Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi
Summary
Bu protokol, aktif olarak kasıtlı bir kardiyak trabecula ex vivo’dansarkom, kalsiyum ve makroskopik geometrik verilerin bir koleksiyonunu sunar. Bu eşzamanlı ölçümler üç görüntüleme yönteminin entegrasyonu ile mümkün olmaktadır.
Abstract
Kalp kasında hücre içi Ca2+ geçiciler kasılma miyofilamentlerini aktive ederek kasılma, makroskopik kısaltma ve geometrik deformasyona neden olur. Bu olaylar arasındaki iç ilişkilere ilişkin anlayışımız sınırlıdır, çünkü ne kasın içini ‘görebiliriz’ ne de heyecan-kasılma dinamiklerinin mekansal-zamansal doğasını tam olarak takip edebiliriz. Bu sorunları çözmek için, bir dizi görüntüleme modalitesini birleştiren bir cihaz inşa ettik. Özellikle, sarkom uzunluğu ve doku zorlanmasının yerel değişikliklerini ölçmek için parlak alan mikroskobu, Ca2+ geçicisini görselleştirmek için bir floresan mikroskobu ve bir kalp döngüsünün zaman dilimi boyunca dokunun geometrik değişikliklerini yakalamak için optik bir tutarlılık tomografı entegre eder. Burada görüntüleme altyapısını ve ilişkili veri toplama çerçevesini sunuyoruz. Veriler trabeculae carneae olarak bilinen izole çubuk benzeri doku yapılarından toplanır. Cihazımızda, bir çift konum kontrollü platin kanca, bir ex vivo kas örneğinin her ucunu tutarken, besin bakımından zengin salin çözeltisi ile sürekli olarak aşılanır. Kancalar bağımsız kontrol altındadır ve kas uzunluğunun ve kuvvetinin gerçek zamanlı kontrolüne izin verilir. Uzunlamasına çeviri, mikroskop görüntüleme penceresinin göreli boyutu (540 μm ile 540 μm) ve tipik bir trabecula (>2000 μm) uzunluğu ile ilişkili sınırlamaların üstesinden gelen numunenin parça parça taranmasına olanak tanır. Kas odasının her iki ucundaki platin elektrotlar trabecula’yı kullanıcı tanımlı bir hızda uyarır. Stimülasyon sinyalini, her görüntüleme penceresindeki verileri senkronize etmek için bir tetikleyici olarak kullanıyoruz ve tüm örnek seğirmeyi sabit durum koşullarında yeniden yapılandırıyoruz. Bu parlak alan görüntüleme verilerine görüntü işleme tekniklerinin uygulanması doku yer değiştirme ve sarkom uzunluğu haritaları sağlar. Böyle bir veri koleksiyonu, bir deney modelleme boru hattına dahil edildiğinde, fizyoloji ve patofizyolojide kas kontrtilasyon homojenliği ve heterojenliği hakkında daha derin bir anlayış sağlayacaktır.
Introduction
İzole kardiyak kas dokusu preparatlarının superfüzyonu, kardiyak iyonik aktivasyon ve mekaniği incelemek için standart ve yaygın olarak kullanılan bir protokoldür1. Özellikle, trabeculae, çubuk benzeri yapıların ventrikül duvarlarından izolasyonu, kasılma2’ninuzunluğa bağlı aktivasyonu, kasılma3,4’ünstreç bağımlı yanıtı ve kardiyak dokunun diyastolik viskoelastisite5 dahil olmak üzere fenomenlerin değerlendirilmesini sağlamıştır. Ter Keurs, izole trabeculae superfusing bu tekniğin başlatıcısı, başlangıçta Ca2 + ölçümleri için floresan görüntüleme ve sarkom uzunlukları belirlemek için lazer kırınım bir kombinasyonu kullandı2,5. Bu ilk çalışmalardan bu yana, parlak alan mikroskopi görüntülerinde 2D hızlı Fourier dönüşümü (FFT) tabanlı teknikler6 kullanarak sarkom uzunluğu bilgilerini daha büyük bir mekansal çözünürlükle çıkarmak giderek yaygınlaşmıştır. İki görüntüleme sistemi, Ca2+ salınımı ile sarkom uzunluğuna bağımlı kuvvet üretimi arasındaki temel ilişkinin kısmi olarak değerlendirilmesini sağlar.
