JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

Published: August 30, 2021
doi:
10.3791/62816
, , , , , , ,
1US Army Combat Capabilities Development Command Army Research Laboratory, 2Biology and Biological Engineering,California Institute of Technology, 3Excet, Inc., 4US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center

Summary

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

Abstract

אפיון וקטלוג של חלקים גנטיים הם קריטיים לתכנון מעגלים גנטיים שימושיים. חלקים מאופיינים היטב מאפשרים כוונון עדין של מעגלים גנטיים, כך שתפקודם מביא לתוצאות צפויות. עם צמיחת הביולוגיה הסינתטית כשדה, חלה התפוצצות של מעגלים גנטיים שיושמו במיקרובים כדי לבצע פונקציות הנוגעות לחישה, שינוי מטבולי ומחשוב תאי. כאן אנו מציגים שיטה מהירה וחסכונית לאפיון חלקים גנטיים. השיטה שלנו משתמשת בליזט ללא תאים, המוכן בבית כמדיום להערכת חלקים באמצעות ביטוי של חלבון כתב. הדנ”א של התבנית מוכן על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים זולים כדי להוסיף חלקי וריאנט לגן המדווח, והתבנית מתווספת לתגובה כדנ”א ליניארי ללא שיבוט. חלקים שניתן להוסיף בדרך זו כוללים מקדמים, מפעילים, אתרי קשירת ריבוזום, מבודדים וטרמינטורים. גישה זו, בשילוב עם שילוב של מטפל נוזלים אקוסטי ולוחות 384 בארות, מאפשרת למשתמש לבצע הערכות תפוקה גבוהה של חלקים גנטיים ביום אחד. לשם השוואה, גישות סינון מבוססות תאים דורשות שיבוט הגוזל זמן רב ויש להן זמני בדיקה ארוכים יותר בשל צעדי נורמליזציה של תרביות לילה וצפיפות תרביות. יתר על כן, עבודה בליזט ללא תאים מאפשרת למשתמש לשלוט בצורה הדוקה יותר על תנאי הביטוי באמצעות הוספת רכיבים אקסוגניים ודנ”א בריכוזים מדויקים. תוצאות המתקבלות מסינון ללא תאים יכולות לשמש ישירות ביישומים של מערכות נטולות תאים או, במקרים מסוימים, כדרך לחזות תפקוד בתאים שלמים.

Introduction

מאמץ מרכזי של ביולוגיה סינתטית הוא לפתח ערכות כלים גנטיים המכילות חלקים מאופיינים היטב, אשר ניתן להשתמש בהם לבניית מעגלים גנטיים1 המבצעים פונקציות שימושיות כאשר הם פרוסים במיקרובים או בליזטים נטולי תאים. תחומים שבהם מעגלים גנטיים כאלה צברו תאוצה הם חישה 2,3,4, ביצועים אנושיים 5,6, דלקים ביולוגיים 7,8, ייצור חומרים 9,10 ומחשוב תאי 11. רישומים של חלקים גנטיים מתוקננים הוקמו12 כדי לקטלג חלקים חדשים וקיימים לקטגוריות כגון מקדמים, אופרטורים, רצפי קידוד וטרמינטורים, אם להזכיר רק כמה. מאמצים כגון תחרות iGEM (מכונות מהונדסות-גנטית בינלאומית)13 סייעו באפיון וקטלוג חלקים גנטיים אלה. שיטות רבות פותחו כדי להקל על הרכבה מהירה של חלקים אלה למעגלים גנטיים שימושיים14,15. תוכנה אף פותחה כדי להפוך את הרכב החלקים המאופיינים היטב לאוטומטיים למעגלים המשיגים פונקציה רצויה16. עם זאת, הרכבת מעגלים גנטיים שימושיים בעלי פונקציות צפויות נשענת על ההנחה שערכות הכלים הגנטיים מכילות חלקים גנטיים מאופיינים היטב. בשל נחיצותן של ערכות כלים אלה לקידום הביולוגיה הסינתטית, תוארו מאמצים רבים לקטלג טוב יותר מעגלים וחלקים עם נתוני אפיון מתאימים 17,18,19,20,21.

גישה אחת לאפיון רכיבים גנטיים עושה שימוש במערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS), המשחזרות תפקודים תאיים כגון שעתוק ותרגום ex vivo22. מספר מחקרים הדגימו את הפוטנציאל של CFPS ליצירת אבות-טיפוס של רכיבים גנטיים 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 בין אם ליישומים ישירים במערכות נטולות תאים ובין אם לחיזוי תפקודם של מבנים גנטיים בתאים, כגון הפעילות היחסית של חלקים בתוך ספרייה 29 אופטימיזציה של מסלול מטבולי27, ועומס תאי30., היתרונות לאב-טיפוס ב-CFPS לעומת תאים שהודגשו במחקרים אלה כוללים הימנעות משיבוט הגוזל זמן, שליטה מדויקת בריכוז הדנ”א ומרכיבי תגובה אחרים, והיכולת לערבב ולהתאים בקלות מבני דנ”א מרובים. היתרון של הימנעות משיבוט בולט במיוחד בעת שימוש בתבניות DNA ליניאריות, המאפשרות להרכיב מבנים חדשים בשיטות חוץ גופיות שאורכות שעות במקום ימים33. היכולת לתפעל את ריכוז מבני הדנ”א ורכיבים אחרים פשוט על ידי פיפטינג הופכת את הגישה לאטרקטיבית עוד יותר בכך שהיא מאפשרת ניסויים בתפוקה גבוהה המופעלים על ידי רובוטים לטיפול בנוזלים34,35. בעוד שדווחו הצלחות בשימוש ב- CFPS ליצירת אב טיפוס, חשוב לציין כי נותר לראות באילו הקשרים תוצאות CFPS יכולות לחזות באופן אמין פונקציונליות בתאים.

