ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo
Summary
פרוטוקול זה מציג אוסף של נתונים גיאומטריים סרקומר, סידן ומקרוסקופיים מ trabecula ex vivoמתכווצת באופן פעיל . מדידות סימולטניות אלה מתאפשרות על ידי שילוב של שלוש שיטות הדמיה.
Abstract
בשריר הלב, Ca2+ ארעי תאיים להפעיל myofilaments התכווצות, גרימת התכווצות, קיצור מקרוסקופי, ועיוות גיאומטרי. ההבנה שלנו של היחסים הפנימיים בין אירועים אלה הוגבלה מכיוון שאיננו יכולים ‘לראות’ בתוך השריר ולא לעקוב במדויק אחר הטבע המרחבי-זמני של דינמיקת עירור-התכווצות. כדי לפתור בעיות אלה, בנינו מכשיר המשלב חבילה של שיטות הדמיה. באופן ספציפי, הוא משלב מיקרוסקופ Brightfield כדי למדוד שינויים מקומיים של אורך sarcomere ומתח רקמות, מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את Ca2 + ארעי, וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית כדי ללכוד את השינויים הגיאומטריים של הרקמה לאורך הזמן של מחזור הלב. אנו מציגים כאן את תשתית ההדמיה ואת מסגרת איסוף הנתונים המשויכת. נתונים נאספים ממבני רקמות מבודדים דמויי מוט המכונה קרנאה trabeculae. במכשיר שלנו, זוג ווים פלטינה הנשלטים על-ידי מיקום מחזיקים כל קצה של דגימת שריר ex vivo בזמן שהוא מועשר ללא הרף בתמיסת מלח עשירה בחומרים מזינים. הקרסים נמצאים תחת שליטה עצמאית, ומאפשרים שליטה בזמן אמת על אורך השריר וכוח. תרגום אורך מאפשר סריקה חלקה של המדגם, התגברות על מגבלות הקשורות לגודל היחסי של חלון הדמיית המיקרוסקופ (540 מיקרומטר על 540 מיקרומטר) ואורך של טרבקולה טיפוסית (>2000 מיקרומטר). אלקטרודות פלטינה משני קצות תא השרירים מעוררות את הטרבקולה בקצב המוגדר על ידי המשתמש. אנו מנצלים את אות הגירוי כגורם מפעיל לסנכרון הנתונים מכל חלון הדמיה כדי לשחזר את כל העוויתות של הדגימה בתנאי מצב יציב. החלת טכניקות עיבוד תמונה על נתוני הדמיה אלה של Brightfield מספקת עקירת רקמות ומפות אורך סרקומר. אוסף כזה של נתונים, כאשר הוא משולב בצינור מידול ניסויים, יספק הבנה עמוקה יותר של הומוגניות התכווצות שרירים והטרוגניות בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה.
Introduction
Superfusion של תכשירי רקמת שריר לב מבודדת הוא פרוטוקול סטנדרטי בשימוש נרחב לחקר הפעלה יונית לב ומכניקה1. בפרט, בידוד של trabeculae, מבנים דמויי מוט מקירות החדר, אפשר הערכה של תופעות כולל הפעלה תלוית אורך של התכווצות 2 ,תגובהתלוית מתיחה של התכווצות3,4, וצמיגות דיאסטולית5 של רקמת לב. טר קורס, היוזם של טכניקה זו של superfusing trabeculae מבודד, השתמש בתחילה בשילוב של הדמיית פלואורסצנטיות עבור מדידות Ca2 + עקיפה לייזר לקביעת אורכים סרקומר2,5. מאז מחקרים מוקדמים אלה, זה הפך נפוץ יותר ויותר כדי לחלץ מידע אורך sarcomere עם רזולוציה מרחבית גדולה יותר באמצעות 2D מהר פורייה טרנספורמציה (FFT) מבוסס טכניקות6 על תמונות מיקרוסקופיה Brightfield. שתי מערכות ההדמיה מאפשרות הערכה חלקית של היחסים הבסיסיים בין שחרור Ca2+ לבין ייצור כוח תלוי אורך Sarcomere.
