JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

التوصيف السريع للأجزاء الجينية بأنظمة خالية من الخلايا

Published: August 30, 2021
doi:
10.3791/62816
, , , , , , ,
1US Army Combat Capabilities Development Command Army Research Laboratory, 2Biology and Biological Engineering,California Institute of Technology, 3Excet, Inc., 4US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center

Summary

الأجزاء الجينية ذات المواصفات الجيدة ضرورية لتصميم دوائر وراثية جديدة. هنا نصف طريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية لتوصيف الأجزاء الجينية بسرعة. تقلل طريقتنا من التكلفة والوقت من خلال الجمع بين المحللات الخالية من الخلايا ، والحمض النووي الخطي لتجنب الاستنساخ ، ومعالجة السوائل الصوتية لزيادة الإنتاجية وتقليل أحجام التفاعل.

Abstract

يعد توصيف الأجزاء الجينية وفهرستها أمرا بالغ الأهمية لتصميم الدوائر الجينية المفيدة. يسمح وجود أجزاء مميزة جيدا بضبط الدوائر الجينية ، بحيث تؤدي وظيفتها إلى نتائج يمكن التنبؤ بها. مع نمو البيولوجيا التركيبية كمجال ، كان هناك انفجار في الدوائر الجينية التي تم تنفيذها في الميكروبات لتنفيذ الوظائف المتعلقة بالاستشعار والتغيير الأيضي والحوسبة الخلوية. هنا ، نعرض طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوصيف الأجزاء الجينية. تستخدم طريقتنا محللة خالية من الخلايا ، يتم إعدادها داخليا كوسيلة لتقييم الأجزاء عن طريق التعبير عن بروتين المراسل. يتم تحضير قالب الحمض النووي عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية غير مكلفة لإضافة أجزاء مختلفة إلى جين المراسل ، ويضاف القالب إلى التفاعل كحمض نووي خطي بدون استنساخ. تشمل الأجزاء التي يمكن إضافتها بهذه الطريقة المروجين والمشغلين ومواقع ربط الريبوسوم والعوازل والنهايات. يسمح هذا النهج ، جنبا إلى جنب مع دمج معالج سائل صوتي وألواح 384 بئر ، للمستخدم بإجراء تقييمات عالية الإنتاجية للأجزاء الجينية في يوم واحد. وبالمقارنة، تتطلب نهج الفحص القائم على الخلايا استنساخا مستهلكا للوقت ولها أوقات اختبار أطول بسبب خطوات تطبيع الثقافة وكثافة الثقافة بين عشية وضحاها. علاوة على ذلك ، فإن العمل في المحللة الخالية من الخلايا يسمح للمستخدم بالتحكم بشكل أكثر إحكاما في ظروف التعبير من خلال إضافة مكونات خارجية وحمض نووي بتركيزات دقيقة. يمكن استخدام النتائج التي تم الحصول عليها من الفحص الخالي من الخلايا مباشرة في تطبيقات الأنظمة الخالية من الخلايا أو ، في بعض الحالات ، كطريقة للتنبؤ بالوظيفة في الخلايا بأكملها.

Introduction

يتمثل أحد الجهود الأساسية للبيولوجيا التركيبية في تطوير مجموعات أدوات وراثية تحتوي على أجزاء جيدة التوصيف ، والتي يمكن استخدامها لبناء دوائر وراثية1 تؤدي وظائف مفيدة عند نشرها في الميكروبات أو المحللات الخالية من الخلايا. المجالات التي اكتسبت فيها هذه الدوائر الجينية قوة جذب هي استشعار2،3،4 ، والأداء البشري5،6 ، والوقود الحيوي7،8 ، وإنتاج المواد9،10 ، والحوسبة الخلوية 11. تم إنشاء سجلات للأجزاء الجينية الموحدة12 لفهرسة الأجزاء الجديدة والحالية في فئات مثل المروجين والمشغلين وتسلسلات الترميز والإنهاءات ، على سبيل المثال لا الحصر. كانت الجهود المبذولة مثل iGEM (الآلات الدولية المهندسة وراثيا)13 مفيدة في توصيف وفهرسة هذه الأجزاء الجينية. تم تطوير العديد من الطرق لتسهيل التجميع السريع لهذه الأجزاء في دوائر وراثية مفيدة14,15. تم تطوير برنامج حتى لأتمتة تكوين الأجزاء ذات المواصفات الجيدة في دوائر تحقق الوظيفة المطلوبة16. ومع ذلك ، فإن تجميع الدوائر الجينية المفيدة ذات الوظائف التي يمكن التنبؤ بها يعتمد على افتراض أن مجموعات الأدوات الجينية تحتوي على أجزاء وراثية جيدة التوصيف. نظرا لضرورة مجموعات الأدوات هذه نحو النهوض بالبيولوجيا التركيبية ، تم وصف العديد من الجهود لتحسين فهرسة الدوائر والأجزاء ببيانات التوصيف المناسبة17،18،19،20،21.

يستخدم أحد الأساليب لتوصيف المكونات الجينية أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) ، والتي تعيد تكوين الوظائف الخلوية مثل النسخ والترجمة خارج الجسم الحي22. أظهرت العديد من الدراسات إمكانات CFPS للمكونات الجينية الأولية 23،24،25،26،27،28،29،30،31،32 سواء للتطبيقات المباشرة في الأنظمة الخالية من الخلايا أو للتنبؤ بوظيفة التركيبات الجينية في الخلايا ، مثل النشاط النسبي للأجزاء داخل المكتبة 29 ، وتحسين المسار الأيضي27 ، والعبء الخلوي30. تشمل مزايا النماذج الأولية في CFPS مقابل الخلايا التي أبرزتها هذه الدراسات تجنب الاستنساخ الذي يستغرق وقتا طويلا ، والتحكم الدقيق في تركيز الحمض النووي ومكونات التفاعل الأخرى ، والقدرة على خلط ومطابقة تركيبات الحمض النووي المتعددة بسهولة. تظهر ميزة تجنب الاستنساخ بشكل خاص عند استخدام قوالب الحمض النووي الخطية ، والتي تمكن من تجميع التركيبات الجديدة بطرق مخبرية تستغرق ساعات بدلا من أيام33. إن القدرة على التلاعب بتركيز تركيبات الحمض النووي والمكونات الأخرى ببساطة عن طريق سحب العينات تجعل النهج أكثر جاذبية من خلال تمكين التجارب عالية الإنتاجية المدعومة من روبوتات مناولة السوائل34,35. بينما تم الإبلاغ عن نجاحات في استخدام CFPS للنماذج الأولية ، من المهم ملاحظة أنه يبقى أن نرى تحت أي سياقات يمكن لنتائج CFPS التنبؤ بشكل موثوق بالوظائف في الخلايا.