כאן, אנו מציגים שיטה לאב טיפוס CFPS המדגישה את היתרונות במהירות, תפוקה ועלות בהשוואה לגישות מסורתיות מבוססות תאים. הגישה נגזרת מעבודתנו הקודמת בה השתמשנו ב- CFPS כדי לאפיין במהירות ספרייה של גרסאות מקדם T7 המווסתות על ידי גורם התמלול TetR32, והרחבנו באופן משמעותי את הקומץ הקטן של גרסאות מקדם T7 מוסדרות שהיו זמינות בספרות באותה עת36,37. אחרים, מאז, הרחיבו עוד יותר את טווח המקדמים האלה38. בשיטה שלנו, הרכבת המבנה הגנטי מואצת על ידי שימוש ב- PCR כדי להגביר את ה- DNA של התבנית באמצעות פריימרים המוסיפים חלקים גנטיים שונים לגן המדווח. טיפול בנוזל אקוסטי בצלחות 384 בארות משמש להגדלת התפוקה ולהפחתת נפח החומרים הנדרשים. עבודות קודמות הדגימו שימוש מוצלח בטיפול בנוזל אקוסטי בנפחים נמוכים משמעותית39,40 עם שונות דומה לפיפטינג ידני בנפחים גדולים יותר 41. בנוסף לשיטה, אנו מספקים מידע לפתרון בעיות והערכה של חיסכון פוטנציאלי בעלויות ובזמן. שים לב שבעוד שאנו כוללים פרוטוקול לייצור ליזטים ללא תאים המבוסס על Sun et al.42 כאן, ערכות מסחריות רבות אחרות ופרוטוקולים43,44 צריכים גם לעבוד. באופן דומה, בעוד אנו מדגימים את השיטה לאפיון גרסאות מקדם32, חלקים אחרים יכולים להיות מוחלפים על ידי הגברה PCR, כגון riboregulators, Ribosome Binding Sites (RBSs), מבודדים, תגי חלבון, ו terminators. אנו מקווים כי מתודולוגיה זו תוכל לסייע לקהילת הביולוגיה הסינתטית להמשיך להגדיל את מספר החלקים המאופיינים להרכבת מעגלים גנטיים צפויים בעלי תפקוד שימושי.

