無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

1.細胞抽出液の調製 メディアの準備2xYT培地の場合:16 gのトリプトン、10 gの酵母エキス、および5 gのNaClを900 mLの脱イオン水に加え、5 M NaOHでpHを7.0に調整します。脱イオン水を使用して溶液容量を1 Lに上げ、オートクレーブまたはフィルター滅菌します。または、2xYTメディアを購入します。 S30Bバッファーの場合:14 mM Mg-グルタミン酸、60 mM K-グルタミン酸、および5 mMトリスを2 Lの脱イオン水に溶解した溶液を調製します。2 M Trisを使用してpHを8.2に調整し、オートクレーブで4°Cで保存します。 使用直前にジチオスレイトール(DTT)を終濃度1 mMまで添加して溶液を完成させます。 細胞の調製大腸菌BL21(DE3)Rosetta2細胞または他の選択した細胞株(最近の包括的なレビューについてはCole et al.44を参照)をLB(Lysogeny Broth)寒天プレートにストリークし、37°Cで10〜14時間インキュベートします。 単一の 大腸菌 コロニーを使用して、10 mLの培養チューブに3 mLの2xYT培地を接種します。このチューブを37°Cで250rpmで8時間振とうしながらインキュベートします。 3 mL 培養液から 50 μL を使用して、500 mL フラスコに 50 mL の 2xYT 培地を接種します。このフラスコを37°Cでインキュベートし、250rpmで8時間振とうします。 50 mLの培養液から7.5 mLを使用して、0.75 Lの2xYT培地を含む4つの4 Lバッフルフラスコにそれぞれ接種します。これらのフラスコを37°Cでインキュベートし、約3〜4時間後に2〜4の600 nmで光学密度に達するまで220 rpmで振とうします。 各フラスコから細胞を回収し、1 L容器に移し、5,000 x g で4°Cで12分間遠心分離します。 上清を廃液容器にデカントして廃棄する。 各細胞ペレットを150 mLの氷冷S30Bバッファーでピペットで完全に再懸濁して細胞塊を破壊して洗浄した後、5,000 x g で12分間遠心分離して細胞を再度回収します。上澄み液を捨てる。 各細胞ペレットを完全に再懸濁し、ピペットを使用して細胞塊を破壊して、40 mLの氷冷S30Bバッファーで再度洗浄します。細胞を事前に秤量した50 mLコニカルチューブに移し、2,000 x g で4°Cで8分間遠心分離して細胞を再度回収します。 上澄み液をデカントして廃棄する。 湿電池ペレットの重量を量る。チューブを液体窒素に直接入れてセルペレットを瞬間凍結し、-80°Cで保存します。 細胞溶解セルペレットを氷上で解凍します。 各細胞ペレットをボルテックスにより細胞ペレット1 gあたり1.4 mLのS30B緩衝液に再懸濁します。 4°Cで640psiのフレンチ圧力セルで細胞を溶解します。 氷上の微量遠心チューブにライセートを収集し、溶解直後にライセート1 mLあたり3 μLの1 M DTTを追加します。注意: 均一な圧力を維持し、圧力の急激な低下を避けるために、小さな金属棒でフランスのプレスリリースバルブをタップするのが最善です。 30,000 x g で4°Cで30分間遠心分離してライセートを除去し、ペレットを壊さないように注意しながら、上清を新しい氷冷マイクロ遠心チューブにピペッティングした後、ペレットを廃棄します。 上清を30,000 x g で4°Cで30分間2回遠心分離します。 得られた上清を氷冷した微量遠心チューブにピペットで入れます。ペレットを廃棄します。 上清を37°Cの水浴中で1時間インキュベートします。 15,000 x g で4°Cで15分間遠心分離して上清を除去し、得られた上清をペレットを乱さないように注意しながら氷冷のマイクロ遠心チューブに移します。 上清を15,000 x g で4°Cで15分間2回遠心分離し、得られた上清を氷冷した微量遠心チューブに移し、残りのペレットを破壊しないように注意します。 上清を100 μLのアリコートで1.5 mLの微量遠心チューブに分配し、液体窒素に直接入れて瞬間凍結します。上清は-80°Cで保存する。 2. リニアテンプレートの準備 プライマー設計コア配列を PCR テンプレートとして選択します。