هنا ، نقدم طريقة للنماذج الأولية CFPS التي تؤكد على مزايا السرعة والإنتاجية والتكلفة مقارنة بالأساليب التقليدية القائمة على الخلايا. النهج مشتق من عملنا السابق حيث استخدمنا CFPS لتوصيف مكتبة من متغيرات المروج T7 التي ينظمها عامل النسخ TetR32 بسرعة ، والتوسع بشكل كبير في حفنة صغيرة من متغيرات مروج T7 المنظمة التي كانت متوفرة في الأدبيات في ذلك الوقت36,37. ومنذ ذلك الحين، قام آخرون بتوسيع نطاق هؤلاء المروجين38. في طريقتنا ، يتم تسريع تجميع البناء الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم قالب الحمض النووي عبر البادئات التي تضيف أجزاء وراثية متغيرة إلى جين المراسل. يتم استخدام معالجة السوائل الصوتية في 384 لوحة بئر لزيادة الإنتاجية وتقليل حجم المواد المطلوبة. أظهرت الأعمال السابقة الاستخدام الناجح لمعالجة السوائل الصوتية بكميات أقل بكثير39,40 مع تباين مماثل للسحب اليدوي لأحجام أكبر 41. بالإضافة إلى الطريقة ، نقدم معلومات استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم الوفورات المحتملة في التكلفة والوقت. لاحظ أنه بينما نقوم بتضمين بروتوكول لإنتاج محللات خالية من الخلايا بناء على Sun et al.42 هنا ، يجب أن تعمل أيضا العديد من المجموعات والبروتوكولات التجارية الأخرى43,44. وبالمثل ، بينما نوضح طريقة توصيف متغيرات المروج32 ، يمكن تبديل الأجزاء الأخرى عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل منظمات الريبو ، ومواقع ربط الريبوسوم (RBSs) ، والعوازل ، وعلامات البروتين ، والنهايات. نأمل أن تساعد هذه المنهجية مجتمع البيولوجيا التركيبية على الاستمرار في زيادة عدد الأجزاء المميزة لتجميع الدوائر الجينية التي يمكن التنبؤ بها ذات الوظيفة المفيدة.