Protocol

1. הכנת תמצית תאים הכנת מדיהעבור מדיה 2xYT: הוסף 16 גרם טריפטון, 10 גרם תמצית שמרים ו- 5 גרם NaCl ל- 900 מ”ל מים נטולי יונים, וכוונן את ה- pH ל- 7.0 עם 5 M NaOH. הגדל את נפח התמיסה ל -1 ליטר באמצעות מים נטולי יונים, autoclave או עיקור מסנן. לחלופין, רכוש מדיה 2xYT. עבור חיץ S30B: הכינו תמיסה של 14 mM Mg-גלוטמט, 60 mM K-גלוטמט ו-5 mM Tris ב-2 ליטר מים נטולי יונים. השתמש 2 M Tris כדי להתאים את ה- pH ל 8.2, autoclave, ולאחסן ב 4 ° C. השלם את התמיסה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 1 mM ממש לפני השימוש. הכנת תאיםפסים Escherichia coli BL21(DE3) Rosetta2 תאים או קו תאים אחר לפי בחירה (ראה Cole et al.44 לסקירה מקיפה לאחרונה) על צלחת אגר LB (מרק ליזוגני) ולדגור ב 37 ° C במשך 10-14 שעות. השתמש במושבת E. coli אחת כדי לחסן 3 מ”ל של 2xYT בינוני בצינור תרבית של 10 מ”ל. לדגור על צינור זה ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל”ד במשך 8 שעות. השתמש 50 μL מן התרבית 3 מ”ל כדי לחסן 50 מ”ל של 2xYT בינוני בבקבוק 500 מ”ל. לדגור על בקבוק זה ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל”ד במשך 8 שעות. השתמש 7.5 מ”ל מתרבית 50 מ”ל כדי לחסן כל אחד מארבעה בקבוקים 4 L מבולבל המכילים 0.75 L של תווך 2xYT. לדגור על צלוחיות אלה ב 37 ° C עם רעד ב 220 סל”ד עד שהם מגיעים לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 2 עד 4, לאחר כ 3-4 שעות. קצרו את התאים מכל בקבוק על ידי העברתם למיכלים של 1 ליטר וצנטריפוגות ב -5,000 x גרם למשך 12 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט על ידי פירוק למיכל פסולת. שטפו כל כדורית תא עם 150 מ”ל של חיץ S30B קר כקרח על ידי השעייתם מחדש לחלוטין באמצעות פיפטה כדי לשבש את מסת התא, ולאחר מכן אספו את התאים שוב על ידי צנטריפוגה במהירות של 5,000 x גרם למשך 12 דקות. השליכו את הסופרנטנט. שטפו כל כדורית תא שוב ב-40 מ”ל של חיץ S30B קר כקרח על ידי השעייתם מחדש לחלוטין ושיבוש מסת התא באמצעות פיפטה. מעבירים את התאים לצינורות חרוטיים במשקל 50 מ”ל ואוספים את התאים שוב באמצעות צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 8 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט. שוקלים את כדורי התאים הרטובים. הקפיאו במהירות הבזק את כדורי התא על ידי הכנסת הצינורות ישירות לחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C. ליזה של תאיםהפשירו את כדורי התא על קרח. השהה מחדש כל כדורית תא ב -1.4 מ”ל של חיץ S30B לכל 1 גרם של כדורית התא על ידי מערבולת. Lyse את התאים על ידי תא לחץ צרפתי ב 640 psi ב 4 °C. לאסוף את lysate צינורות microcentrifuge על קרח ולהוסיף 3 μL של 1 M DTT לכל 1 מ”ל של ליזט מיד לאחר ליזה.הערה: עדיף להקיש על שסתום ההודעה לעיתונות הצרפתית עם מוט מתכת קטן כדי לשמור על לחץ אחיד ולמנוע ירידות פתאומיות בלחץ. נקה את הליזט על ידי צנטריפוגה ב 30,000 x גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C והשליך את הגלולה לאחר pipetant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש קר כקרח, נזהר לא לשבש את הכדור. צנטריפוגה את supernatant פעם שנייה ב 30,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C. פיפטה את הסופרנאטנט שנוצר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח. השליכו את הכדור. לדגור את supernatant באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. נקה את הסופרנאטנט על ידי צנטריפוגה במהירות של 15,000 x גרם למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס והעבר את הסופרנאטנט שנוצר לצינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח, תוך זהירות לא להפריע לכדור. צנטריפוגה את הסופרנאטנט פעם שנייה ב 15,000 x גרם למשך 15 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant שנוצר לצינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח, נזהר לא לשבש שום כדור שנותר. להפיץ את supernatant ב 100 μL aliquots לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ”ל להקפיא אותם הבזק על ידי החדרה ישירות לתוך חנקן נוזלי. אחסנו את הסופרנאטנט בטמפרטורה של -80°C. 2. הכנת תבנית ליניארית עיצוב פריימרבחר רצף ליבה כתבנית PCR. כלול לכל הפחות רצף כתבים, כגון sfGFP (superfolder Green Fluorescent Protein), LacZ או אפטמר תרד. כלול חלקים אחרים שיתוקנו בין גרסאות מסומנות, כגון טרמינטורים, מקדמים או RBS, בהתאם לעיצוב.הערה: הכללת מסיים לא תמיד נדרשת לביטוי מדנ”א ליניארי במערכות נטולות תאים. עבור הפריימרים הקדמיים, בחר לפחות 20 bp התואם את הקצה 5ʹ של רצף הליבה כקצה 3ʹ של הפריימר. אם אתם מוסיפים חלקים לקצה ה-5′ של המבנה, תכננו את שארית הקצה של ה-5ʹ של הפריימר כדי להוסיף את החלקים הגנטיים שמעניינים את רצף הליבה באמצעות הגברה של PCR (איור 1A ואיור 2).הערה: מכיוון שפריימרים מעל ~60 bp עולים לעתים קרובות באופן דרמטי, ניתן לתכנן פריימרים חופפים מרובים כדי להוסיף רצפים ארוכים יותר או חלקים מרובים. בעוד שניתן להשתמש במספר פריימרים בתגובת PCR אחת, מומלץ לבצע מספר סבבי PCR. עבור פריימרים הפוכים, בחר מינימום של 20 bp כדי להתאים את הקצה 3′ של רצף הליבה כקצה 3ʹ של הפריימר. אם אתם מוסיפים חלקים לקצה ה-3′ של המבנה, תכננו את שארית הקצה של ה-5ʹ של הפריימר כדי להוסיף את החלקים הגנטיים שמעניינים את רצף הליבה באמצעות הגברה של PCR (איור 1A ואיור 2). ודא שטמפרטורת החישול של הפריימר ההפוך היא בטווח של 5°C מטמפרטורת החישול של כל הפריימר הקדמי. הגברה ליניארית של תבניתקבע את מספר תגובות ה-PCR שיש לבצע בהתבסס על מספר רצפי הליבה וחשב את הכמות של כל רכיב הנדרש באמצעות טבלה 1. הכינו את תערובת האב לפי טבלה 1 ואחסנו אותה על קרח. Aliquot 30 או 40 μL (ראה טבלה 1) של תערובת האב למספר שנקבע של צינורות PCR והוסף 10 μL של כל פריימר משתנה (כלומר, פריימרים המקודדים שינוי חלק, ראה טבלה 1) ב 5 מיקרומטר לצינורות PCR המסומנים כראוי. הכנס את צינורות ה- PCR ל- thermocycler והפעל את תוכנית ה- PCR הבאה: 98 °C למשך 3 דקות; 30 מחזורים של 98 °C עבור 15 s, XX °C עבור 20 s, 72 °C עבור YY דקות; הארכה סופית ב-72°C למשך 10 דקות. לאחר מכן, החזק את התגובה ב 4 ° C.כאשר, XX מייצג את טמפרטורת החישול עבור הפריימר עם טמפרטורת החישול הנמוכה יותר ו- YY מייצג את זמן ההארכה המחושב עבור אורך האמפליקון בהתבסס על המלצות היצרן עבור פולימראז בנאמנות גבוהה בו נעשה שימוש. מטב תנאים אלה לפי הצורך עבור פריימרים ו/או תבניות שונות. (אופציונלי) הוסף 1 μL של אנזים הגבלת DpnI כדי לעכל את התבנית המקורית. לדגור את התגובה ב 37 ° C במשך 1 שעות. בצע שלב זה רק אם התבנית המקורית היא DNA פלסמיד. לנתח 5 μL של כל מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג’ל. יש להפריד את המוצר באמצעות ג’ל אגרוז 1% במתח של 180 וולט למשך 20 דקות. בדוק את גודל הרצועה הנכון, אשר ישתנה עם רצף הליבה שנבחר ואת אורך החלקים שנוספו. טהרו את התבנית הליניארית באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית או בשיטת ניקוי ה-PCR המועדפת. אם היו מספר רצועות על ידי ניתוח אלקטרופורזה בג’ל, או לייעל את תנאי ה- PCR או לטהר את רצועות המשקל המולקולריות הנכונות באמצעות ערכת מיצוי ג’ל מסחרית בהתאם להמלצת היצרן. כמת כל תבנית DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. הערך את איכות תבנית הדנ”א על-ידי בדיקה שהיחס של 260 ננומטר/280 ננומטר הוא בערך 1.8. (אופציונלי) שוב, יש להפריד חלק מתבנית הדנ”א באמצעות ג’ל