少なくとも、sfGFP(スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質)、LacZ、ホウレンソウアプタマーなどのレポーター配列を含めます。デザインに応じて、ターミネーター、プロモーター、RBSなど、スクリーニングされたバリアント間で修正される他の部品を含めます。注:ターミネーターを含めることは、無細胞系における線状DNAからの発現に必ずしも必要ではありません。 フォワードプライマーの場合、コア配列の5’�末端をプライマーの3’末端として一致させる最低20 bpを選択します。構築物の5’末端に部分を追加する場合は、プライマーの5’末端の残りの部分を設計して、PCR増幅を介して目的の遺伝子部分をコア配列に追加します(図1A および 図2)。注:~60 bpを超えるプライマーはコストが劇的に増加することが多いため、複数の重複するプライマーを設計して、より長い配列または複数の部分を追加することができます。1回のPCR反応で複数のプライマーを使用できますが、複数回のPCRを行うことをお勧めします。 リバースプライマーの場合、コア配列の3’末端をプライマーの3’末端として一致させるために、最低20 bpを選択します。構築物の3’末端に部分を追加する場合は、プライマーの5’末端の残りの部分を設計して、PCR増幅を介して目的の遺伝子部分をコア配列に追加します(図1A および 図2)。リバースプライマーのアニーリング温度が、フォワードプライマー全体のアニーリング温度の5°C以内であることを確認します。 線形テンプレート増幅コア配列の数に基づいて実行するPCR反応の数を決定し、 表1を使用して必要な各成分の量を計算します。 表1に従ってマスターミックスを調製し、氷上に保管します。マスターミックスの30または40 μL(表1を参照)を決定された数のPCRチューブに分注し、各可変プライマー(すなわち、一部変化をコードするプライマー、表1を参照)を5 μMで10 μLずつ適切に標識したPCRチューブに加えます。 PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、次のPCRプログラムを実行します:98°Cで3分間;98°Cで15秒、XX°Cで20秒、72°CでYY分の30サイクル。72°Cで10分間の最終延長。その後、反応液を4°Cで保持した。ここで、XXは低いアニーリング温度を有するプライマーのアニーリング温度を表し、YYは使用されるハイフィデリティポリメラーゼに関するメーカーの推奨に基づいてアンプリコンの長さについて計算された伸長時間を表す。必要に応じて、さまざまなプライマーやテンプレートに対してこれらの条件を最適化します。 (オプション)1 μLのDpnI制限酵素を加えて、元のテンプレートを消化します。反応液を37°Cで1時間インキュベートします。この手順は、元のテンプレートがプラスミドDNAである場合にのみ実行します。 各PCR産物の5 μLをゲル電気泳動で分析します。1%アガロースゲルを180 Vで20分間分離します。選択したコア シーケンスと追加されたパーツの長さによって異なる正しいバンド サイズを確認します。 市販のPCR精製キットを使用して、または好ましいPCRクリーンアップ方法によって、リニアテンプレートを精製します。ゲル電気泳動分析で複数のバンドが存在する場合は、PCR条件を最適化するか、メーカーの推奨に従って市販のゲル抽出キットを使用して正しい分子量バンドを精製してください。 分光光度計を使用して各DNAテンプレートを定量します。260 nm/280 nmの比率が約1.8であることを確認して、DNAテンプレートの品質を評価します。 (オプション)1%アガロースゲルを使用して180 Vで20分間、DNAテンプレートの一部を分離し、テンプレート精製中に不要なバンドが除去されていることを確認します。 精製したDNAテンプレートをすぐに使用するか、-20°Cで保存してください。 3.精製タンパク質製剤 タンパク質発現発現させるタンパク質ごとに、適切な発現コンストラクトを組み立てます。コドン- 大腸菌での発現のために遺伝子を最適化します。好ましいプラスミドアセンブリ法を介して、遺伝子をpET-22b発現ベクターまたは他の適切な発現ベクターに挿入します。