שריר הלב מפוספס, עם פסים גלויים הקשורים סדרה בסיסית של יחידות התכווצות המורכבות חוטים עבים ועבים. האינטראקציה של חוטים מכוננים אלה המרכיבים sarcomeres ביסוד ייצור כוח, אשר מתחיל כדלקמן: אות חשמלי depolarizing, או פוטנציאל פעולה, גורם למתח תלוי L-סוג Ca2 + ערוצים בקרום התא לפתוח; הזרם התאי שלאחר מכן של Ca2+ עורר את שחרורו של Ca2+ מהניתוק הסרקופלסמי (SR), חנות Ca2+ תאית, בתהליך המכונה Ca2+– המושרה Ca2 + שחרור7; עלייה פתאומית זו בריכוז Ca2+ תאיים מננומולאר לטווח מיקרומולרי מאפשרת לייצור כוח להתרחש; Ca2 + משאבות ללא הרף extrude Ca2 + מתוך cytosol בחזרה לתוך SR ותא חוץ תאי; כאשר ריכוז Ca2+ תאיים חוזר לטווח nanomolar, ייצור כוח מפסיק, ואת השריר מרגיע. במהלך ייצור הכוח, הסיבים העבים והדקים המרכיבים מחליקים זה על זה. אורך הסרקום מכתיב את היקף החפיפה היחסי, ולכן את הפוטנציאל לייצור כוח של השריר מקרוסקופי.
במאמר זה, אנו מרחיבים טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות-brightfield אלה כדי לכלול טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (OCT). OCT מנצל את העיקרון הפיזי של הפרעה ומסוגל להשיג את העיוות הגיאומטרי של הרקמה כדי להבין את ההטרוגניות התכווצות השריר8. המכשיר שלנו(איור 1)משתמש במערכת OCT (SD-OCT) דומיין ספקטרלי. ב-SD-OCT, מפצל קרן מפצל את האור מדיודה בעלת אורך-על קצרה באורך קוהרנטיות לזרועות ייחוס ומדידה. זרוע הייחוס מכילה מראה קבועה, וזרוע המדידה מכילה גלוונומטר 2D כדי לנווט את האור. אור אחורי שנקטף מהדגימה נאסף ומפריע לאור המוחזר בזרוע הייחוס כדי ליצור דפוס הפרעה. מידע העומק מקודד בתדר השוליים הספקטרליים. כדי לחלץ את המידע, האות מועבר דרך ספקטרומטר ו- FFT הפוך מוחל על התוצאה. האות 1D המתאים מייצג את המבנים בעומקים שונים, המתאימים לשינויים באינדקס שבירה9 (A-scan). על ידי היגוי הלייזר בציר יחיד, ניתן לבנות חתך רוחב של מדגם העניין (B-scan) ובאופן דומה, על ידי חזרה על התהליך בתבנית צעד-חכם בציר הנותר, ניתן ליצור תמונה תלת ממדית (C-scan). בהרחבה, ניתן לאסוף סדרה של סריקות B בפרוסה אחת עבור נושא משתנה בזמן חוזר המבוסס על גורם מפעיל חיצוני ולחזור על הפעולה כדי ליצור סריקה תלת ממדית, המייצגת תמונה מצוענת משתנה בזמן10.
בשילוב שלוש מערכות ההדמיה, שקלנו את שני העקרונות הבאים. ראשית, חיישני הדמיה לא צריכים לזהות אור ממודל הדמיה חלופי, ושנית, העיצוב הפיזי צריך להכיל שטח פנוי לשלושה מטוסי הדמיה בו זמנית לפחות. כדי לענות על הדרישה הראשונה, המיקרוסקופ Brightfield משתמש ב-LED אורך גל של 660 ננומטר כדי להאיר את הדגימה בתצורה הפוכה. מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות נמצא בתצורת אפיפלואורסצנטיות שבה אותה עדשה אובייקטיבית משמשת הן לערעור והן לאוסף של האור הנפלט. לאור העירור יש אורך גל של בין 340 ננומטר ל-380 ננומטר, וצינור פוטומולטיפלייר (PMT) מודד את האור הנפלט באורך גל של 510 ננומטר. זוג מראות דיכרוכיות מאפשרים לשני הנתיבים האופטיים הללו לחלוק את אותה טביעת רגל פיזית מבלי להפריע למדידה ההפוכה (איור 2). לבסוף, OCT משתמש בפס רחב (רוחב ספקטרלי של 100 ננומטר) עם אורך גל מרכזי של 840 ננומטר, בנפרד משתי הדרכים האחרות. בשל האופי הנמוך של האור המשמש ל- OCT, כל אור מפוזר ממקורות הפלואורסצנטיות הבהירה לא יתרום לתבנית ההפרעה המקודדת מידע עומק. עבור הדרישה השנייה, עיצוב הדיור עבור הצינור נימי יש מסלולים אופטיים נגישים למישורים הנעשים, הנחותים והנעלים של המדגם. במהלך ניסויים, שני ווים פלטינה להחזיק trabecula בתוך צינור נימי חדור עם פתרון קרבס-Henseleit מחומצן (KH). ראש הגלוונומטר של ה-OCT מכוון באופן אורתוגונלי למסלול ההדמיה של ברייטפילד-פלואורסצנטי כדי לנצל את המישור האופטי האורתוגונל השלישי(איור 3).