אגרוז 1% במתח של 180 וולט למשך 20 דקות ולוודא שכל הפסים הלא רצויים הוסרו במהלך טיהור התבנית. השתמש בתבניות DNA מטוהרות באופן מיידי או אחסן בטמפרטורה של -20°C. 3. הכנת חלבון מטוהר ביטוי חלבוניםכדי שכל חלבון יבוא לידי ביטוי, הרכיבו מבנה ביטוי מתאים. קודון-אופטימיזציה של הגן לביטוי בחיידק E. coli. הכנס את הגן לווקטור ביטוי pET-22b או לווקטור ביטוי מתאים אחר באמצעות שיטת הרכבת הפלסמיד המועדפת. המר את פלסמיד הביטוי לתאי ביטוי BL21(DE3) Rosetta2 או לקו תאים מתאים אחר. עבור כל חלבון, השתמש במושבה אחת כדי לחסן 3 מ”ל של מדיום LB בצינור תרבית של 10 מ”ל. לדגור על צינורות אלה ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל”ד במשך הלילה. חסן בקבוק 2 L המכיל 750 מ”ל של LB בינוני עם 1 מ”ל של תרבית לילה. יש לדגור על צלוחיות אלה בטמפרטורה של 37°C עם רעידות ב-250 סל”ד עד שהן מגיעות ל-OD600 של 0.6-1.0. השראת ביטוי חלבון על ידי הוספת 0.75 מ”ל של 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במים לכל בקבוק ולהמשיך לדגור על צלוחיות אלה ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל”ד במשך 4 שעות. קצרו את התאים מכל בקבוק, באמצעות בקבוק צנטריפוגה 1 ליטר, באמצעות צנטריפוגה במהירות של 5,000 x גרם למשך 12 דקות. השליכו את הסופרנטנט. מעבירים את הכדורים לצינור חרוטי בנפח 50 מ”ל ושוקלים כל כדור. הקפיאו במהירות הבזק את התאים בחנקן נוזלי ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C או המשיכו לשלב 3.2.הערה: 2-5 גרם תאים לכל 0.75 מ”ל צפויים לנבוע משלב זה. טיהור חלבונים על ידי כרומטוגרפיית עמודת זיקה לניקלהכן את מאגר הליזיס על ידי שילוב של 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl ו- 5 mM imidazole. כוונן ל- pH 8.0. הכינו את מאגר הכביסה על ידי שילוב של 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl ו- 25 mM imidazole. כוונן ל- pH 8.0. הכן את מאגר elution על ידי שילוב של 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl ו- 250 mM imidazole. כוונן ל- pH 8.0. הכן את מאגר הדיאליזה על ידי שילוב של 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl ו- 2% DMSO. כוונן ל- pH 7.5. הפשירו את כדורי התא על ידי הנחת הצינורות במים בטמפרטורת החדר. הוסף 5 מ”ל של חיץ הליזיס לכל 1 גרם של גלולת התא והשהה מחדש על ידי מערבולת. לייס את התאים על ידי סוניקציה. הפרד את התא homogenate כך שאין יותר מ 30 מ”ל לכל 50 מ”ל צינור חרוטי ולשמור כל צינור על קרח. לשכב את התאים באמצעות סוניקטור עם בדיקה בקוטר 0.16 ס”מ ב 15 s סיבובים עם 30 s הפסקות, 10 פעמים.הערה: הימנעו מהקצפה, שכן זה מנטרל את החלבון. ניתן למנוע היווצרות של קצף על ידי שמירה על קצה הסוניקטור לפחות 2/3 שקוע בליזט בזמן שהוא פועל. שיטות אחרות של ליזה התא מלבד סוניקציה אפשריות גם44. נקה את הליזט על ידי צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C ומניחים את supernatant לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ”ל. הוסף 1 מ”ל של שרף ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA) עבור כל 5 מ”ל של סופרנטנט. חלקו את תרחיף התא ליזט/Ni-NTA כך שלא יהיה יותר מ-36 מ”ל לכל צינור חרוטי של 50 מ”ל. יש לדגור ב-4°C על מסובב צינור ב-10 סל”ד למשך שעה. לטעון את השרף על ידי decanting התא lysate/Ni-NTA slurry לתוך עמודת כרומטוגרפיה נפח מיטה 2 מ”ל ולאסוף את eluant במידת הצורך לניתוח נוסף, אחרת, להשליך. שטפו את השרף עם 10 נפחי מצע שרף של חיץ כביסה. אספו את החלבון על ידי הוספת שלושה נפחי מצע שרף של חיץ אלוציה לעמודה, ורכזו את הנפח ל-1.5 מ”ל באמצעות רכז צנטריפוגלי עם קרום חיתוך המשקל המולקולרי המתאים לכל חלבון. נטרל את החלבון כנגד 2 ליטר של חיץ דיאליזה ב 4 ° C למשך שעה אחת. יש לנטרל את החלבון שוב כנגד 2 ליטר של חיץ דיאליזה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. כמת את החלבון באמצעות מקדם ההכחדה המולרי שלו והספיגה שלו ב-280 ננומטר. נתח את החלבון לטוהר על ידי הפרדתו באמצעות נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג’ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE). אחסנו את החלבון בטמפרטורה של -80°C. 4. סינתזת חלבון ללא תאים הכנת תערובת תגובת CFPSהכן את תערובת התוספים על ידי ביצוע שלבי הכנת תמיסת חומצות אמינו, הכנת תמיסת אנרגיה והכנת חיץ ב- Sun et al.42. יש לאחסן בנפרד או בשילוב בטמפרטורה של -80°C ב- aliquots. ודא שהריכוזים הסופיים תואמים לאלה המתוארים ב- Sun et al.42 בסעיף ביצוע ניסויי של תגובת TX-TL. הכינו תוסף להגנה על דנ”א ליניארי מפני התפרקות. אם אתה משתמש ב-GamS33,45, עליך להתכונן באמצעות השלבים בסעיף 3 לעיל, או להשיג מספק מסחרי; לגישות אחרות, עיין בספרות המקבילה46,47,48. לחלופין, השתמש במערכת CFPS שאינה דורשת תוספים49. הכינו פולימראז T7, חלבונים מדכאים ותוספים אחרים באמצעות השלבים בסעיף 3 לעיל או השיגו מספק מסחרי. קבע את מספר תגובות CFPS שיש לבצע וחשב את הכמות של כל רכיב נדרש באמצעות טבלה 2. לשנות את ריכוזי הרכיבים, כולל הוספה או הסרה של רכיבים לפי הצורך, ולהתאים את כמות המים כך שהנפח הסופי של כל תערובת תגובה יהיה תמיד 10 μL. באופן דומה, שנה את תערובת האב כדי להקל על ניפוק רכיבים אחרים על ידי טיפול בנוזל אקוסטי לפי הצורך (ראה סעיף הדיון ). הפשירו את כל הרכיבים על קרח והכינו תערובת ראשית על ידי ערבוב כל רכיב כפי שחושב לעיל. מערבבים את כל המרכיבים ביסודיות על ידי פיפטה. שימו לב היטב כדי למנוע משקעים, במיוחד עבור תערובת חומצות אמינו. שומרים את תערובת האב על קרח. מצננים צלחת של 384 בארות על קרח ומפזרים את תערובת האב ב-9 מיקרוליטר אליציטוטים לכל באר.הערה: ניתן להפיץ רכיבים אלה באמצעות טיפול בנוזלים אקוסטיים, אם כי יש להקפיד על ניפוק נאות (עיין בסעיף דיון לפתרון בעיות). פיזור רכיבים נוספים על ידי טיפול בנוזל אקוסטיחשב את כמות חלבון המדכא (ורכיבים אופציונליים אחרים) הדרושים לכל תגובות CFPS. הפשירו את חלבון המדכא על קרח והפיצו אותו לצלחת מקור לטיפול בנוזל אקוסטי או לצלחת מתאימה אחרת. ודא שכמות הנפח המת המתאימה הנדרשת לסוג לוחית המקור שבה נעשה שימוש כלולה. פזרו את חלבון המדכא בנפחים של 1 μL לבארות המתאימות באמצעות המטפל בנוזל. לקבלת מידע נוסף אודות פתרון בעיות הפצה, עיין בסעיף דיון . עקומות סטנדרטיותכלול דילול סדרתי של המדווח המטוהר (ראה סעיף 3 לטיהור חלבונים)41 או תקן כימי מתאים50 על הצלחת כדי לאפשר השוואת תוצאות עם מחקרים אחרים ומעבדות אחרות. בחר טווח ריכוזים המתאים לכתב המשמש וטווח הביטוי הצפוי של הניסויים. הפעלת תגובות CFPSמחממים מראש את קורא הצלחות ל-30°C. הגדר את קורא הלוחות לקריאה בהגדרות המתאימות לכתב המשמש ברצף הליבה מבלי לטלטל את השלבים.הערה: בעוד 30 ° C משמש כאן, 29 ° C ו 37 ° C משמשים גם נפוץ לעבוד היטב עם פרוטוקול זה. טמפרטורות אחרות עשויות להיות מועדפות עבור תכשירים חלופיים לתגובה ללא תאים. עבור מרווחי קריאה, 10 דקות מספיקות כדי להשיג רזולוציה טובה עבור הנתונים המייצגים המוצגים כאן; עם זאת, רזולוציות אחרות עשויות להיות טובות יותר בהתאם לחלבון הכתב ולמתכון CFPS המסוים. (אופציונלי) הפעל תחילה תגובת בדיקה כדי להגדיר את הגדרת הרווח או הרגישות המתאימה כדי ללכוד את השינוי בפלואורסצנטיות ללא גלישת אות. אטמו את הצלחת בעלת 384 הקידוחים במכסה פלסטיק אטום אטום למניעת אידוי. במידת האפשר, במכשיר יש להגדיר שיפוע טמפרטורה אנכי של 1°C כדי להגביל את העיבוי על האטם. הניחו את הצלחת בעלת 384 הבארות על מחזיק הצלחת והתחילו לקרוא.