Protocol

1. إعداد استخراج الخلية إعداد وسائل الإعلاملوسائط 2xYT: أضف 16 جم من التربتون و 10 جم من خلاصة الخميرة و 5 جم من كلوريد الصوديوم إلى 900 مل من الماء منزوع الأيونات واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 مع 5 M NaOH. ارفع حجم المحلول إلى 1 لتر باستخدام الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف أو تعقيم المرشح. بدلا من ذلك ، قم بشراء وسائط 2xYT. بالنسبة للمخزن المؤقت S30B: قم بإعداد محلول مكون من 14 mM Mg-glutamate و 60 mM K-glutamate و 5 mM Tris في 2 L من الماء منزوع الأيونات. استخدم 2 M Tris لضبط الرقم الهيدروجيني على 8.2 ، والأوتوكلاف ، وتخزينه في 4 درجات مئوية. أكمل المحلول بإضافة ثنائي ثيوثريتول (DTT) إلى تركيز نهائي قدره 1 mM قبل الاستخدام مباشرة. تحضير الخلاياقم بكتابة خلايا Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta2 أو خط الخلية الآخر المفضل (انظر Cole et al.44 للحصول على مراجعة شاملة حديثة) على صفيحة أجار LB (مرق الليزوجيني) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10-14 ساعة. استخدم مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية لتلقيح 3 مل من وسط 2xYT في أنبوب زراعة سعة 10 مل. احتضان هذا الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات. استخدم 50 ميكرولتر من مزرعة 3 مل لتلقيح 50 مل من وسط 2xYT في دورق سعة 500 مل. احتضن هذه القارورة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات. استخدم 7.5 مل من مزرعة 50 مل لتلقيح كل من أربع قوارير محيرة سعة 4 لتر تحتوي على 0.75 لتر من وسط 2xYT. احتضن هذه القوارير عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 2 إلى 4 ، بعد حوالي 3-4 ساعات. احصد الخلايا من كل قارورة عن طريق نقلها إلى حاويات سعة 1 لتر والطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق صبها في حاوية نفايات. اغسل كل حبيبات خلية ب 150 مل من المخزن المؤقت S30B المثلج عن طريق تعليقها بالكامل باستخدام ماصة لتعطيل كتلة الخلية ، ثم اجمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 12 دقيقة. تخلص من المادة الطافية. اغسل كل حبيبات خلية مرة أخرى في 40 مل من المخزن المؤقت S30B المثلج عن طريق تعليقها بالكامل وتعطيل كتلة الخلية باستخدام ماصة. انقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية وزنها مسبقا سعة 50 مل وقم بتجميع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب. وزن كريات الخلايا الرطبة. قم بتجميد كريات الخلية عن طريق وضع الأنابيب مباشرة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تحلل الخلاياقم بإذابة كريات الخلية على الجليد. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 1.4 مل من المخزن المؤقت S30B لكل 1 جم من حبيبات الخلية عن طريق الدوامة. قم بتحليل الخلايا بواسطة خلية ضغط فرنسية عند 640 رطل / بوصة مربعة عند 4 درجات مئوية. اجمع المحللة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد وأضف 3 ميكرولتر من 1 M DTT لكل 1 مل من المحللة مباشرة بعد التحلل.ملاحظة: من الأفضل النقر على صمام تحرير الضغط الفرنسي بقضيب معدني صغير للحفاظ على ضغط متساو وتجنب الانخفاض المفاجئ في الضغط. قم بمسح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 30000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من الحبيبات بعد سحب المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بارد ، مع الحرص على عدم تعطيل الحبيبات. جهاز طرد مركزي للطافي مرة ثانية عند 30000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ماصة الطافية الناتجة في أنبوب الطرد المركزي micro الجليد الباردة. تجاهل بيليه. احتضان المادة الطافية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قم بمسح المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية الناتجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بارد ، مع الحرص على عدم تعطيل الحبيبات. قم بالطرد المركزي للطافي مرة ثانية عند 15000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية الناتجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بارد ، مع الحرص على عدم تعطيل أي حبيبات متبقية. توزيع المادة الطافية في 100 ميكرولتر من القسمة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وتجميدها عن طريق وضعها مباشرة في النيتروجين السائل. قم بتخزين المادة الطافية في -80 درجة مئوية. 2. إعداد قالب خطي تصميم التمهيدياختر تسلسلا أساسيا كقالب PCR. قم بتضمين تسلسل مراسل كحد أدنى ، مثل sfGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر فائق الحجم) أو LacZ أو السبانخ أبتامير. قم بتضمين الأجزاء الأخرى التي سيتم إصلاحها عبر المتغيرات التي تم فحصها ، مثل المنهيات أو المروجين أو RBSs ، حسب الاقتضاء للتصميم.ملاحظة: لا يلزم دائما تضمين الفاصل للتعبير من الحمض النووي الخطي في الأنظمة الخالية من الخلايا. بالنسبة للبرايمر الأمامي ، اختر ما لا يقل عن 20 نقطة أساس مطابقة لنهاية 5 بوصات من التسلسل الأساسي كنهاية 3 بوصات من التمهيدي. في حالة إضافة أجزاء إلى نهاية 5 من البناء ، صمم ما تبقى من نهاية 5 ‘� من التمهيدي لإضافة الأجزاء الجينية ذات الأهمية إلى التسلسل الأساسي عبر تضخيم PCR (الشكل 1A والشكل 2).ملاحظة: نظرا لأن البادئات فوق ~ 60 نقطة أساس تزداد بشكل كبير في التكلفة ، يمكن تصميم العديد من البادئات المتداخلة لإضافة تسلسلات أطول أو أجزاء متعددة. بينما يمكن استخدام مواد أولية متعددة في تفاعل PCR واحد ، يوصى بإجراء جولات متعددة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. بالنسبة للبادئات العكسية ، اختر ما لا يقل عن 20 نقطة أساس لمطابقة نهاية 3 من التسلسل الأساسي كنهاية 3 من التمهيدي. في حالة إضافة أجزاء إلى الطرف 3 من البناء ، صمم ما تبقى من نهاية 5 أقدام من التمهيدي لإضافة الأجزاء الجينية ذات الأهمية إلى التسلسل الأساسي عبر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1 أ والشكل 2). تأكد من أن درجة حرارة التلدين العكسي للبرايمر العكسي في حدود 5 درجات مئوية من درجة حرارة التلدين للبرايمر الأمامي بأكمله. تضخيم القالب الخطيتحديد عدد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي سيتم إجراؤها بناء على عدد التسلسلات الأساسية وحساب كمية كل مكون مطلوب باستخدام الجدول 1. تحضير المزيج الرئيسي وفقا للجدول 1 وتخزينه على الجليد. حصة 30 أو 40 ميكرولتر (انظر الجدول 1) من المزيج الرئيسي في العدد المحدد من أنابيب PCR وإضافة 10 ميكرولتر من كل برايمر متغير (أي البادئات التي تشفر تغيير جزء ، انظر الجدول 1) عند 5 ميكرومتر إلى أنابيب PCR الموسومة بشكل مناسب. ضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج PCR التالي: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 30 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، XX درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أمسك التفاعل عند 4 درجات مئوية.حيث يمثل XX درجة حرارة التلدين للبرايمر مع انخفاض درجة حرارة التلدين ويمثل YY وقت التمديد المحسوب لطول amplicon بناء على توصيات الشركة المصنعة للبوليميراز عالي الدقة المستخدم. قم بتحسين هذه الشروط حسب الحاجة لمختلف البادئات و / أو القوالب. (اختياري) أضف 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد DpnI لهضم القالب الأصلي. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قم بتنفيذ هذه الخطوة فقط إذا كان القالب الأصلي هو الحمض النووي البلازميد. تحليل 5 ميكرولتر من كل منتج PCR عن طريق هلام الكهربائي. افصل المنتج باستخدام جل أغاروز 1٪ عند 180 فولت لمدة 20 دقيقة. تحقق من حجم النطاق الصحيح ، والذي سيختلف باختلاف التسلسل الأساسي المختار وطول الأجزاء المضافة. قم بتنقية القالب الخطي باستخدام مجموعة تنقية PCR تجارية أو بطريقة تنظيف PCR المفضلة. في حالة وجود نطاقات متعددة عن طريق تحليل الرحلان الكهربائي الهلامي ، إما تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تنقية نطاقات الوزن الجزيئي الصحيحة باستخدام مجموعة استخراج هلام تجارية وفقا لتوصية الشركة المصنعة. حدد كل قالب من قوالب الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتقييم جودة قالب الحمض النووي عن طريق التحقق من أن نسبة 260 نانومتر / 280 نانومتر تبلغ 1.8 تقريبا. (اختياري) افصل مرة أخرى جزءا من قالب الحمض النووي باستخدام هلام أغاروز 1٪ عند 180 فولت لمدة 20 دقيقة وتأكد من إزالة أي أشرطة غير مرغوب فيها أثناء تنقية القالب. استخدم قوالب الحمض النووي المنقى على الفور أو خزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. 