototipagem da CFPS prevê adequadamente a função in vivo ainda não foram vistas. Por exemplo, qualquer reatividade cruzada com DNA genômico não será detectada devido à remoção do genoma do hospedeiro durante a produção do sistema CFPS. Além disso, as concentrações de componentes podem ser 1-2 ordens de magnitude mais baixas na CFPS do que nas células51, o que provavelmente afetará o comportamento de algumas partes como resultado de diferentes condições de apinhamento macromolecular. Além disso, a capacidade do DNA linear de prever a função in vivo pode ser limitada, por exemplo, quando a estrutura secundária do DNA desempenha um papel importante. Uma limitação final é que as construções não são verificadas em sequência antes de testar as funções. Pode haver casos em que a parte caracterizada não esteja realmente alinhada com a sequência teórica pretendida. Todas essas limitações podem ser mitigadas validando um subconjunto das peças triadas por esse método no aplicativo in vivo pretendido.

Originalmente, desenvolvemos essa metodologia para investigar os efeitos da mudança da posição do operador em promotores híbridos de T7-tetO 32. Apresentamos os protocolos aqui em um formato mais genérico, de modo que eles possam ser aplicados a promotores, operadores, sequências de ligação de ribossomos, isolantes e terminadores. Essas partes genéticas podem ser adicionadas à extremidade 5· ou 3° do gene repórter por PCR usando primers para cada projeto, evitando a necessidade de síntese ou clonagem de cada variante para teste. Os produtos de PCR resultantes servem como modelo de DNA para avaliação através da expressão de uma proteína repórter. Em nosso trabalho, o protocolo de purificação de afinidade fornecido aqui foi usado para TetR e GamS. O mesmo procedimento pode ser usado para a expressão e purificação de outros repressores, ativadores, polimerases, fatores sigma e outras proteínas cognatas a uma parte genética de interesse, embora modificações possam ser necessárias para que a proteína desejada seja expressa. A purificação e titulação dessas proteínas em reações CFPS permite uma caracterização mais detalhada de uma parte genética específica. Finalmente, existem inúmeros protocolos alternativos de CFPS e cada um deve ser passível da parte de triagem de peças da metodologia. Como exemplo, não incluímos uma etapa de diálise neste protocolo, que outros consideraram importante para a expressão de promotores bacterianos nativos22. Variar as concentrações de componentes constituintes subjacentes da CFPS também é possível. O uso do manuseio de líquidos aumenta a capacidade de testar a miríade de condições, aumentando o rendimento e diminuindo os materiais necessários34,35.

Uma área que pode exigir uma solução de problemas significativa é a otimização do manipulador de líquidos acústicos. A dosagem do manipulador de líquidos acústicos deve ser otimizada para cada componente que está sendo transferido e é altamente recomendável executar controles para verificar a distribuição e a reprodutibilidade adequadas antes de coletar dados. O tipo ideal de placa de origem e a configuração da classe de líquido dependerão do líquido específico a ser dispensado e de seus componentes. Não é recomendado o uso de placas revestidas de amina para dispensar DNA, pois o revestimento de amina pode interagir com o DNA. Deve-se notar também que a capacidade de dispensar concentrações mais altas de certos componentes pode depender do modelo de manipulador de líquidos acústicos. Uma transferência de líquido de teste pode ser conduzida por meio da dosagem em uma vedação de placa de folha para visualizar a formação bem-sucedida de gotículas; no entanto, este teste fornece informações limitadas e gotículas de diferentes configurações podem parecer idênticas. O uso de um corante solúvel em água, como a tartrazina, pode ser usado para verificar com mais precisão se o volume correto é dispensado com uma determinada configuração ou fluxo de trabalho (consulte Resultados representativos). A programação ideal das transferências de líquidos também pode influenciar a precisão e a consistência dos dados gerados; para transferências >1 μL de um poço de origem para um poço de destino, descobrimos que as transferências sequenciais de ≤1 μL devem ser programadas para reduzir a variabilidade sistemática do poço ao poço (Figura 4). Por fim, os volumes mortos teóricos e reais do poço de origem podem variar drasticamente dependendo do tipo de placa de origem, da configuração da classe líquida e dos componentes do líquido específico; O uso da função de levantamento do manipulador de líquidos acústicos para avaliar os volumes do poço antes de executar um programa pode ajudar a avaliar com que precisão o instrumento é capaz de medir um determinado líquido.