Representative Results

כדי להדגים את התועלת של השיטות שלנו, אנו מציגים תוצאות המתארות את ההשפעות של הקרבה של רצף tetO למקדם T7 על ויסות ביטוי מונע RNAP T7. את התוצאות המלאות ואת השלכותיהן ניתן למצוא בעבודתם של McManus et al.32. זרימת העבודה מתוארת באיור 1. חמש עשרה תבניות ליניאריות, הנבדלות רק במרחק של מקדם T7 ביחס לרצף tetO , הוכנו על ידי הגברה של PCR לכתב sfGFP עם פריימרים שנועדו להוסיף כל וריאנט מקדם (איור 2) כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. רכיבי התגובה והתגובות של CFPS הוכנו בהתאם לפרוטוקול. הביטוי של sfGFP נמדד מכל תבנית עם טיטרציה של 12 ריכוזים שונים של חלבון TetR, במשולש, באמצעות מטפל בנוזל אקוסטי. ב-36 תגובות CFPS לכל תבנית ו-15 תבניות, בוצעו בסך הכל 540 תגובות לכל קבוצת צירופי T7-teto. ההערכה כולה בוצעה על שתי צלחות בשני קוראי צלחות. ניתוח נתונים אלה הראה כי T7 RNAP מווסת כלפי מטה ביטוי מונחה T7 באופן שווה עד 13 bp במורד הזרם מתחילת תעתיק T7 (איור 3). לתוצאה זו יש השלכות על התכנון העתידי של מעגלי גנים המונעים על ידי T7 הניתנים לוויסות על ידי תיאור חלון משוער לדיכוי יעיל של T7 על ידי מדכאים אחרים. השוואת תוצאות הפרוטוקול המתואר כאן עם דנ”א שהוכן על ידי שיבוט מסורתי חשפה הבדל קטן אך מובהק סטטיסטית במידת הדיכוי TetR בין פורמטים. שיערנו שקשירה לא ספציפית של TetR לדנ”א הווקטורי יכולה להסביר את ההבדל שנצפה. תוצאות הניסוי הראו כי הוספת דנ”א וקטורי ליניארי לתגובות עם דנ”א תבנית ליניארית הפחיתה את ההבדל למובהקות לא סטטיסטית, אם כי היא לא שללה תרומות מגורמים אחרים, כגון הבדלים במחזוריות של סליל הדנ”א עבור תבניות ליניאריות לעומת מעגליות, אשר בתורן יכולות להשפיע על קשירת TetR. בהתאם ליישום, השימוש בתבנית ליניארית עשוי לדרוש אימות נוסף. אנו כוללים גם נתונים מייצגים על בעיות פוטנציאליות עם ניפוק מדויק באמצעות טיפול בנוזלים אקוסטיים (איור 4). תמיסה של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS), pH 7.4 המכיל 0.25 mM צבע טרטרזין שימש להערכת שתי שיטות של תכנות מטפל נוזל אקוסטי כדי לחלק נפחים >1 μL. לאחר ניפוק נוזלים, לוחית היעד נאטמה וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך דקה אחת, והספיגה ב-425 ננומטר נמדדה באמצעות קורא לוחות. תוצאות מייצגות של תשעה ניסויים מוצגות ומדגימות חלוקה עקבית יותר על פני סדרה של שמונה בארות יעד כאשר העברת 5 μL מחולקת לחלוקה נפרדת של 1 μL. בהתבסס על תצפיות אלה, מומלץ לפרק העברות >1 μL להעברות מרובות של ≤1 μL. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים על פתרון בעיות בהיבט חשוב זה של הפרוטוקול. איור 1: זרימת עבודה חד-יומית להערכת חלקי מקדם בתמצית נטולת תאים. (A) כתב מוגבר PCR באמצעות פריימרים המכילים חלקים גנטיים להערכה (2-5 שעות). (B) תערובת התגובה נטולת התאים מוכנה כמפורט בפרוטוקול ומופצת לצלחת של 384 בארות עם תבניות מוגברות PCR (30 דקות). (C) טיפול בנוזל אקוסטי משמש לפיזור רכיבים נוספים, שיכולים לכלול חלבונים מדכאים, מולקולות אפקטור, וכל אפקט מותנה אחר (10 דקות). (D) ביטוי חלבון הכתב מכל תגובה נמדד בקורא צלחות (2-16 שעות, תלוי במתכון ובמבנה של CFPS). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תכנון פריימר להוספת חלקים גנטיים לגן מדווח על-ידי הגברה של PCR. (A) הגן sfGFP reporter (ירוק) יוגבר כדי להוסיף RBS (אדום) ומקדם T7 (כחול) על ידי PCR. (B) sfGFP (ירוק) ו-RBS (אדום) יוגברו כדי להוסיף רצף tetO (זהב) ומקדם T7 (כחול) על ידי PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ההשפעה של מיקום tetO על ויסות ביטוי מונחה T7. ערכי דיכוי מרביים מנורמלים עבור תבנית ליניארית ומעגלית כפונקציה של מיקום teto. עקבות מייצגות את הממוצע וסטיות התקן עבור שלושה עותקים משוכפלים. נתון זה שונה מ- McManus et al.32 תחת רישיון Creative Commons CC-BY. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: שימוש בצבע טרטרזין כדי לאמת ניפוק נוזלים עם מטפל בנוזל אקוסטי. פסים שחורים מציינים ניפוק של 5 μL של תמיסת טרטרזין ממקור יחיד לתוך כל אחת משמונה בארות היעד העוקבות של לוח 384 בארות באמצעות פקודת תכנות יחידה. פסים אפורים מציינים ניפוק של 1 μL ממקור יחיד לתוך כל אחת משמונה בארות יעד רצופות באמצעות פקודת תכנות יחידה, ולאחר מכן חזרה על שלב זה ארבע פעמים עבור סך של 5 μL שניתנו בכל באר יעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. שם רכיב נפח עבור תגובה אחת (μL) נפח עבור 110% ממספר X התגובות (μL) Q5 PCR Premix 25 מים 4 תבנית (1–3 ng/μL) 1 (אם קבוע1) פריימר קדמי (5 מיקרומטר) 0 או 10 (אם קבוע1) פריימר הפוך (5 מיקרומטר) 0 או 10 סה”כ מיקס מאסטר: 30 או 40 (אם משתנה1) פריימר קדמי (5 מיקרומטר) 0 או 10 (אם משתנה1) פריימר הפוך (5 מיקרומטר) 0 או 10 טבלה 1: דף עבודה להכנת ריאגנטים לתגובות PCR. ערכים בעמודה השמאלית ביותר ניתנים למילוי על-ידי משתמשים בהתאם למספר התגובות המיועד. 1 פריימרים משתנים מכילים חלק מסוים שיש להוסיף בתגובת PCR ויכולים להיות פריימר קדמי, פריימר הפוך או שניהם. פריימרים קבועים אינם מוסיפים חלק ויכולים להיות פריימר קדמי או פריימר הפוך, אך לא שניהם. שם רכיב נפח עבור תגובה אחת (μL) נפח עבור 110% ממספר X התגובות (μL) תמצית תאים 4.2 תמהיל תוספים 3.3 חלבון GamS (207 מיקרומטר) 0.15 תבנית DNA (20 ננומטר) 1 T7 פולימראז (13 מ”ג/מ”ל) 0.12 מים 0.73 (מספר זה עשוי להשתנות) סה”כ מיקס מאסטר: 9 חלבון מדכא: 1 טבלה 2: גליון עבודה להכנת ריאגנטים לתגובות CFPS. ערכים בעמודה השמאלית ביותר ניתנים למילוי על-ידי משתמשים בהתאם למספר התגובות המיועד. טבלה משלימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן מספקים אמצעי חסכוני ומהיר לסינון חלקים גנטיים באמצעות ביטוי של חלבון עיתונאי על ידי CFPS. חלקים גנטיים מאופיינים היטב חיוניים לתכנון מעגלים גנטיים צפויים עם תפקוד שימושי. מתודולוגיה זו מגדילה את התפוקה ומקטינה את הזמן הדרוש לסינון חלקים גנטיים חדשים על ידי הסרת הדרישה לעבוד בתאים חיים, תוך שמירה על פונקציונליות המשקפת את הסביבה התאית על ידי שמירה על התהליך המטבולי של ביטוי חלבונים בליזט התא. ניתן לבצע את הפרוטוקול שלנו תוך יום אחד לאחר קבלת פריימרים (~ 2.5-6 שעות להכנת תגובה, 2-16 שעות לתגובת CFPS; איור 1), בהשוואה ל-3 ימים לפחות עבור שיבוט מסורתי (יום אחד כל אחד לבנייה, הרכבה וטרנספורמציה, אימות רצף של שיבוטים ותרבית תאים לצורך הערכה). אנו מעריכים עוד כי העלות למבנה המשתמש בדנ”א ליניארי היא בערך שליש מהשיבוט המסורתי (78 דולר לעומת 237 דולר; טבלה משלימה 1) שיטות. שירותי סינתזה מסחריים מציעים כיום מינימום של 4 ימי עסקים בהתאם לגודל, אם כי יהיו להם עלויות דומות לשיטה שלנו אם מקטעים ליניאריים יוקרנו ישירות ב- CFPS ($78 לעומת $91); לא אימתנו גישה זו. עלות הערכת חלק עם CFPS קטנה בהשוואה ליצירת DNA של התבנית ($0.05/reaction22 לעומת $78 לתבנית), אם כי יש לציין כי עלויות ההפעלה עבור ריאגנטים בתפזורת וציוד ליזיס הן לפחות כמה אלפי דולרים. השימוש במטפל אקוסטי בנוזלים משפר את העלויות רק באופן שולי בכך שהוא מאפשר נפחים קטנים יותר עד 0.5 μL40; היתרון המשמעותי יותר הוא קיצור הזמן להכנת תגובות (~10 דקות לעומת עד שעה, תלוי במספר התגובות), במיוחד כאשר הכנת מספר רב של תגובות מעלה חשש לתגובה מוכנה שיושבת זמן ממושך לפני הדגירה.