Kalp kası, kalın ve kalın filamentlerden oluşan alttaki bir dizi kontrtil ünite ile ilişkili görünür bantlama ile çizgili. Sarkomları oluşturan bu kurucu filamentlerin etkileşimi, kuvvet üretimine şu şekilde başlar: depolarize edici bir elektrik sinyali veya eylem potansiyeli, hücre zarında voltaja bağımlı L tipi Ca2+ kanallarının açılmasına neden olur; Ca 2+ hücresel akını, Ca2+ indüklenen Ca2+ sürümü7olarak bilinen bir süreçte, hücre içi bir Ca2+ deposu olan sarkoplazmik retikulumdan (SR) Ca2+salınımını tetikler; hücre içi Ca2+ konsantrasyonundaki bu ani artış nanomolardan mikromolar aralığa kadar kuvvet üretiminin gerçekleşmesini sağlar; Ca2+ pompaları, sitozolden SR ve hücre dışı bölmeye sürekli olarak Ca2+ ekstrüde eder; hücre içi Ca2+ konsantrasyonu nanomolar aralığa geri döndüğünde, kuvvet üretimi durur ve kas gevşer. Kuvvet üretimi sırasında, kurucu kalın ve ince filamentler birbirlerinin üzerine kayar. Sarkom uzunluğu, örtüşmemiş uzayının göreceli boyutunu ve bu nedenle kasın makroskopik olarak kuvvet üretimi potansiyelini belirler.
Bu yazıda, bu floresan-parlak alan görüntüleme tekniklerini optik tutarlılık tomografisini (OCT) içerecek şekilde genişletiyoruz. OCT, fiziksel girişim prensibini kullanır ve kas kontrtil heterojenliğini anlamak için dokunun geometrik deformasyonunu toplayabilir8. Cihazımız(Şekil 1)spektral etki alanı OCT (SD-OCT) sistemi kullanır. SD-OCT’de bir ışın ayırıcı, ışığı geniş bant kısa tutarlılık uzunluğundaki süperlüminesan diyottan referans ve ölçüm kollarına böler. Referans kolu sabit bir ayna içerir ve ölçüm kolu ışığı yönlendirmek için bir 2D galvanometre içerir. Numuneden geriye doğru saçılan ışık toplanır ve bir parazit deseni oluşturmak için referans kolundaki yansıyan ışığa müdahale eder. Derinlik bilgisi spektral saçak frekansında kodlanmıştır. Bilgileri ayıklamak için sinyal bir spektrometreden geçirilir ve sonuca ters bir FFT uygulanır. karşılık gelen 1D sinyal, kırılma indisi9’daki (A-scan) değişikliklere karşılık gelen farklı derinliklerdeki yapıları temsil eder. Lazeri tek bir eksende yönlendirerek, ilgi örneğinin bir kesitini (B taraması) oluşturabilir ve benzer şekilde, işlemi kalan eksende adım adım bir desende tekrarlayarak, üç boyutlu bir görüntü oluşturulabilir (C-taraması). Uzantı olarak, harici bir tetikleyiciye dayalı olarak yinelenen bir zaman değişen konu için tek bir dilimde bir dizi B taraması toplayabilir ve zaman değişen düzlemsal görüntü10’utemsil eden üç boyutlu bir tarama oluşturmak için tekrarlayabilir.
Üç görüntüleme sistemini entegre ederken, aşağıdaki iki ilkeyi göz önünde bulundurduk. Birincisi, görüntüleme sensörleri ışığı alternatif bir görüntüleme yönteminden algılamamalı ve ikincisi, fiziksel tasarım en az üç eşzamanlı görüntüleme düzlemleri için boş alan içermelidir. İlk gereksinimi gidermek için brightfield mikroskobu, numuneyi ters bir konfigürasyonda aydınlatmak için 660 nm dalga boyu LED’i kullanır. Floresan mikroskobu, yayılan ışığın hem çıkarılması hem de toplanması için aynı objektif lensin kullanıldığı bir epifluoresans konfigürasyonundadır. Heyecan ışığı 340 nm ile 380 nm arasında bir dalga boyuna sahiptir ve bir fotomultiplier tüp (PMT) yayılan ışığı 510 nm dalga boyunda ölçer. Bir çift dikroik ayna, bu iki optik yolu ters ölçüme müdahale etmeden aynı fiziksel ayak izini paylaşmasını sağlar (Şekil 2). Son olarak, OCT, diğer iki modaliteden farklı olarak merkezi dalga boyu 840 nm olan geniş bant (100 nm spektral genişlik) ışığı kullanır. OCT için kullanılan ışığın düşük tutarlılık doğası nedeniyle, parlak alan floresan kaynaklarından gelen dağınık ışık, derinlik bilgilerini kodlayan parazit desenine katkıda bulunmaz. İkinci gereksinim için, kılcal boru için gövde tasarımı, numunenin ön, alt ve üstün düzlemlerine erişilebilir optik yollara sahiptir. Deneyler sırasında, iki platin kanca, oksijenli Krebs-Henseleit (KH) çözeltisi ile perfüzyona uğramış bir kılcal tüp içinde bir trabecula tutar. OCT’nin galvanometre kafası, üçüncü ortogonal optik düzlemden yararlanmak için ortogonal olarak parlak alan floresan görüntüleme yoluna yönlendirilir (Şekil 3).