3. إعداد البروتين المنقى تعبير البروتينلكل بروتين يتم التعبير عنه ، قم بتجميع بنية تعبير مناسبة. الكودون يحسن الجين للتعبير في الإشريكية القولونية. أدخل الجين في ناقل تعبير pET-22b أو ناقل تعبير مناسب آخر عبر طريقة تجميع البلازميد المفضلة. تحويل بلازميد التعبير إلى خلايا تعبير BL21 (DE3) Rosetta2 أو خط خلية مناسب آخر. لكل بروتين ، استخدم مستعمرة واحدة لتلقيح 3 مل من وسط LB في أنبوب زراعة سعة 10 مل. احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة طوال الليل. تلقيح دورق سعة 2 لتر يحتوي على 750 مل من وسط LB مع 1 مل من المزرعة الليلية. احتضان هذه القوارير عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل إلىOD 600 من 0.6-1.0. تحفيز التعبير البروتيني عن طريق إضافة 0.75 مل من 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في الماء لكل دورق والاستمرار في احتضان هذه القوارير عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات. احصد الخلايا من كل قارورة ، باستخدام زجاجة طرد مركزي سعة 1 لتر ، عن طريق الطرد المركزي بمعدل 5000 × جم لمدة 12 دقيقة. تخلص من المادة الطافية. انقل الكريات إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ووزن كل حبيبة. قم بتجميد الخلايا في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 3.2.ملاحظة: من المتوقع أن ينتج عن هذه الخطوة 2-5 جم من الخلايا لكل 0.75 مل. تنقية البروتين بواسطة كروماتوغرافيا عمود تقارب النيكلتحضير مخزن التحلل المؤقت عن طريق الجمع بين 50 mM Tris-Cl و 500 mM NaCl و 5 mM imidazole. اضبط الرقم الهيدروجيني 8.0. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل عن طريق الجمع بين 50 مللي مول Tris-Cl و 500 mM NaCl و 25 mM imidazole. اضبط الرقم الهيدروجيني 8.0. قم بإعداد المخزن المؤقت للشطف عن طريق الجمع بين 50 mM Tris-Cl و 500 mM NaCl و 250 mM imidazole. اضبط الرقم الهيدروجيني 8.0. قم بإعداد محلول غسيل الكلى المؤقت عن طريق الجمع بين 50 mM NaHPO4 و 100 mM NaCl و 2٪ DMSO. اضبط الرقم الهيدروجيني 7.5. قم بإذابة كريات الخلية عن طريق وضع الأنابيب في ماء بدرجة حرارة الغرفة. أضف 5 مل من محلول التحلل لكل 1 غرام من حبيبات الخلية وأعد تعليقها عن طريق الدوامة. تحليل الخلايا عن طريق صوتنة. افصل تجانس الخلية بحيث لا يكون هناك أكثر من 30 مل لكل أنبوب مخروطي سعة 50 مل واحتفظ بكل أنبوب على الجليد. قم بتحليل الخلايا باستخدام صوتي بمسبار قطره 0.16 سم في 15 ثانية مع 30 ثانية فواصل ، 10 مرات.ملاحظة: تجنب الرغوة ، لأن هذا يفسد البروتين. يمكن تجنب تشكيل الرغوة عن طريق الحفاظ على طرف صوتي على الأقل 2/3 مغمورة في المحللة أثناء تشغيلها. طرق أخرى لتحلل الخلية إلى جانب صوتنة ممكنة أيضا44. قم بمسح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وضع المادة الطافية في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. أضف 1 مل من راتنج حمض النيكل والنيتريلوتريسيتيك (Ni-NTA) لكل 5 مل من المادة الطافية. قسم محلول الخلية / ملاط Ni-NTA بحيث لا يكون هناك أكثر من 36 مل لكل أنبوب مخروطي سعة 50 مل. احتضان عند 4 درجات مئوية على أنبوب دوار عند 10 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. قم بتحميل الراتنج عن طريق صب محلول الخلية / ملاط Ni-NTA في عمود كروماتوغرافي بحجم سرير 2 مل وجمع المحلول إذا لزم الأمر لمزيد من التحليل ، وإلا تخلص منه. اغسل الراتنج ب 10 أحجام سرير راتنجية من محلول الغسيل. اجمع البروتين عن طريق إضافة ثلاثة أحجام من طبقة الراتنج من محلول الشطف إلى العمود وركز الحجم على 1.5 مل باستخدام مكثف طرد مركزي مع غشاء قطع الوزن الجزيئي المناسب لكل بروتين. غسيل البروتين ضد 2 لتر من محلول غسيل الكلى عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. قم بغسيل البروتين مرة أخرى مقابل 2 لتر من محلول غسيل الكلى طوال الليل عند 4 درجات مئوية. حدد البروتين باستخدام معامل الانقراض المولي والامتصاص عند 280 نانومتر. تحليل البروتين للنقاء عن طريق فصله باستخدام الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE). قم بتخزين البروتين في درجة حرارة -80 درجة مئوية. 4. تخليق البروتين الخالي من الخلايا تحضير خليط تفاعل CFPSقم بإعداد مزيج المكملات باتباع خطوات تحضير محلول الأحماض الأمينية وإعداد محلول الطاقة وإعداد المخزن المؤقت في Sun et al.42. يخزن بشكل منفصل أو مدمج في درجة حرارة -80 درجة مئوية في القسامة. تأكد من أن التركيزات النهائية تتطابق مع تلك الموصوفة في Sun et al.42 في قسم التنفيذ التجريبي لتفاعل TX-TL. تحضير مادة مضافة لحماية الحمض النووي الخطي من التدهور. إذا كنت تستخدم GamS33،45 ، فاستعد عبر الخطوات الواردة في القسم 3 أعلاه ، أو احصل عليها من بائع تجاري ؛ بالنسبة للطرق الأخرى ، تحقق من الأدبيات المقابلة46،47،48. بدلا من ذلك ، استخدم نظام CFPS الذي لا يتطلب إضافات49. قم بإعداد T7 polymerase وبروتينات الكابت والمواد المضافة الأخرى باستخدام الخطوات الواردة في القسم 3 أعلاه أو الحصول عليها من بائع تجاري. حدد عدد تفاعلات CFPS التي يتعين إجراؤها واحسب مقدار كل مكون مطلوب باستخدام الجدول 2. قم بتعديل تركيزات المكونات ، بما في ذلك إضافة المكونات أو إزالتها حسب الحاجة ، واضبط كمية الماء بحيث يكون الحجم النهائي لكل خليط تفاعل دائما 10 ميكرولتر. وبالمثل ، قم بتعديل المزيج الرئيسي لتسهيل الاستغناء عن المكونات الأخرى عن طريق معالجة السوائل الصوتية حسب الرغبة (انظر قسم المناقشة ). قم بإذابة جميع المكونات على الثلج وقم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق خلط كل مكون كما هو محسوب أعلاه. خلط جميع المكونات جيدا بواسطة ماصة. انتبه جيدا لتجنب هطول الأمطار ، خاصة بالنسبة لخليط الأحماض الأمينية. الحفاظ على مزيج ماستر على الجليد. قم بتبريد طبق 384 بئرا على الثلج ووزع المزيج الرئيسي في 9 ميكرولتر في كل بئر.ملاحظة: من الممكن توزيع هذه المكونات عن طريق معالجة السوائل الصوتية ، على الرغم من أنه يجب توخي الحذر لضمان التوزيع المناسب (راجع قسم المناقشة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها). توزيع مكونات إضافية عن طريق معالجة السوائل الصوتيةاحسب كمية البروتين الكابت (والمكونات الاختيارية الأخرى) المطلوبة لجميع تفاعلات CFPS. قم بإذابة البروتين الكابت على الثلج وتوزيعه في لوحة مصدر معالجة السوائل الصوتية أو لوحة أخرى مناسبة. تأكد من تضمين الكمية المناسبة من الحجم الميت المطلوب لنوع لوحة المصدر المستخدمة. توزيع البروتين الكابت في أحجام 1 ميكرولتر في الآبار المناسبة عبر معالج السائل. لمزيد من المعلومات حول استكشاف أخطاء التوزيع وإصلاحها، راجع قسم المناقشة . المنحنيات القياسيةقم بتضمين تخفيف تسلسلي للمراسل المنقى (انظر القسم 3 لتنقية البروتين)41 أو المعيار الكيميائيالمناسب 50 على اللوحة لتمكين مقارنة النتائج مع الدراسات الأخرى والمختبرات الأخرى. اختر مجموعة من التركيزات المناسبة للمراسل المستخدم ونطاق التعبير المتوقع للتجارب. تشغيل تفاعلات CFPSقم بتسخين قارئ الأطباق مسبقا إلى 30 درجة مئوية. اضبط قارئ اللوحة على القراءة في الإعدادات المناسبة للمراسل المستخدم في التسلسل الأساسي دون اهتزاز الخطوات.ملاحظة: بينما يتم استخدام 30 درجة مئوية هنا ، يتم أيضا استخدام 29 درجة مئوية و 37 درجة مئوية بشكل شائع وتعمل بشكل جيد مع هذا البروتوكول. قد تكون درجات الحرارة الأخرى مفضلة لمستحضرات التفاعل البديلة الخالية من الخلايا. بالنسبة لفترات القراءة ، تكفي 10 دقائق لتحقيق دقة جيدة للبيانات التمثيلية المقدمة هنا ؛ ومع ذلك ، قد تكون القرارات الأخرى أفضل اعتمادا على بروتين المراسل ووصفة CFPS الخاصة. (اختياري) قم بتشغيل تفاعل اختبار أولا لتعيين إعداد الكسب أو الحساسية المناسب لالتقاط التغيير في التألق دون تجاوز الإشارة. أغلق اللوحة التي تحتوي على 384 بئرا بغطاء بلاستيكي غير منفذ للغلق لمنع التبخر. إذا أمكن ، على الجهاز ، اضبط تدرج درجة حرارة عمودي 1 درجة مئوية للحد من التكثيف على الختم. ضع اللوحة التي تحتوي على 384 بئرا على حامل اللوحة وابدأ القراءة.