למרות שהוא מהיר וחסכוני, עדיין לא ניתן לראות את המגבלות על מתי אב טיפוס CFPS מנבא כראוי את תפקוד in vivo . לדוגמה, כל תגובתיות צולבת עם DNA גנומי לא תזוהה עקב הסרת הגנום המארח במהלך הייצור של מערכת CFPS. כמו כן, ריכוזי רכיבים יכולים להיות נמוכים ב-1-2 סדרי גודל ב-CFPS מאשר בתאים51, מה שעשוי להשפיע על ההתנהגות של חלקים מסוימים כתוצאה מתנאי צפיפות מקרומולקולריים שונים. יתר על כן, היכולת של דנ”א ליניארי לחזות תפקוד in vivo עשויה להיות מוגבלת, למשל, כאשר המבנה המשני של הדנ”א משחק תפקיד חשוב. מגבלה אחרונה היא שמבנים אינם מאומתים ברצף לפני בדיקת פונקציות. ייתכנו מקרים בהם החלק המאופיין אינו מיושר בפועל עם הרצף התיאורטי המיועד. ניתן להקל על כל המגבלות הללו על ידי אימות קבוצת משנה של החלקים שנסקרו בשיטה זו ביישום in vivo המיועד.

במקור פיתחנו מתודולוגיה זו כדי לחקור את ההשפעות של שינוי מיקום המפעיל על מקדמי T7-tetO היברידיים32. הצגנו את הפרוטוקולים כאן בפורמט גנרי יותר, כך שניתן יהיה ליישם אותם על מקדמים, אופרטורים, רצפי קשירת ריבוזומים, מבודדים וטרמינטורים. ניתן להוסיף חלקים גנטיים אלה לקצה 5ʹ או 3ʹ של גן המדווח על ידי PCR באמצעות פריימרים לכל עיצוב, ובכך לייתר את הצורך בסינתזה או שיבוט של כל וריאנט לבדיקה. תוצרי ה-PCR המתקבלים משמשים כתבנית DNA להערכה באמצעות ביטוי של חלבון מדווח. בעבודתנו, פרוטוקול טיהור הזיקה המסופק כאן שימש עבור TetR ו- GamS. אותו הליך יכול לשמש לביטוי וטיהור של מדכאים אחרים, אקטיבטורים, פולימראזות, גורמי סיגמא וחלבונים אחרים התואמים לחלק גנטי מעניין, אם כי ייתכן שיהיה צורך בשינויים עבור החלבון הרצוי המתבטא. טיהור וטיטרציה של חלבונים אלה לתגובות CFPS מאפשר אפיון מפורט יותר של חלק גנטי מסוים. לבסוף, קיימים פרוטוקולי CFPS חלופיים רבים וכל אחד מהם צריך להיות מקובל על החלק של סינון החלקים של המתודולוגיה. לדוגמה, איננו כוללים שלב דיאליזה בפרוטוקול זה, שאחרים מצאו כחשוב לביטוי ממקדמי חיידקים מקומיים22. שינוי הריכוזים של המרכיבים הבסיסיים של CFPS אפשרי גם כן. השימוש בטיפול בנוזלים משפר את היכולת לבדוק את התנאים הרבים על ידי הגדלת התפוקה והקטנת החומרים הדרושים34,35.