発現プラスミドをBL21(DE3)Rosetta2発現細胞または他の適切な細胞株に形質転換します。 各タンパク質について、単一のコロニーを使用して、10 mLの培養チューブに3 mLのLB培地を接種します。これらのチューブを37°Cでインキュベートし、250rpmで一晩振とうします。 750 mLのLB培地を含む2 Lフラスコに1 mLの一晩培養液を接種します。これらのフラスコを37°Cでインキュベートし、250rpmで振とうして、OD600 が0.6〜1.0に達するまでインキュベートします。 各フラスコに水中の1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)0.75 mLを加えてタンパク質発現を誘導し、250 rpmで4時間振とうしながら37°Cでインキュベートし続けます。 各フラスコから細胞を回収し、1 L遠心ボトルを使用して、5,000 x g で12分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。 ペレットを50 mLコニカルチューブに移し、各ペレットを計量します。細胞を液体窒素で瞬間凍結し、-80°Cで保存するか、ステップ3.2に進みます。注:0.75 mLあたり2〜5 gの細胞がこのステップから生じると予想されます。 ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるタンパク質精製50 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および5 mM イミダゾールを組み合わせて溶解バッファーを調製します。pH 8.0に調整します。 50 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および25 mMイミダゾールを組み合わせて洗浄バッファーを調製します。pH 8.0に調整します。 50 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および250 mMイミダゾールを組み合わせて溶出バッファーを調製します。pH 8.0に調整します。 50 mM NaHPO4、100 mM NaCl、および2% DMSOを組み合わせて透析バッファーを調製します。pH 7.5に調整します。 チューブを室温の水に入れてセルペレットを解凍します。細胞ペレット1 gあたり5 mLの溶解バッファーを加え、ボルテックスにより再懸濁します。 超音波処理によって細胞を溶解する。50 mLのコニカルチューブあたり30 mL以下になるようにセルホモジネートを分離し、各チューブを氷上に置きます。直径0.16cmのプローブを備えた超音波処理器を使用して、30秒の休憩で15秒のラウンドで細胞を溶解し、10回。注:これはタンパク質を変性させるので、発泡を避けてください。泡の形成は、それが動作している間、超音波処理器の先端を溶解液中に少なくとも2/3沈めておくことによって回避することができる。超音波処理以外の細胞溶解の他の方法も可能である44。 15,000 x g で4°Cで30分間遠心分離してライセートを除去し、上清を新しい50 mLコニカルチューブに入れます。 上清5mLごとにニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)樹脂1mLを加える。細胞ライセート/Ni-NTAスラリーを、50 mLのコニカルチューブあたり36 mL以下になるように分割します。チューブローテーター上で4°C、10rpmで1時間インキュベートします。 細胞ライセート/Ni-NTAスラリーを2 mL 床容量クロマトグラフィーカラムにデカントしてレジンをロードし、必要に応じて溶離液を収集してさらなる分析を行い、それ以外の場合は廃棄します。10 容量のレジンベッドの洗浄バッファーでレジンを洗浄します。 3 つのレジンベッド容量の溶出バッファーをカラムに加えてタンパク質を回収し、各タンパク質に適した分子量カットオフメンブレンを備えた遠心濃縮器を使用して容量を 1.5 mL まで濃縮します。 タンパク質を2 Lの透析バッファーに対して4°Cで1時間透析します。2 Lの透析バッファーに対して4°Cで一晩タンパク質を再度透析します。 280 nmでのモル吸光係数と吸光度を使用してタンパク質を定量します。