心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

オークランド大学動物倫理委員会は、ラットの取り扱いと組織サンプルの調製を承認しました。 1. イメージングキャリブレーション ブライトフィールド顕微鏡ピクセルキャリブレーション 測定室に蒸留水を充填します。 測定チャンバに、μm当たりの既知の線を含む回折格子を配置します。 F1 キーを押してキャプチャを有効にし、回折格子がはっきりと見えるまで フレーム レート [Hz] を 調整します (図4A)。回折格子がフレームのエッジと平行に動作することを確認します。 F1 キーをもう一度押してキャプチャを停止します。 [合計イメージをキャプチャする]を1 つに設定し、Ctrl + Shift + S キーを押してデータをディスクにストリームし、F1キーを押して回折格子の画像をキャプチャします。 ImageJ を開き、回折格子画像 (ファイル>開く>キャリブレーションイメージを選択) をインポートします。シフトを保持し、回折格子の20の光と暗いバンドを包含する線を描きます。 イメージを調整する([スケールを設定>分析] をクリックします)。ステップ 1.1.5 の線の長さによって、[ 距離(ピクセル数)] の値が設定されます。既知の 距離 の値を μm 測定あたりの線の 20 倍に設定し、 長さの単位 を μm に設定します。スケールの逆は、ピクセルで表されるマイクロメートルの数です。 OCT 深度分解能キャリブレーション バーニエキャリパーを使用して、ガラス顕微鏡スライドの厚さを測定します。 OCT レーザー光源をオンにします。 ガルバノメーターの頭部を覆い、BGを取得をクリックしてバックグラウンド干渉パターンを測定し、測定から引きます(図4B)。 OCT の測定アームで測定したガラス顕微鏡スライド (ステップ 1.2.1 から) をクランプします。 OCT 画像を表示するには、[ ライブ ストリーム ] をクリックします。ガラス顕微鏡スライドをB-スキャン内で見えるように調整します。 B-スキャン イメージをキャプチャするには、[ 範囲 Y (ステップ)] を 1 に設定し 、[B-スキャン データのストリームを取得する]をクリックして、[ 取得] をクリックします。 B-スキャンイメージを ImageJ (ファイル>開く> B-scanを選択)にインポートします。シフトを保持し、ガラス顕微鏡スライドの境界間に線を引く。 スケールを設定する (スケールを設定>分析)。ステップ 1.2.1 で収集した測定値に 既知の距離 を設定します。 空気中の深度分解能を計算するには、ピクセル当たりの測定値にnガラスを掛けることで、顕微鏡スライド(nガラス=1.5175)11の屈折率を補正する。 注:引用 されたnガラス は、ホウケイ酸ガラス用です。顕微鏡のスライドは異なった材料からなることができる。測定したスライドに適切な屈折率を使用します。 心筋の深度分解能をスケールするには、ステップ 1.2.9 の値を除算します。n心筋= 1.38 (以前に報告された値12)。 2. 筋肉サンプル調製 解剖リグを準備します。 解剖溶液の一部( 表1に概説)を小さな金属製のボウルに注ぎ、心臓切除の約1時間前に冷凍庫に入れます。 解剖ソリューションが十分に酸素化され(100%酸素)、各チューブラインを通してフラッシュされていることを確認する解剖リグを設定します。解剖チャンバに酸素解剖液を充填し、灌流カテーテルの周りに3/0縫合糸をゆるやかに結びます。 心を物品切りする。 8-10週齢のウィスターラットをガス状のイソフルラン(<5%酸素)を使用して麻酔します。尾をつまんで麻酔を確認します。 麻酔ラットをスピーヌ位置に置き、ヘパリン溶液(1000 IU/kg)で腹部に皮下注射します。ヘパリンが循環できるように、さらに5分間麻酔を維持します。 解剖液を含む金属ボウルを冷凍庫から取り出し、安楽死ベンチの近くに置きます。注:解剖液を完全に凍結して、解剖された心臓の完全な水没を可能にしないようにしてください。 