O desempenho da reação da CFPS pode variar quando comparados resultados entre diferentes usuários, lotes de materiais, leitores de placas e laboratórios41. Para os casos em que tais comparações são necessárias durante a prototipagem de circuitos genéticos, recomendamos a inclusão de reações de controle interno com promotores constitutivos padrão em cada placa de reação para ajudar a normalizar os resultados em configurações experimentais. O método de preparação do DNA também pode contribuir principalmente para a atividade da SFCP; recomenda-se a inclusão de uma etapa de precipitação de etanol. Além disso, a composição ótima da reação pode variar de acordo com o lote de extrato34. Demonstrou-se que as concentrações óptimas de glutamato de magnésio e glutamato de potássio, em particular, variam de acordo com o lote42 ou com a proteína promotora ou repórter utilizada24. As concentrações desses componentes devem ser otimizadas por triagem em várias concentrações de cada componente por construção genética e por preparação de extrato celular para determinar as condições ideais para a expressão de proteínas. Finalmente, as práticas recomendadas para um desempenho consistente da reação CFPS incluem mistura completa, pipetagem cuidadosa e consistência na preparação de cada componente do reagente.

Além da caracterização de peças individuais, o mesmo método pode ser utilizado para peneirar combinações de peças que formam circuitos complexos, como circuitos lógicos16 ou osciladores52,53. Esse método também pode ser aplicado à triagem e otimização de biossensores para aplicações em diagnósticos epidemiológicos 54,55,56,57 ou detecção e quantificação de perigos 3,58,59. A aplicação de técnicas orientadas por IA, como o aprendizado ativo34, também pode ser emparelhada com a natureza de alto rendimento desse método para impulsionar a rápida exploração de espaços complexos de design biológico. Em última análise, imaginamos que essa abordagem apoie tempos de desenvolvimento acelerados para novos projetos genéticos em biologia sintética.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi possível graças ao programa de Pesquisa Aplicada para o Avanço das Prioridades de Ciência e Tecnologia do Escritório do Secretário de Defesa. Agradecemos a Scott Walper (Laboratório de Pesquisa Naval) por fornecer o estoque de sfGFP usado, e Zachary Sun e Abel Chiao (Tierra Biosciences) por discussões frutíferas relacionadas à prototipagem com sistemas livres de células e solução de problemas relacionados ao manuseio de líquidos acústicos.

Materials

2x YT medium Sigma-Aldrich Y2377-250G Alternative to making 2xYT media
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01 S30 Buffer B
Agar Bacto 214010 For plating cells
Chromatography column (5 cm diameter) BIO-RAD 731-1550 Used for protein purification.
Destination plate Thermo Scientific Nunc plate 142761 For CFPS reactions
DMSO Sigma-Aldrich D2650 For dialysis buffer
DpnI NEB R0176L For digestion of plasmid templates
DTT Roche 20871723 S30 Buffer B
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 Novagen 70954 Cell line used for production of lysate and purified proteins
Echo acoustic liquid handler Labcyte 525 Acoustic liquid handler
French pressure cell Thermo Spectronic FA-078 For lysing cells for CFPS
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 For buffers
Impermeable plastic sealable lid Thermo 232702 Plate seal
IPTG RPI I56000-25.0 Used for protein induction.
K-Glu Sigma-Aldrich g1501-500G S30 Buffer B
Labcyte Echo source plate Labcyte PL-05525 For use with Echo acoustic liquid handler
Mg-Glu Sigma-Aldrich 49605-250G S30 Buffer B
NaCl Sigma-Aldrich S7653-250G For buffers
NaHPO4 Sigma-Aldrich 71505 For dialysis buffer
NaOH Mallinckrodt Chemicals 7708-10 For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899
Ni-NTA resin Invitrogen R901-15 For production of purified proteins
PCR H2O Ambion AM9937 PCR of linear templates
Plate Reader BioTek H10 Plate reader used
Q5 PCR Master Mix NEB M0494S PCR of linear templates
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28606 PCR of linear templates
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR of linear templates
QSonica Ultrasonic Processor Qsonica Q700 Cell disruption during protein purification
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801 Updated supplier from Sun et al.
Tris MP 819623 S30 Buffer B
Tris-Cl Sigma-Aldrich T5941 For buffers
Tryptone Fluka T7293 For making 2xYT media
Yeast Extract Bacto 212750 For making 2xYT media
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McManus, J. B., Bernhards, C. B., Sharpes, C. E., Garcia, D. C., Cole, S. D., Murray, R. M., Emanuel, P. A., Lux, M. W. Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (174), e62816, doi:10.3791/62816 (2021).
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