Representative Results

لإثبات فائدة أساليبنا ، نقدم النتائج التي تصف آثار قرب تسلسل tetO من مروج T7 على تنظيم التعبير المدفوع ب T7 RNAP. يمكن العثور على النتائج الكاملة وآثارها في عمل McManus et al.32. يتم وصف سير العمل في الشكل 1. تم إعداد خمسة عشر نموذجا خطيا ، تختلف فقط في مسافة مروج T7 بالنسبة إلى تسلسل tetO ، عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمراسل sfGFP باستخدام مواد أولية مصممة لإضافة كل متغير مروج (الشكل 2) كما هو موضح في القسم 2 من البروتوكول. تم تحضير مكونات تفاعل CFPS والتفاعلات باتباع البروتوكول. تم قياس تعبير sfGFP من كل قالب بمعايرة 12 تركيزا مختلفا من بروتين TetR ، في ثلاث نسخ ، باستخدام معالج سائل صوتي. عند 36 تفاعل CFPS لكل قالب و 15 نموذجا ، تم إجراء ما مجموعه 540 تفاعلا لمجموعة كاملة من مجموعات T7-tetO . تم إجراء التقييم بأكمله على لوحين في قارئين للوحة. أظهر تحليل هذه البيانات أن T7 RNAP ينظم التعبير المدفوع ب T7 بالتساوي حتى 13 نقطة أساس في اتجاه مجرى النهر من بداية نسخة T7 (الشكل 3). هذه النتيجة لها آثار على التصميم المستقبلي لدوائر الجينات التي يحركها T7 القابلة للتنظيم من خلال وصف نافذة مفترضة لقمع فعال ل T7 من قبل مثبطات أخرى. كشفت مقارنة نتائج البروتوكول الموصوف هنا مع الحمض النووي الذي أعده الاستنساخ التقليدي عن اختلاف صغير ولكنه ذو دلالة إحصائية في درجة قمع TetR بين الأشكال. افترضنا أن الارتباط غير المحدد ل TetR بالحمض النووي المتجه يمكن أن يفسر الاختلاف الملحوظ. أظهرت النتائج التجريبية أن إضافة الحمض النووي المتجه الخطي إلى التفاعلات مع قالب الحمض النووي الخطي قلل من الاختلاف إلى دلالة غير إحصائية ، على الرغم من أنها لم تستبعد المساهمات من عوامل أخرى ، مثل الاختلافات في دورية حلزون الحمض النووي للأشكال الخطية مقابل الدائرية ، والتي بدورها يمكن أن تؤثر على ربط TetR. اعتمادا على التطبيق ، قد يتطلب استخدام القالب الخطي التحقق من صحة إضافية. نقوم أيضا بتضمين بيانات تمثيلية حول المشكلات المحتملة مع التوزيع الدقيق باستخدام معالجة السوائل الصوتية (الشكل 4). تم استخدام محلول ملحي 1x فوسفات مخزن (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 الذي يحتوي على صبغة تارترازين 0.25 mM لتقييم طريقتين لبرمجة معالج سائل صوتي لتوزيع الأحجام >1 ميكرولتر. بعد توزيع السائل ، تم إغلاق لوحة الوجهة وطردها بالطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتم قياس الامتصاص عند 425 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة. يتم عرض النتائج التمثيلية لتسع تجارب وتظهر توزيعا أكثر اتساقا عبر سلسلة من ثمانية آبار وجهة عندما يتم تقسيم نقل 5 ميكرولتر إلى توزيعات منفصلة 1 ميكرولتر. بناء على هذه الملاحظات ، يوصى بتقسيم عمليات النقل >1 ميكرولتر إلى عمليات نقل متعددة بقيمة ≤1 ميكرولتر. راجع قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل حول استكشاف أخطاء هذا الجانب المهم من البروتوكول وإصلاحها. الشكل 1: سير العمل ليوم واحد لتقييم أجزاء المروج في مستخلص خال من الخلايا. (أ) يتم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية تحتوي على أجزاء وراثية ليتم تقييمها (2-5 ساعات). (ب) يتم تحضير مزيج التفاعل الخالي من الخلايا كما هو مفصل في البروتوكول وتوزيعه في لوحة 384 بئر مع قوالب مضخمة PCR (30 دقيقة). (ج) تستخدم معالجة السوائل الصوتية لتوزيع مكونات إضافية ، والتي يمكن أن تشمل البروتينات المثبطة ، وجزيئات المستجيب ، وأي مستجيبات شرطية أخرى (10 دقائق). (د) يتم قياس تعبير بروتين المراسل من كل تفاعل في قارئ لوحة (2-16 ساعة ، اعتمادا على وصفة CFPS والبناء). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: تصميم تمهيدي لإضافة أجزاء جينية إلى جين مراسل عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل . (أ) سيتم تضخيم جين مراسل sfGFP (أخضر) لإضافة RBS (أحمر) ومروج T7 (أزرق) بواسطة PCR. (ب) سيتم تضخيم sfGFP (أخضر) و RBS (أحمر) لإضافة تسلسل tetO (ذهبي) ومروج T7 (أزرق) بواسطة PCR. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: تأثير موضع tetO على تنظيم تعبير يحركه T7. تطبيع قيم القمع القصوى للقالب الخطي والدائري كدالة لموضع tetO . تمثل التتبعات المتوسط والانحرافات المعيارية لثلاث نسخ متماثلة. تم تعديل هذا الرقم من McManus et al.32 بموجب ترخيص المشاع الإبداعي CC-BY. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: استخدام صبغة التارتازين للتحقق من صحة توزيع السوائل باستخدام معالج سائل صوتي. تشير الأشرطة السوداء إلى توزيع 5 ميكرولتر من محلول التارتازين من بئر مصدر واحد في كل من الآبار الوجهة الثمانية المتتالية للوحة 384 بئرا باستخدام أمر برمجة واحد. تشير الأشرطة الرمادية إلى توزيع 1 ميكرولتر من بئر مصدر واحد في كل من آبار الوجهة الثمانية المتتالية باستخدام أمر برمجة واحد ، ثم تكرار هذه الخطوة أربع مرات ليصبح المجموع 5 ميكرولتر موزعة في كل بئر وجهة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. اسم المكون حجم 1 تفاعل (ميكرولتر) حجم 110٪ من X عدد التفاعلات (ميكرولتر) Q5 PCR بريمكس 25 الماء 4 القالب (1–3 نانوغرام/ميكرولتر) 1 (إذا تم إصلاحه1) التمهيدي الأمامي (5 ميكرومتر) 0 أو 10 (إذا تم إصلاحه1) التمهيدي العكسي (5 ميكرومتر) 0 أو 10 ماستر ميكس توتال: 30 أو 40 (إذا كان المتغير1) التمهيدي الأمامي (5 ميكرومتر) 0 أو 10 (إذا كان المتغير1) التمهيدي العكسي (5 ميكرومتر) 0 أو 10 الجدول 1: ورقة عمل لإعداد الكواشف لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن للمستخدمين ملء القيم الموجودة في العمود الموجود في أقصى اليمين اعتمادا على العدد المقصود من التفاعلات. 1 تحتوي البادئات المتغيرة على جزء معين لإضافته في تفاعل PCR ويمكن أن يكون التمهيدي الأمامي أو التمهيدي العكسي أو كليهما. البادئات الثابتة لا تضيف جزءا ويمكن أن تكون التمهيدي الأمامي أو التمهيدي العكسي ولكن ليس كلاهما. اسم المكون حجم 1 تفاعل (ميكرولتر) حجم 110٪ من X عدد التفاعلات (ميكرولتر) مستخلص الخلية 4.2 ملحق ميكس 3.3 بروتين GamS (207 ميكرومتر) 0.15 قالب الحمض النووي (20 نانومتر) 1 T7 بوليميراز (13 مجم / مل) 0.12 الماء 0.73 (قد يختلف هذا الرقم) ماستر ميكس توتال: 9 البروتين الكابت: 1 الجدول 2: ورقة عمل لإعداد الكواشف لتفاعلات CFPS. يمكن للمستخدمين ملء القيم الموجودة في العمود الموجود في أقصى اليمين اعتمادا على العدد المقصود من التفاعلات. الجدول التكميلي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