麻酔ラットを安楽死ベンチに移し、頸部脱臼で安楽死させる。 はさみでラットの胸を開き、まず胸部の下側に沿って体壁を切断し、次に横隔膜を切断してから、胸部の横の境界に沿って進みます。胸を持ち上げます。 片手で心臓をつかみ、もう一方の手は湾曲したハサミを使って接続容器(大大根、大静脈、大静脈など)を切断します。 冷たい解剖液に心臓を素早く沈めます。 トラベキュラを分離する。 心臓が金属ボウルにある間に大動脈を識別し、その後、解剖室に心臓を移します。2つの湾曲した鉗子を使用して、大大間を灌流カニューレの上に引っ張る。 大間を1つの鉗子で所定の位置に保持します。一方、チューブラインを開けて、解剖溶液が輸血カニューレを通って流れるようにする。注:心臓切除後1分以内に灌流を完了することを目指してください。 冠状動脈脈管が血液を取り除かれ、心臓が解剖溶液で完全に浸透し、灌流の流れを止め、縫合を使用して大動脈を所定の位置に固定します。流れを元に戻し、カニュードハートを穿刺します。 左冠動脈が上面に見えるようにカニューレを回転させます。心臓の頂点を解剖室の底に固定する(図5A)。両方のアトリアを切断します(図5B)。 スプリングハサミのセットで、中隔の右側に沿って心臓の頂点まで切り取ります(図5Bに示すように)。開いた左心室を解剖室の基部に固定します。次に、中隔の左側に沿って切り、右心室を開き、解剖室の基部にピン留めします(図5C)。注:心室を開いた位置に固定するには、いくつかの乳頭の筋肉を切断する必要があります。右心室で自由に動く柱管を特定する(図5D-E)。 スプリングハサミと鉗子を使用して、柱柱を取り巻く壁組織を切断し、壁組織を半音で切断して、柱壁の方向に向かって切断する。壁組織をトリムし、その寸法が使用する取り付け構成に適しています。この場合、ゴマシードの約半分の大きさ(図5F)。注:トラベキュラは右心室と左心室から解剖することができますが、左からのそれらは通常、サルコメアおよび幾何学的測定にはより濁っていて適用されません。 切除槽内に切除された線維柱を残し、解剖液を継続的に重ね合わします。 3. 実験プロトコル 注: この実験に使用したデバイス13 は、社内で構築され、カスタム コントロール コードを使用します。これらのデータを複製するために構築されたデバイスの設計に必要な考慮事項は、2つの独立して作動した取り付けフック、3つの光学的に明確な軸を持つ測定室(図3)、および明視野カメラとOCTカメラを刺激器と同期させる外部トリガラインです。PMT電圧・力信号をアナログDAQカードを用いて集め、カメラリンクフレームグラバカードを用いてOCTと明視野顕微鏡の画像を収集し、デジタルI/Oカードを用いて刺激信号を集めた。データは、時間的な位置合わせを維持するために、一連のプロデューサー コンシューマー ループを使用してオフラインで格納されました。 カーディオミオメーターを準備します。 高温(〜60°C)の水を洗い流し、蒸留水(室温)、次いで測定室を通して溶液を過疎化させる。カルボーゲンでスーパーフューズ液を連続的に泡立ててください。 明視野顕微鏡照明光源をオンにし 、F1 を押してキャプチャを有効にします(図4A)。下流フックを、明視野イメージの中央に配置するまで手動で調整します。[ 下流軸ゼロ] をクリックし、[ ダウンストリームが無効] をクリックしてモーターを有効にします (図 4C)。フックの終わりが既定の対象領域のエッジに合うように DS 設定ポイント [um] スライダを動かします。 下流軸を再びゼロにしてから 、DS 設定点 [um] スライダーを 1000 に移動します。上流フックでプロセスを繰り返しますが、 米国設定[um] スライダーは動かしません。 [取り付けに移動]をクリックします(図4C)。 メインスイッチを切り替えてコントローラサブシステムを素早くオンにする前に、ランプスイッチを切り替えて蛍光照明システムを起動します。注: 一部の UV 光源は、大量のオゾンを生成します。この場合は、オゾン抽出器を光源の出口の通気孔に接続し、蛍光照明光源をオンにする前にオゾン抽出器が動作していることを確認します。 