Bu makalede, kalsiyum, sarkom uzunluğu ve kas geometrisini aynı anda görüntüleyebilen bir cihaz oluşturmak için tasarım konuları özetlenmiştir. Bu ölçüm yeteneklerini göstermek için, bir ventrikül trabeculasının izole edilmesi, gerekli tampon çözeltilerinin hazırlanması ve bir ex vivo trabecula’nın taşınması ve floresan yüklenmesinde yer alan kritik adımları açıklıyoruz. Son olarak, bu makalede veri kümesini daha kullanışlı görselleştirmelere çevirmek için gereken işlemler özetlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, brightfield, floresan ve OCT görüntülemeyi birleştiren üç optik sistemin aktif olarak kasılan bir ex vivo kardiyak trabeculadan veri toplamasını sağlayan bir konfigürasyon sunuyoruz (Şekil 1 ve Şekil 2). Böyle düzenlenmiş bir entegrasyon, OCT’nin parlak alan floresan eksenine ortogonal düzenini sağlamak için ölçüm odasının(Şekil 3)tasarımı nedeniyle mümkündür. Kas montaj sistemi, kardiyak kas çıkarma-kasılma dinamiklerinin karakterizeinde anahtar endekslerin eşzamanlı nicelemelerinin başarısında eşit derecede önemli bir rol oynar. Yeniliği, kasın mekanik performansında belirgin bir rahatsızlık olmadan kas tarama prosedürlerini etkinleştirmekte bulunur (Şekil 6). Kuvvet ölçümü için kombine görüntüleme konfigürasyonu ve motorlu kanca sistemi ile bu sistem, seğirme süresi boyunca bir müteahhit trabeculanın makroskopik geometrik bilgileri ile birlikte Ca2+ geçici, yer değiştirme ve sarkom uzunluğundaki bölgesel heterojenliği değerlendirebilir (Şekil 7 ve Şekil 8).
Kardiyak araştırma laboratuvarlarında brightfield-epifluorescence görüntüleme sistemlerinin her yerde bulunduğu göz önüne alındığında, bu sonuçların çoğaltılması bazı küçük donanım hususları ile elde edilebilir. Burada, alttaki contractile heterojenliğini analiz etmek için gerekli olan brightfield-epifluorescence ve OCT’yi birleştirmek için görüntü işleme araç setini sunuyoruz. OCT entegrasyonu engelsiz bir optik yol gerektirirken, kapılı görüntüleme, uyaran ile hem OCT hem de brightfield görüntüleme kamerası arasında harici bir tetik hattı ve numuneyi ölçüm odası boyunca hareket ettirebilen kas montaj kancaları gerektirir. Gerekli işlem sonrası yazılım ve yöntemler serbestçe kullanılabilir. Özellikle, kullanılan segmentasyon yazılımı, WEKA14, açık kaynaklıdır. Malzeme noktalarının işaretsiz takibi tekniği8, sarkom uzunluğu, kapılı hacimsel görüntüleme10ve örgü oluşturma kodları da aynı şekilde erişilebilir ve ilgili yazardan talep üzerine kullanılabilir hale getirilebilir.
Kas canlılığı, Fura-2’nin optimal yüklenmesi ve görüntü odağı, başarılı bir deneyin temellerini oluşturan üç sütundur. Kontrgürü önlemek için BDM içeren bir diseksiyon çözeltisi kullanmak, bir şırıngırda kasın taşınması, çözeltinin sürekli oksijenlenmesi ve bir deney gününde yeni deneysel çözümler hazırlamak, hepsi yüksek kas canlılık oranına katkıda bulunur. Trabecula’yı Fura-2AM ile yüklemeden önce, ölçülen Ca2 + geçici15üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden, çalışmakla ilgilenen her durum için otofluoresans toplanmalıdır. Fura-2AM yükleme çözeltisinin oksijenlenmesi, boya yüklemesine yardımcı olmak için yüzey aktif madde pluronic-F127’nin gerekli dahil edilmesiyle karmaşıktır. Bu yüzey aktif maddeden kaynaklanan aşırı kabarcık oluşumuyla mücadele etmek için, yükleme çözeltisinde küçük bir köpük önleyici damla, kullanıcının oksijenlenme oranını artırmasını sağlar, böylece trabecula’nın yükleme işlemi boyunca işlevsel canlılığı koruma şansını artırır. Son olarak, parlak alan ve floresan bilgilerinin sinyalden gürültü oranına oranını en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme odağının kas uzunluğu boyunca düzgün olması gerekir.