توفر البروتوكولات الموصوفة هنا وسيلة فعالة من حيث التكلفة وسريعة لفحص الأجزاء الجينية عن طريق التعبير عن بروتين المراسل بواسطة CFPS. تعتبر الأجزاء الجينية ذات الخصائص الجيدة ضرورية لتصميم دوائر وراثية يمكن التنبؤ بها ذات وظيفة مفيدة. تزيد هذه المنهجية من الإنتاجية وتقلل من الوقت اللازم لفحص الأجزاء الجينية الجديدة عن طريق إزالة متطلبات العمل في الخلايا الحية ، مع الاحتفاظ بالوظائف التي تعكس البيئة الخلوية من خلال الاحتفاظ بعملية التمثيل الغذائي للتعبير البروتيني في محللة الخلية. يمكن تنفيذ بروتوكولنا في يوم واحد بعد استلام البادئات (~ 2.5-6 ساعات لإعداد التفاعل ، 2-16 ساعة لتفاعل CFPS ؛ الشكل 1) ، مقارنة ب 3 أيام على الأقل للاستنساخ التقليدي (يوم واحد لكل من تجميع البناء والتحويل ، والتحقق من تسلسل الحيوانات المستنسخة ، وزراعة الخلايا للتقييم). ونقدر كذلك أن تكلفة البناء باستخدام الحمض النووي الخطي تبلغ حوالي ثلث تكلفة الاستنساخ التقليدي (78 دولارا مقابل 237 دولارا؛ الجدول التكميلي 1) أساليب. تقتبس خدمات التوليف التجاري حاليا ما لا يقل عن 4 أيام عمل اعتمادا على الحجم ، على الرغم من أنه سيكون لها تكاليف مماثلة لطريقتنا إذا تم فحص الأجزاء الخطية مباشرة في CFPS (78 دولارا مقابل 91 دولارا) ؛ لم نتحقق من هذا النهج. تكلفة تقييم جزء باستخدام CFPS صغيرة مقارنة بتوليد قالب الحمض النووي (0.05 دولار / رد الفعل22 مقابل 78 دولارا لكل قالب) ، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أن تكاليف بدء التشغيل للكواشف السائبة ومعدات التحلل لا تقل عن عدة آلاف من الدولارات. يؤدي استخدام معالج سائل صوتي إلى تحسين التكاليف بشكل هامشي فقط من خلال تمكين أحجام أصغر تصل إلى 0.5 ميكرولتر40 ؛ الميزة الأكثر أهمية هي تقليل الوقت اللازم لإعداد التفاعلات (~ 10 دقائق مقابل ما يصل إلى 1 ساعة ، اعتمادا على عدد التفاعلات) ، خاصة عند إعداد عدد كبير من التفاعلات يثير مخاوف من رد الفعل المحضر لأوقات طويلة قبل الحضانة.

في حين أنها سريعة وفعالة من حيث التكلفة ، إلا أن القيود المفروضة على الوقت الذي تتنبأ فيه النماذج الأولية ل CFPS بشكل كاف في وظيفة الجسم الحي لا تزال غير واضحة. على سبيل المثال ، لن يتم اكتشاف أي تفاعل متقاطع مع الحمض النووي الجينومي بسبب إزالة الجينوم المضيف أثناء إنتاج نظام CFPS. أيضا ، يمكن أن تكون تركيزات المكونات أقل بمقدار 1-2 أوامر في CFPS منها في الخلايا51 ، والتي من المحتمل أن تؤثر على سلوك بعض الأجزاء نتيجة لظروف الازدحام الجزيئي المختلفة. علاوة على ذلك ، قد تكون قدرة الحمض النووي الخطي على التنبؤ بوظيفة الجسم الحي محدودة ، على سبيل المثال ، عندما تلعب البنية الثانوية للحمض النووي دورا مهما. القيد الأخير هو أن الإنشاءات لا يتم التحقق من تسلسلها قبل اختبار الوظائف. قد تكون هناك حالات لا يتماشى فيها الجزء المميز فعليا مع التسلسل النظري المقصود. يمكن تخفيف كل هذه القيود عن طريق التحقق من صحة مجموعة فرعية من الأجزاء التي تم فحصها بهذه الطريقة في التطبيق المقصود في الجسم الحي .

لقد طورنا هذه المنهجية في الأصل للتحقيق في آثار تغيير موضع المشغل على مروجي T7-tetO الهجين32. لقد قدمنا البروتوكولات هنا بتنسيق أكثر عمومية ، بحيث يمكن تطبيقها على المروجين والمشغلين وتسلسلات ربط الريبوسوم والعوازل والإنهاءات. يمكن إضافة هذه الأجزاء الجينية إلى نهاية 5ʹ أو 3ʹ من جين المراسل عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات لكل تصميم ، مما يغني عن الحاجة إلى التوليف أو الاستنساخ لكل متغير للاختبار. تعمل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة كقالب DNA للتقييم عبر التعبير عن بروتين المراسل. في عملنا ، تم استخدام بروتوكول تنقية التقارب المقدم هنا ل TetR و GamS. يمكن استخدام نفس الإجراء للتعبير عن وتنقية المثبطات الأخرى ، والمنشطات ، والبوليميراز ، وعوامل سيغما ، والبروتينات الأخرى المشابهة لجزء وراثي من الاهتمام ، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات للبروتين المطلوب الذي يتم التعبير عنه. تتيح تنقية هذه البروتينات ومعايرتها في تفاعلات CFPS توصيفا أكثر تفصيلا لجزء وراثي معين. أخيرا ، توجد العديد من بروتوكولات CFPS البديلة ويجب أن يكون كل منها قابلا لجزء فحص الأجزاء من المنهجية. على سبيل المثال ، لا نقوم بتضمين خطوة غسيل الكلى في هذا البروتوكول ، والتي وجدها الآخرون مهمة للتعبير عن المروجين البكتيريين الأصليين22. من الممكن أيضا تغيير تركيزات المكونات المكونة الأساسية ل CFPS. يعزز استخدام مناولة السوائل القدرة على اختبار الظروف التي لا تعد ولا تحصى عن طريق زيادة الإنتاجية وتقليل المواد المطلوبة34,35.