フロントパネルのモードボタンを押して操作モードをターボ・ブランキングに切り替え、続いて2、1を押します。[On-line]ボタンを押して、コントロール コードに操作を通知できるようにします。 トラベキュラを取り付ける。 測定チャンバーを通るスーパーフューズートの流れを一時停止します。取り付けチャンバーに解剖液を充填します。 1 mL シリンジを使用して、分離チャンバーから取り付けチャンバに柱管を輸送する(図5G)。 柱柱を移送するには、シリンジを上下に配置し、取り付けチャンバー溶液の表面と接触させます。重力を介して柱管が取り付けチャンバーに降下することを許可する(図5H)。 取り付けチャンバーの流体レベルを下げて、フックの中央部と同じレベルにします。 DS セットポイント [um]スライダーを動かして、トラベキュラの緩み長さを反映するようにフック間の距離を調整します。 顕微鏡を使用して視覚化を助け、端部組織の片方を鉗子で軽く握り、上流フックに取り付けます。他の端のティッシュを下流のフックに取り付ける(図5I)。 しっかりと取り付けられたら、トラベキュラを測定室(図5J)に戻し 、移動をチャンバーに移動 (図4C)を押して戻します。スーパーフューズド流れと流体抽出を再開します。 刺激周波数[Hz]を1、刺激持続時間[ms]を10、刺激電圧を10に設定します。刺激を押して刺激を開始? トラベキュラを準備します。 順応の約1時間後、それぞれ1Vおよび1msステップで刺激電圧と刺激持続時間を徐々に減少させる。一般的な値のセットは 3 V と 3 ミリ秒です。 明視野照明システムをオンにします。 F1 キーを押して、ユーザー インターフェイス上の線分の領域を囲む対象地域を選択します。 [SL を計算 ]をクリックして、ハイライトされた領域の平均サルコメア長さを計算します。 分離セットポイント [um] スライダーを大きくして、平均サルコマー長が 2.32 μm になるまで筋肉の長さを増やします。注 :SLを計算しますか? は、ステップ 4.3 で概説した 2D FFT を使用します。平均サルコマー長の計算に使用される対象領域は、通常100 μm~150 μmの正方形です。したがって、筋肉が最適なサルコメア長に近づくにつれて、平均サルコメア長を計算するために43〜65サルコメアが使用される。 「中心と分離制御」タブのセンター設定点[um]スライダを調整して筋肉を動かし、下流のフックの端が明視野画像内で見えるようにします。10回のツイッチの蛍光情報を収集します。 センターセットポイント[um]値を200増加させ、さらに10個分の蛍光情報を収集します。明視野のイメージに上流フックが含まれるまで、このプロセスを繰り返します。最後のウィンドウの蛍光情報を収集します。 センターの設定値 [um]の値を 0 に設定して、柱柱を中央の位置に戻します。 刺激周波数を0.2 Hzに下げ、KHスーパーフューセートからFura-2負荷溶液に切り替えます( 表1を参照)。 [スティムとデータ]タブの[蛍光ソースを有効にする]をクリックして、10分ごとに蛍光信号を測定します。PMTシグナルタブで蛍光信号を可視化します。 360 nm信号が10倍増加した後、または負荷手順の持続時間が2hを超えた後、刺激周波数を1Hzに戻し、KHスーパーフューザート溶液に戻します。 比率測定が安定し、その時点でデータ収集を開始できるまで、10分ごとに比率測定を確認します。 明視野および蛍光イメージングデータを収集します。 下流フックのエッジが明視野画像内にある位置に筋肉を戻します。ハードウェア制御ユーザーインターフェイスの[スティムとデータ]タブで[ディスクにデータをストリーミング]をクリックして、ハードウェアデータのストリーミングを開始します。蛍光ソースを有効にするをクリックして蛍光情報をキャプチャします。 明視野イメージングユーザインタフェースで、キャプチャモードを外部トリガに設定し、フレームレートを100 Hzに増やして、キャプチャする画像の数を100に設定します。 