Burada sunulan yöntemlerle göz önünde bulundurulacak iki sınırlama vardır. Birincisi floresan mikroskobun mekansal çözünürlüğüdür. OCT ve brightfield görüntülemenin mekansal çözünürlükleri yüksek olsa da, floresan mikroskobun çözünürlüğü, 540 μm ile 540 μm görüntüleme penceresinde yakalanan hacimden floresan integrali ile sınırlıdır. Sinyalin gürültü oranı pahasına floresan sinyalini yakalamak için PMT yerine yüksek kazançlı şarj bağlantılı bir cihaz kamerası kullanarak floresan mikroskopunun uzamsal çözünürlüğünü artırma kapsamı vardır16. İkincisi, ölçülebilir sarkom uzunluğu ve geometrik derinlik açısından çalışılabilen trabecula çapıdır. Sarkom uzunluğunu hesaplamak için pencereli FFT yaklaşımı, geliştirilmiş uzamsal çözünürlüğün yararından yararlanır, ancak daha az sağlamlıkla ilişkilidir (Şekil 8D). Bulanık veya büyük çaplı trabeculae’nin çalışılacağı durumlarda, daha büyük doku örneklerinde sarkolerik bantlama ile ilişkili kontrastın azalması nedeniyle FFT’nin çözünülmesi büyük ölçüde azalacaktır. Aynı şekilde, OCT içinde, 300 μm’den büyük bir görüntüleme derinliğinden gelen geri yansımalar segmentasyon aşamasında çözülemeyecek kadar zayıf olacaktır. Bu nedenle, tekniğimiz 300 μm’den daha az bir çapa sahip trabeculae ile sınırlıdır. Bununla birlikte, yüksek stimülasyon oranları sırasında kas çekirdeğinin difüzif oksijenasyonu ile ilgili sorunlar olabileceğinden büyük çaplı örneklerin incelenmesi önerilmez17.
Yöntemimiz, sağlıklı ve hastalıklı kaslarda kas geometrisi ile ilişkili olarak iyonik mekanik fonksiyonun değerlendirilmesini sağlayarak kalp kası fizyolojisini, patofizyolojisini ve farmakolojiyi anlamak için güçlü bir yaklaşım sağlar. Burada özetlenen görüntü işleme ardışık düzeni, kontrtil heterojenliğin daha derin bir şekilde anlaşılması için çok önemli olacak verileri ayıklar. Bu kadar zengin bir veri kümesinin potansiyelini tam olarak gerçekleştirmenin bir yolu, bu verileri entegre eden ve yorumlayan matematiksel modellerin inşasında ve cihazımızı kullanarak deneysel olarak test edilebilen tahminlerde bulunmaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Auckland Üniversitesi’nden (JD ve MC’ye verilen), Sir Charles Hercus Sağlık Araştırma Bursları (20/011 ve 21/116) Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi’nden (J-CH’den KT’ye verilen) doktora bursları tarafından finanse edildi. sırasıyla, Ulusal Kalp Vakfı (AA’ya verilen), Yeni Zelanda Kraliyet Derneği’nden Marsden Fast-Start hibeleri (UOA1504 ve UOA1703) tarafından verilen doktora bursu (J-CH ve KT’ye verilir, sırasıyla) ve Yeni Zelanda Kraliyet Derneği’nden James Cook Araştırma Bursu (AT’ye verilir). Bu enstrümanın orijinal gelişimi, Yeni Zelanda Kraliyet Derneği’nden (AT ve PN’ye verilen) bir Marsden hibesi (11-UOA-199) tarafından finanse edildi.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
| Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
| Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
| Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
| D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
| DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
| Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
| Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
| FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
| Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
| Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
| Heparin | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
| Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
| Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | Data processing code | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
| Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
| Transimpedance amplifier | Custom | ||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
| Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
References
- Han, J. -. C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
- Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
- Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).
- Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
- Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record – IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
- Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
- Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
- Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).
- Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
- Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
- Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
- Taberner, A., et al. A dynamometer for nature’s engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
- Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
- Han, J. -. C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).