أحد المجالات التي يمكن أن تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل كبير هو تحسين معالج السائل الصوتي. يجب تحسين توزيع معالج السوائل الصوتية لكل مكون يتم نقله ويوصى بشدة بتشغيل عناصر التحكم للتحقق من التوزيع والتكرار المناسبين قبل جمع البيانات. يعتمد نوع لوحة المصدر المثالي وإعداد فئة السائل على السائل المحدد المراد الاستغناء عنه ومكوناته. لا ينصح باستخدام الألواح المطلية بالأمين لتوزيع الحمض النووي ، حيث قد يتفاعل طلاء الأمين مع الحمض النووي. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن القدرة على توزيع تركيزات أعلى من مكونات معينة قد تعتمد على نموذج معالج السائل الصوتي. يمكن إجراء اختبار نقل السائل عن طريق الاستغناء عن ختم لوحة رقائق لتصور تكوين قطرات ناجحة ؛ ومع ذلك ، يوفر هذا الاختبار معلومات محدودة وقد تظهر قطرات من إعدادات مختلفة متطابقة. يمكن استخدام صبغة قابلة للذوبان في الماء ، مثل التارتازين ، للتحقق بشكل أكثر دقة من الاستغناء عن الحجم الصحيح في إعداد أو سير عمل معين (انظر النتائج التمثيلية). ويمكن أن تؤثر البرمجة المثلى لعمليات نقل السوائل أيضا على دقة واتساق البيانات المتولدة؛ بالنسبة لعمليات النقل >1 ميكرولتر من بئر مصدر واحد إلى بئر وجهة واحدة ، وجدنا أنه يجب برمجة عمليات النقل المتسلسلة ل ≤1 ميكرولتر لتقليل التباين المنهجي من بئر إلى بئر (الشكل 4). أخيرا ، يمكن أن تختلف أحجام الآبار الميتة النظرية والفعلية بشكل كبير اعتمادا على نوع لوحة المصدر وإعداد فئة السائل ومكونات السائل المحدد ؛ قد يساعد استخدام وظيفة مسح معالج السائل الصوتي لتقييم أحجام الآبار قبل تشغيل البرنامج في قياس مدى دقة الأداة في قياس سائل معين.

يمكن أن يختلف أداء تفاعل CFPS عند مقارنة النتائج بين المستخدمين المختلفين ودفعات المواد وقارئات الألواح والمختبرات41. في الحالات التي تكون فيها مثل هذه المقارنات مطلوبة أثناء وضع نماذج أولية للدوائر الجينية ، نوصي بتضمين تفاعلات التحكم الداخلي مع المروجين التأسيسيين القياسيين في كل لوحة تفاعل للمساعدة في تطبيع النتائج عبر الإعدادات التجريبية. يمكن أن تساهم طريقة تحضير الحمض النووي أيضا بشكل كبير في نشاط CFPS. يوصى بإدراج خطوة ترسيب الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يختلف تكوين التفاعل الأمثل حسب دفعةالمستخلص 34. وقد تبين أن تركيزات غلوتامات المغنيسيوم وغلوتامات البوتاسيوم المثلى ، على وجه الخصوص ، تختلف حسب الدفعة42 أو مع بروتين المروج أو المراسل المستخدم24. يجب تحسين تركيزات هذه المكونات عن طريق الفحص عبر عدة تركيزات لكل مكون لكل بناء جيني ولكل مستحضر مستخلص خلية لتحديد الظروف المثلى للتعبير عن البروتين. أخيرا ، تتضمن أفضل الممارسات لأداء تفاعل CFPS المتسق الخلط الشامل ، والماصات الدقيقة ، والاتساق في إعداد كل مكون من مكونات الكاشف.

بالإضافة إلى توصيف الأجزاء الفردية ، يمكن استخدام نفس الطريقة لفحص مجموعات الأجزاء التي تشكل دوائر معقدة ، مثل الدوائر المنطقية16 أو مؤشرات التذبذب52,53. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على فحص وتحسين أجهزة الاستشعار الحيوية للتطبيقات في التشخيص الوبائي 54،55،56،57 أو الكشف عن المخاطر وتحديدها كميا3،58،59. يمكن أيضا إقران تطبيق التقنيات التي تعتمد على الذكاء الاصطناعي مثل التعلم النشط34 بالطبيعة عالية الإنتاجية لهذه الطريقة لدفع الاستكشاف السريع لمساحات التصميم البيولوجي المعقدة. في نهاية المطاف ، نتصور أن هذا النهج يدعم أوقات التطوير المتسارعة للتصميمات الجينية الجديدة في البيولوجيا التركيبية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أصبح هذا العمل ممكنا بفضل برنامج البحوث التطبيقية للنهوض بأولويات العلوم والتكنولوجيا التابع لمكتب وزير الدفاع. نشكر سكوت والبر (مختبر الأبحاث البحرية) على توفير مخزون sfGFP المستخدم ، وزاكاري صن وأبيل تشياو (Tierra Biosciences) على المناقشات المثمرة المتعلقة بالنماذج الأولية مع الأنظمة الخالية من الخلايا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ذات الصلة للتعامل مع السوائل الصوتية.