Ctrl + Shift + S キー を押し、F1 キーを押して、このウィンドウの明視野イメージングデータを記録します。 センターセットポイント [um]値を 200 増やし、ステップ 3.4.2 を繰り返します。ステップ 3.3.4 から最終ウィンドウのイメージング データが収集されるまで、スキャン プロトコルを続行します。 センターの設定値 [um]の値を 0 に設定して、柱柱を中央の位置に戻します。 OCT イメージング データを収集します。 マスターキーを|に回してOCTレーザー光源をオンにするをクリックし、電源ボタンを押し、続いて SL ボタンを押します。 ガルバノメーターの頭部を覆い、BGを取得をクリックしてバックグラウンド干渉パターンを測定し、測定から引きます(図4B)。 イメージ キャプチャ モードをライブ ビューに設定します。 B-スキャンイメージにアップストリームフックのみが含まれるまでyの位置を調整します。コントロールフロントパネル (図 4B)に表示される筋肉の長さを 2 で割り、現在のy位置を引きます。この値を”y-オフセット” 入力に入力します。「x-オフセット」値を調整して、柱の断面がフレームの中央に配置されるようにします。 柱柱を中心に 、y-位置を調整して y軸に沿ってスキャンし、上流および下流のフックに対応する位置を見つけます。これらの位置を下に置き、注意してください。 範囲 Y (ステップ) を 、これらの値の絶対差を 10 で割った値に設定します。 イメージキャプチャモードを 刺激トリガー?に設定し、 範囲 X(ステップ)を 100 に 設定し、[アクティブなパラメータの設定 ] ボタンをクリックします。 [ ストリーム B-スキャン データ?] をクリックし 、[取得] をクリックします。注:ゲートイメージングプロトコルは、約3分20 sのキャプチャ時間に対応する長さのサンプル2ミリメートルの全体の筋肉の形状をキャプチャするために200のツイッチを必要とします。 4. 明視野画像データセットの処理 画像を解析用に準備します。 ImageJ にイメージをインポートする (ファイル>イメージシーケンス>読み込む>イメージを選択します)。 画像のコントラストを上げる (イメージ> [明るさ/コントラスト>調整>最小および最大のスライダーを動かして画像ヒストグラムを集中させます。 イメージをシャープにする (プロセス > フィルター > アンシャープ マスク >半径 (シグマ) を 1.0 ピクセルに設定し、[マスク ウェイト (0.1 ~ 0.9)] を 0.6 に設定します。 イメージ シーケンスをエクスポートする (画像シーケンス>保存 > [フォーマット] を PNG に設定し、[0から開始]、[数字 (1 ~ 8) を 4 に設定します。 画像をステッチし、局所的な変位を測定し、局所的なサルコメアの長さを計算します。 “TrabeculaProcessing.m” (要求に応じて利用可能) を開き、FolderPath 変数をすべてのデータを含むメインフォルダーに設定し、ImagePath をステップ 4.1.4 のイメージ シーケンスが保存されたフォルダーに設定します。セクションをイメージング ウィンドウとフレームの数に設定し、ウィンドウごとにキャプチャされたフレーム数に設定します。 コードを実行します。注: 出力は、ユーザーが指定した出力フォルダーパスに存在します。(デフォルトでは、パスはフォルダパス/出力に設定されます)。 FFTサルコメア長さ技術 画像処理ソフトウェアを使用して、サルコメアが非常に見える画像の領域でFFTを実行します。 ステップ 1.1.6 の μm キャリブレーション結果のピクセル数に 1.6 μm と 3.0 μm を掛けてから、インバースを計算して対象の空間周波数の範囲を取得します。 ステップ 4.3.2 で計算された周波数範囲の周波数情報を無視して、FFT の結果に指数を合わせ、変換結果からその値を引いて DC 項を削除します。 ガウス曲線を目的の周波数帯に合わせます。 ガウス曲線のピークの逆数を計算します。