תחום אחד שיכול לדרוש פתרון בעיות משמעותי הוא אופטימיזציה של המטפל בנוזלים אקוסטיים. יש למטב את ניפוק המטפל בנוזלים אקוסטיים עבור כל רכיב מועבר ומומלץ מאוד להפעיל בקרות כדי לוודא פיזור ושחזור נאותים לפני איסוף הנתונים. סוג צלחת המקור האידיאלי והגדרת מחלקת הנוזל יהיו תלויים בנוזל הספציפי שיש לחלק ובמרכיביו. לא מומלץ להשתמש בלוחות מצופים אמין כדי לחלק DNA, מכיוון שציפוי האמין עשוי לתקשר עם ה- DNA. כמו כן יש לציין כי היכולת לחלק ריכוזים גבוהים יותר של רכיבים מסוימים עשויה להיות תלויה במודל המטפל בנוזלים אקוסטיים. ניתן לבצע בדיקת העברת נוזלים על ידי ניפוק על אטם צלחת נייר כסף כדי לדמיין היווצרות טיפות מוצלחת; עם זאת, בדיקה זו מספקת מידע מוגבל וטיפות מהגדרות שונות עשויות להיראות זהות. ניתן להשתמש בצבע מסיס במים, כגון טרטרזין, כדי לוודא בצורה מדויקת יותר שהנפח הנכון נמסר מהגדרה או זרימת עבודה נתונה (ראה תוצאות מייצגות). תכנות אופטימלי של העברות נוזלים יכול גם להשפיע על הדיוק והעקביות של הנתונים שנוצרו; עבור העברות >1 μL מבאר מקור אחת לבאר יעד אחת, מצאנו שיש לתכנת העברות רציפות של ≤1 μL כדי להפחית את השונות השיטתית מבאר לבאר (איור 4). לבסוף, נפחי באר מתים תיאורטיים וממשיים יכולים להשתנות באופן דרמטי בהתאם לסוג לוחית המקור, הגדרת מחלקת הנוזל ורכיבי הנוזל הספציפי; שימוש בפונקציית Acoustic Liquid Handler Survey כדי להעריך את נפחי הבאר לפני הפעלת תוכנית עשוי לעזור לאמוד את מידת הדיוק שבה המכשיר מסוגל למדוד נוזל מסוים.

ביצועי תגובת CFPS עשויים להשתנות בעת השוואת תוצאות בין משתמשים שונים, אצוות חומרים, קוראי לוחות ומעבדות41. במקרים שבהם נדרשות השוואות כאלה בעת יצירת אב-טיפוס של מעגלים גנטיים, אנו ממליצים לכלול תגובות בקרה פנימיות עם מקדמים מכוננים סטנדרטיים בכל לוחית תגובה כדי לסייע בנרמול התוצאות בין מערכי ניסוי. שיטת הכנת הדנ”א יכולה גם לתרום במידה רבה לפעילות CFPS; מומלץ לכלול שלב משקעים אתנול. בנוסף, הרכב התגובה האופטימלי יכול להשתנות על ידי אצווה של תמצית34. בפרט, הודגם כי ריכוזי מגנזיום גלוטמט ואשלגן גלוטמט אופטימליים משתנים לפי אצווה42 או לפי חלבון מקדם או מדווח המשמש24. ריכוזים של רכיבים אלה צריכים להיות אופטימליים על ידי סינון על פני מספר ריכוזים של כל רכיב לכל מבנה גנטי ולכל הכנת תמצית התא כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לביטוי חלבון. לבסוף, שיטות עבודה מומלצות לביצועי תגובת CFPS עקביים כוללות ערבוב יסודי, פיפטינג זהיר ועקביות בהכנה של כל רכיב מגיב.

מעבר לאפיון חלקים בודדים, ניתן להשתמש באותה שיטה כדי לסנן שילובים של חלקים היוצרים מעגלים מורכבים, כגון מעגלים לוגיים16 או מתנדים52,53. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לסינון ואופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים ליישומים באבחון אפידמיולוגי 54,55,56,57 או זיהוי וכימות סיכונים 3,58,59. היישום של טכניקות מונחות בינה מלאכותית כגון למידה פעילה34 יכול גם להיות משולב עם אופי התפוקה הגבוהה של שיטה זו כדי להניע חקירה מהירה של מרחבי תכנון ביולוגיים מורכבים. בסופו של דבר, אנו רואים גישה זו תומכת בזמני פיתוח מואצים עבור עיצובים גנטיים חדשים בביולוגיה סינתטית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו התאפשרה הודות לתוכנית המחקר היישומי לקידום סדרי עדיפויות במדע וטכנולוגיה של משרד מזכיר ההגנה. אנו מודים לסקוט וולפר (מעבדת המחקר הימית) על אספקת מלאי sfGFP בשימוש, ולזאכרי סאן והבל צ’יאו (Tierra Biosciences) על דיונים פוריים הקשורים לאב-טיפוס עם מערכות נטולות תאים ולפתרון בעיות הקשורות לטיפול בנוזלים אקוסטיים.