Materials

2x YT medium Sigma-Aldrich Y2377-250G Alternative to making 2xYT media
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01 S30 Buffer B
Agar Bacto 214010 For plating cells
Chromatography column (5 cm diameter) BIO-RAD 731-1550 Used for protein purification.
Destination plate Thermo Scientific Nunc plate 142761 For CFPS reactions
DMSO Sigma-Aldrich D2650 For dialysis buffer
DpnI NEB R0176L For digestion of plasmid templates
DTT Roche 20871723 S30 Buffer B
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 Novagen 70954 Cell line used for production of lysate and purified proteins
Echo acoustic liquid handler Labcyte 525 Acoustic liquid handler
French pressure cell Thermo Spectronic FA-078 For lysing cells for CFPS
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 For buffers
Impermeable plastic sealable lid Thermo 232702 Plate seal
IPTG RPI I56000-25.0 Used for protein induction.
K-Glu Sigma-Aldrich g1501-500G S30 Buffer B
Labcyte Echo source plate Labcyte PL-05525 For use with Echo acoustic liquid handler
Mg-Glu Sigma-Aldrich 49605-250G S30 Buffer B
NaCl Sigma-Aldrich S7653-250G For buffers
NaHPO4 Sigma-Aldrich 71505 For dialysis buffer
NaOH Mallinckrodt Chemicals 7708-10 For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899
Ni-NTA resin Invitrogen R901-15 For production of purified proteins
PCR H2O Ambion AM9937 PCR of linear templates
Plate Reader BioTek H10 Plate reader used
Q5 PCR Master Mix NEB M0494S PCR of linear templates
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28606 PCR of linear templates
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR of linear templates
QSonica Ultrasonic Processor Qsonica Q700 Cell disruption during protein purification
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801 Updated supplier from Sun et al.
Tris MP 819623 S30 Buffer B
Tris-Cl Sigma-Aldrich T5941 For buffers
Tryptone Fluka T7293 For making 2xYT media
Yeast Extract Bacto 212750 For making 2xYT media
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Saltepe, B., Kehribar, E. &. #. 3. 5. 0. ;., Su Yirmibeşoǧlu, S. S., Şafak Şeker, U. &. #. 2. 1. 4. ;. Cellular biosensors with engineered genetic circuits. ACS Sensors. 3 (1), 13-26 (2018).
  3. Bereza-Malcolm, L. T., Mann, G., Franks, A. E. Environmental sensing of heavy metals through whole cell microbial biosensors: A synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 4 (5), 535-546 (2015).
  4. Mimee, M., et al. An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health. Science. 360 (6391), 915-918 (2018).
  5. Isabella, V. M., et al. Development of a synthetic live bacterial therapeutic for the human metabolic disease phenylketonuria. Nature Biotechnology. 36 (9), 857-867 (2018).
  6. Healy, C. P., Deans, T. L. Genetic circuits to engineer tissues with alternative functions. Journal of Biological Engineering. 13, 39 (2019).
  7. Kaushik, A., Tiwari, S., Dev Jayant, R., Marty, A., Nair, M. Towards detection and diagnosis of Ebola virus disease at point-of-care. Biosensors and Bioelectronics. 75, 254-272 (2016).
  8. Jagadevan, S., et al. Recent developments in synthetic biology and metabolic engineering in microalgae towards biofuel production. Biotechnology for Biofuels. 11, 185 (2018).
  9. Keating, K. W., Young, E. M. Synthetic biology for bio-derived structural materials. Current Opinion in Chemical Engineering. 24, 107-114 (2019).
  10. Smanski, M. J., et al. Synthetic biology to access and expand nature’s chemical diversity. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 135-149 (2016).
  11. Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
  12. Galdzicki, M., Rodriguez, C., Chandran, D., Sauro, H. M., Gennari, J. H. Standard biological parts knowledgebase. PLoS One. 6 (2), 17005 (2011).
  13. Kelwick, R., Bowater, L., Yeoman, K. H., Bowater, R. P. Promoting microbiology education through the iGEM synthetic biology competition. FEMS Microbiology Letters. 362 (16), (2015).
  14. Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nature Protocols. 9 (9), 2075-2089 (2014).
  15. Halleran, A. D., Swaminathan, A., Murray, R. M. Single day construction of multigene circuits with 3G assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1477-1480 (2018).
  16. Nielsen, A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), (2016).
  17. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nature Biotechnology. 26 (7), 787-793 (2008).
  18. Boehm, C. R., Bock, R. Recent advances and current challenges in synthetic biology of the plastid genetic system and metabolism. Plant Physiology. 179 (3), 794-802 (2019).
  19. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  20. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: New mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  21. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  22. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat. Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  25. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  26. Kelwick, R., et al. Cell-free prototyping strategies for enhancing the sustainable production of polyhydroxyalkanoates bioplastics. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  27. Karim, A. S., et al. In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes for cell design. Nature Chemical Biology. 16 (8), 912-919 (2020).
  28. Takahashi, M. K., et al. Rapidly characterizing the fast dynamics of RNA genetic circuitry with cell-free Transcription-Translation (TX-TL) systems. ACS Synthetic Biology. 4 (5), 503-515 (2015).
  29. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  30. Borkowski, O., et al. Cell-free prediction of protein expression costs for growing cells. Nature Communications. 9 (1), 1457 (2018).
  31. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Nash, C. J., Jewett, M. C. In vitro prototyping of limonene biosynthesis using cell-free protein synthesis. Metabolic Engineering. 61, 251-260 (2020).
  32. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  33. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  34. Borkowski, O., et al. Large scale active-learning-guided exploration for in vitro protein production optimization. Nature Communications. 11 (1), 1872 (2020).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS One. 8 (10), 78442 (2013).
  37. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40 (8), 3763-3774 (2012).
  38. Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
  39. Bailey, J., Eggenstein, E., Lesnick, J. Miniaturization and rapid processing of TXTL reactions using acoustic liquid handling. Labcyte Technical Note. , 1-12 (2018).
  40. Marshall, R., Garamella, J., Noireaux, V., Pierson, A. High-throughput microliter-sized cell-free transcription-translation reactions for synthetic biology applications using the echo 550 liquid handler. Labcyte Application Note. , 1-6 (2018).
  41. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  42. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  43. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  44. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  45. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  46. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  47. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  48. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  49. Tuckey, C., Asahara, H., Zhou, Y., Chong, S. Protein synthesis using a reconstituted cell-free system. Current Protocols in Molecular Biology. 108, 1-22 (2014).
  50. Hoffman, R. A., Wang, L., Bigos, M., Nolan, J. P. NIST/ISAC standardization study: Variability in assignment of intensity values to fluorescence standard beads and in cross calibration of standard beads to hard dyed beads. Cytometry. Part A. 81 (9), 785-796 (2012).
  51. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  52. Rossi, N. A., Dunlop, M. J. Making waves with synthetic oscillators. Cell Systems. 6 (4), 406-407 (2018).
  53. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 09771 (2015).
  54. Chang, H., Voyvodic, P. L., Structurale, C. D. B. Microbially derived biosensors for diagnosis, monitoring and epidemiology. Microbial Biotechnology. 10 (5), 1031-1035 (2017).
  55. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  56. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  57. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  58. Liu, X., Germaine, K. J., Ryan, D., Dowling, D. N. Whole-cell fluorescent biosensors for bioavailability and biodegradation of polychlorinated biphenyls. Sensors. 10 (2), 1377-1398 (2010).
  59. Gautam, P., Suniti, S., Amrita, K., Madathil, D., Nair, B. A Review on Recent Advances in Biosensors for Detection of Water Contamination. International Journal of Environmental Sciences. 2 (3), 1565-1574 (2012).

Tags

Cell-free Expression SystemsGenetic Part CharacterizationPCRRapid PrototypingDNA Template PurificationMaster Mix PreparationCell-free Expression Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McManus, J. B., Bernhards, C. B., Sharpes, C. E., Garcia, D. C., Cole, S. D., Murray, R. M., Emanuel, P. A., Lux, M. W. Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (174), e62816, doi:10.3791/62816 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image