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用してタンパク質を分離することにより、タンパク質の純度を分析します。タンパク質を-80°Cで保存します。 4. 無細胞タンパク質合成 CFPS反応混合物の調製Sunら42のアミノ酸溶液調製、エネルギー溶液調製、およびバッファー調製の手順に従って、サプリメントミックスを調製します。別々に保存するか、アリコートで-80°Cで組み合わせて保存してください。最終濃度が、TX-TL反応の実験的実行セクションのSunら42 に記載されている濃度と一致することを確認してください。 線状DNAを分解から保護するための添加剤を準備します。GamS33,45を使用する場合は、上記のセクション3の手順で準備するか、商用ベンダーから入手してください。他のアプローチについては、対応する文献46,47,48を確認してください。あるいは、添加剤49を必要としないCFPSシステムを使用する。 上記のセクション3の手順を使用してT7ポリメラーゼ、リプレッサータンパク質、およびその他の添加剤を調製するか、市販のベンダーから入手してください。 実行するCFPS反応の数を決定し、 表2を使用して必要な各成分の量を計算しました。必要に応じて成分を追加または削除するなど、成分の濃度を変更し、各反応混合物の最終容量が常に10 μLになるように水の量を調整します。同様に、必要に応じて音響液体の取り扱いによって他のコンポーネントのディスペンスを容易にするようにマスターミックスを変更します(「 ディスカッション」 セクションを参照)。 すべての成分を氷上で解凍し、上記で計算したように各成分を混合してマスターミックスを調製します。ピペットですべての成分を完全に混合します。特にアミノ酸混合物については、沈殿を避けるために細心の注意を払ってください。マスターミックスを氷の上に置いておきます。 384ウェルプレートを氷上で冷却し、マスターミックスを9 μLアリコートで各ウェルに分配します。注意: これらのコンポーネントは、音響液体の取り扱いによって分配することは可能ですが、適切に分配されるように注意する必要があります(トラブルシューティングについては、「 ディスカッション 」セクションを参照してください)。 音響液体処理による追加コンポーネントの分配すべてのCFPS反応に必要なリプレッサータンパク質(およびその他のオプション成分)の量を計算します。 リプレッサータンパク質を氷上で解凍し、音響液体処理ソースプレートまたは他の適切なプレートに分配します。使用するソースプレートのタイプに必要な適切な量のデッドボリュームが含まれていることを確認してください。 リプレッサータンパク質を1 μL容量でリキッドハンドラーを介して適切なウェルに分配します。ディストリビューションのトラブルシューティングの詳細については、「 ディスカッション 」セクションを参照してください。 標準曲線精製レポーターの段階希釈(タンパク質精製についてはセクション3を参照)41 または適切な化学標準50をプレートに含めて、他の研究や他のラボと結果を比較できるようにします。使用するレポーターに適した濃度の範囲と、実験の予想される発現範囲を選択してください。 CFPS リアクションの実行プレートリーダーを30°Cに予熱します。 プレートリーダーを、ステップを振らずにコアシーケンスで使用されるレポーターに適した設定で読み取るように設定します。注:ここでは30°Cが使用されますが、29°Cと37°Cも一般的に使用され、このプロトコルでうまく機能します。他の温度は、代替の無細胞反応調製物のために好ましいかもしれない。読み取り間隔の場合、ここに示す代表的なデータの良好な分解能を達成するには10分で十分です。ただし、レポータータンパク質と特定のCFPSレシピによっては、他の解像度の方が優れている場合があります。 (オプション)最初にテスト反応を実行して、適切なゲインまたは感度設定を設定し、シグナルオーバーフローなしで蛍光の変化をキャプチャします。 蒸発を防ぐために、384ウェルプレートを不浸透性のプラスチック製の密閉可能な蓋で密封します。可能であれば、機器で1°Cの垂直温度勾配を設定して、シールの結露を制限します。384ウェルプレートをプレートホルダーに置き、読み取りを開始します。