Materials

2x YT medium Sigma-Aldrich Y2377-250G Alternative to making 2xYT media
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01 S30 Buffer B
Agar Bacto 214010 For plating cells
Chromatography column (5 cm diameter) BIO-RAD 731-1550 Used for protein purification.
Destination plate Thermo Scientific Nunc plate 142761 For CFPS reactions
DMSO Sigma-Aldrich D2650 For dialysis buffer
DpnI NEB R0176L For digestion of plasmid templates
DTT Roche 20871723 S30 Buffer B
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 Novagen 70954 Cell line used for production of lysate and purified proteins
Echo acoustic liquid handler Labcyte 525 Acoustic liquid handler
French pressure cell Thermo Spectronic FA-078 For lysing cells for CFPS
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 For buffers
Impermeable plastic sealable lid Thermo 232702 Plate seal
IPTG RPI I56000-25.0 Used for protein induction.
K-Glu Sigma-Aldrich g1501-500G S30 Buffer B
Labcyte Echo source plate Labcyte PL-05525 For use with Echo acoustic liquid handler
Mg-Glu Sigma-Aldrich 49605-250G S30 Buffer B
NaCl Sigma-Aldrich S7653-250G For buffers
NaHPO4 Sigma-Aldrich 71505 For dialysis buffer
NaOH Mallinckrodt Chemicals 7708-10 For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899
Ni-NTA resin Invitrogen R901-15 For production of purified proteins
PCR H2O Ambion AM9937 PCR of linear templates
Plate Reader BioTek H10 Plate reader used
Q5 PCR Master Mix NEB M0494S PCR of linear templates
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28606 PCR of linear templates
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR of linear templates
QSonica Ultrasonic Processor Qsonica Q700 Cell disruption during protein purification
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801 Updated supplier from Sun et al.
Tris MP 819623 S30 Buffer B
Tris-Cl Sigma-Aldrich T5941 For buffers
Tryptone Fluka T7293 For making 2xYT media
Yeast Extract Bacto 212750 For making 2xYT media
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Saltepe, B., Kehribar, E. &. #. 3. 5. 0. ;., Su Yirmibeşoǧlu, S. S., Şafak Şeker, U. &. #. 2. 1. 4. ;. Cellular biosensors with engineered genetic circuits. ACS Sensors. 3 (1), 13-26 (2018).
  3. Bereza-Malcolm, L. T., Mann, G., Franks, A. E. Environmental sensing of heavy metals through whole cell microbial biosensors: A synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 4 (5), 535-546 (2015).
  4. Mimee, M., et al. An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health. Science. 360 (6391), 915-918 (2018).
  5. Isabella, V. M., et al. Development of a synthetic live bacterial therapeutic for the human metabolic disease phenylketonuria. Nature Biotechnology. 36 (9), 857-867 (2018).
  6. Healy, C. P., Deans, T. L. Genetic circuits to engineer tissues with alternative functions. Journal of Biological Engineering. 13, 39 (2019).
  7. Kaushik, A., Tiwari, S., Dev Jayant, R., Marty, A., Nair, M. Towards detection and diagnosis of Ebola virus disease at point-of-care. Biosensors and Bioelectronics. 75, 254-272 (2016).
  8. Jagadevan, S., et al. Recent developments in synthetic biology and metabolic engineering in microalgae towards biofuel production. Biotechnology for Biofuels. 11, 185 (2018).
  9. Keating, K. W., Young, E. M. Synthetic biology for bio-derived structural materials. Current Opinion in Chemical Engineering. 24, 107-114 (2019).
  10. Smanski, M. J., et al. Synthetic biology to access and expand nature’s chemical diversity. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 135-149 (2016).
  11. Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
  12. Galdzicki, M., Rodriguez, C., Chandran, D., Sauro, H. M., Gennari, J. H. Standard biological parts knowledgebase. PLoS One. 6 (2), 17005 (2011).
  13. Kelwick, R., Bowater, L., Yeoman, K. H., Bowater, R. P. Promoting microbiology education through the iGEM synthetic biology competition. FEMS Microbiology Letters. 362 (16), (2015).
  14. Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nature Protocols. 9 (9), 2075-2089 (2014).
  15. Halleran, A. D., Swaminathan, A., Murray, R. M. Single day construction of multigene circuits with 3G assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1477-1480 (2018).
  16. Nielsen, A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), (2016).
  17. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nature Biotechnology. 26 (7), 787-793 (2008).
  18. Boehm, C. R., Bock, R. Recent advances and current challenges in synthetic biology of the plastid genetic system and metabolism. Plant Physiology. 179 (3), 794-802 (2019).
  19. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  20. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: New mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  21. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  22. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat. Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  25. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  26. Kelwick, R., et al. Cell-free prototyping strategies for enhancing the sustainable production of polyhydroxyalkanoates bioplastics. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  27. Karim, A. S., et al. In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes for cell design. Nature Chemical Biology. 16 (8), 912-919 (2020).
  28. Takahashi, M. K., et al. Rapidly characterizing the fast dynamics of RNA genetic circuitry with cell-free Transcription-Translation (TX-TL) systems. ACS Synthetic Biology. 4 (5), 503-515 (2015).
  29. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  30. Borkowski, O., et al. Cell-free prediction of protein expression costs for growing cells. Nature Communications. 9 (1), 1457 (2018).
  31. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Nash, C. J., Jewett, M. C. In vitro prototyping of limonene biosynthesis using cell-free protein synthesis. Metabolic Engineering. 61, 251-260 (2020).
  32. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  33. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  34. Borkowski, O., et al. Large scale active-learning-guided exploration for in vitro protein production optimization. Nature Communications. 11 (1), 1872 (2020).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS One. 8 (10), 78442 (2013).
  37. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40 (8), 3763-3774 (2012).
  38. Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
  39. Bailey, J., Eggenstein, E., Lesnick, J. Miniaturization and rapid processing of TXTL reactions using acoustic liquid handling. Labcyte Technical Note. , 1-12 (2018).
  40. Marshall, R., Garamella, J., Noireaux, V., Pierson, A. High-throughput microliter-sized cell-free transcription-translation reactions for synthetic biology applications using the echo 550 liquid handler. Labcyte Application Note. , 1-6 (2018).
  41. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  42. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  43. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  44. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  45. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  46. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  47. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  48. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  49. Tuckey, C., Asahara, H., Zhou, Y., Chong, S. Protein synthesis using a reconstituted cell-free system. Current Protocols in Molecular Biology. 108, 1-22 (2014).
  50. Hoffman, R. A., Wang, L., Bigos, M., Nolan, J. P. NIST/ISAC standardization study: Variability in assignment of intensity values to fluorescence standard beads and in cross calibration of standard beads to hard dyed beads. Cytometry. Part A. 81 (9), 785-796 (2012).
  51. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  52. Rossi, N. A., Dunlop, M. J. Making waves with synthetic oscillators. Cell Systems. 6 (4), 406-407 (2018).
  53. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 09771 (2015).
  54. Chang, H., Voyvodic, P. L., Structurale, C. D. B. Microbially derived biosensors for diagnosis, monitoring and epidemiology. Microbial Biotechnology. 10 (5), 1031-1035 (2017).
  55. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  56. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  57. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  58. Liu, X., Germaine, K. J., Ryan, D., Dowling, D. N. Whole-cell fluorescent biosensors for bioavailability and biodegradation of polychlorinated biphenyls. Sensors. 10 (2), 1377-1398 (2010).
  59. Gautam, P., Suniti, S., Amrita, K., Madathil, D., Nair, B. A Review on Recent Advances in Biosensors for Detection of Water Contamination. International Journal of Environmental Sciences. 2 (3), 1565-1574 (2012).

Tags

Cell-free Expression SystemsGenetic Part CharacterizationPCRRapid PrototypingDNA Template PurificationMaster Mix PreparationCell-free Expression Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McManus, J. B., Bernhards, C. B., Sharpes, C. E., Garcia, D. C., Cole, S. D., Murray, R. M., Emanuel, P. A., Lux, M. W. Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (174), e62816, doi:10.3791/62816 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image