これは、関心領域の平均サルコメアの長さです。注: FFT 計算と指数方程式とガウス方程式の適合は、カスタムのLabVIEWコードを使用して実行されました。 5. 蛍光データの処理 ウィンドウ依存の自己蛍光をそれぞれのウィンドウから差し引き、340 nm および 380 nm の励起波長に関連する信号の商を計算します。 6. OCT イメージング データの処理 セグメンテーション用に OCT イメージ セットを準備します。 ImageJ を開き、イメージをインポートします (ファイル > インポート > イメージ シーケンス)。ファイル エクスプローラ ウィンドウで、イメージを見つけて選択し、[ 開く] をクリックします。注: OCT のコントロール コードが ImageJ で読み取り可能な形式でイメージを格納しない場合は、PNG に変換します。 視覚化を容易にするために、イメージ シーケンスをハイパースタック (イメージ > ハイパースタック>ハイパースタックからハイパースタック) に整理します。開いたダイアログボックスで、スライスの数をスライスごとのB-スキャンの数に、Xを、柱の長さに沿ったスライスの数に設定します。 柱形を囲む長方形を描きます。ハイパースタックウィンドウのスライダーを使用して、時間をかけてボリューム全体を囲むか確認します。画像をウィンドウにトリミングします (イメージ> トリミング)。 取り付けフックのイメージを含むスライスを削除します (スタック>ツール>スライスキーパー)。トラベキュラ情報のみを含むスライスの範囲を選択します。 WEKA セグメンテーションを訓練します。 WEKA セグメンテーションを開く (プラグイン>セグメンテーション>トレーニング可能な Weka セグメンテーション) 選択モードをフリーハンドに設定します。 [ 設定] をクリックして、分類子とトレーニングの設定を調整します。(このモデルでは、ガウスブラー、ソベルフィルター、ヘッシアン、ガウスの違い、膜投影、両側、リプシッツのトレーニング機能が使用されました。膜厚は1、膜パッチサイズは8、最小シグマは1、最大シグマは32とした。分類子が FastRandomForest に設定され、分類子オプションが設定されました: batchSize 100、最大深度を 32 に、numFeatures を 32 に、numThreads を 0 に、numTrees を 200 にします。 トレーニングが十分なセグメント化になるまで画像を手動でセグメント化します。 分類子を保存します。 処理された B スキャンをセグメント化する ステップ 6.2.1 に続いて WEKA セグメンテーションを起動します。 ステップ 6.2.5 から分類器をロードします。 [ 結果の作成] をクリックします。 イメージを 8 ビット (イメージ > タイプ > 8 ビット) に変換します。 バイナリに画像を変換する (バイナリ>のプロセス > バイナリ>デフォルトの方法とデフォルトの背景を作る. 画像シーケンス (PNG) として保存します。 セグメント化された B スキャン イメージの平均 CSA を計算します。 バイナリB-スキャン画像の白色ピクセル数をカウントします。 ピクセル領域に、キャリブレーション済みの深さ解像度(ステップ 1.2 から)と 10 μm(隣接する A スキャン間の距離)を掛けます。 フック間のすべてのBスキャンについて繰り返し、測定値を平均します。 セグメント化されたイメージをメッシュに変換します。 「OCTmain.m」を開き(リクエストに応じて利用可能)、ステップ6.3.6からの出力を含むフォルダにimageDirectoryを設定します。必要に応じて出力パスを設定します。 スライスを「Range Y (ステップ)」(ステップ 3.5.5)、フレームを「繰り返し X」(ステップ 3.5.6)の値に設定し、深度分解能(ステップ 1.2.10)にz_dimし、x_dim&y_dimを 10 に割り当てられた値に設定します。 [ ファイルを実行 ]をクリックします。