מאמר זה מתאר את שיקולי התכנון לבניית מכשיר המסוגל להדמיה בו זמנית סידן, אורך סרקומר וגיאומטריית שרירים. כדי להדגים את יכולות המדידה הללו, אנו מתארים את תהליך בידוד הטרבקולה בחדר, הכנת פתרונות החיץ הדרושים, יחד עם השלבים הקריטיים הכרוכים בטיפול וטעינת פלואורסצנטיות של אקס ויוו טרבקולה. לבסוף, מאמר זה מתאר את התהליכים הדרושים לתרגום ערכת הנתונים לפריטים חזותיים שימושיים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מציגים תצורה המאפשרת הרכבה של שלוש מערכות אופטיות המשלבות ברייטפילד, פלואורסצנטיות והדמיה OCT כדי לאסוף נתונים מטרבקה לבית אקס ויואו (איור 1 ואיור 2). שילוב מתוזמר כזה אפשרי הודות לעיצוב תא המדידה (איור 3) כדי לאפשר את הסידור האורתוגונלי של OCT לציר הפלואורסצנטיות הבהירה. מערכת הרכבת השרירים ממלאת תפקיד חשוב לא פחות בהצלחת כימותים סימולטניים של מדדים מרכזיים באפיון דינמיקת עירור-התכווצות שרירי הלב. החידוש שלו נהדף לאפשר הליכי סריקת שרירים ללא הפרעה נראית לעין לביצועים המכניים של השריר(איור 6). עם תצורת ההדמיה המשולבת ומערכת הקרס הממונע למדידת כוח, מערכת זו יכולה להעריך את ההטרוגניות האזורית באורך הארעי, ההעתקה והסרקום של Ca2+ , יחד עם מידע גיאומטרי מקרוסקופי של טרבקולה מתכווצת לאורך כל מהלך הזמן של העווית (איורים 7 ואיור 8).
בהתחשב בכל מקום של מערכות הדמיה brightfield-epifluorescence בתוך מעבדות מחקר לב, רבייה של תוצאות אלה ניתן להשיג עם כמה שיקולי חומרה קלים. כאן, אנו מציגים את ערכת הכלים לעיבוד תמונה לשילוב של אפיפלואורסצנטיות ברייטפילד ו- OCT, החיונית בניתוח ההטרוגניות התכווצות הבסיסית. השילוב של OCT דורש נתיב אופטי ללא הפרעה, בעוד ההדמיה המגודרת דורשת קו הדק חיצוני בין הגירוי לבין מצלמת ההדמיה OCT ו- Brightfield, ווים להרכבה על השרירים המסוגלים להזיז את הדגימה בכל תא המדידה. התוכנה והשיטות הנדרשות לאחר העיבוד זמינות באופן חופשי. בפרט, תוכנת פילוח בשימוש, WEKA14, הוא קוד פתוח. הטכניקה של מעקב ללא סמן של נקודות חומר 8 ,אורךsarcomere, הדמיה נפחית מגודרת10, וקודי דור רשת נגישים גם הם וניתן להיות זמינים על פי בקשה מהמחבר המתאים.
כדאיות שרירים, טעינה אופטימלית של Fura-2 ומיקוד תמונה הם שלושת העמודים המהווים את היסודות של ניסוי מוצלח. שימוש בתמיסת ביתור המכילה BDM למניעת התכווצות, הובלת השריר במזרק, חמצון מתמשך של הפתרון והכנת פתרונות ניסיוניים חדשים ביום הניסוי, כל אלה תורמים לשיעור כדאיות שרירים גבוה. לפני טעינת trabecula עם Fura-2AM, autofluorescence חייב להיות נאסף עבור כל תנאי אחד מעוניין ללמוד כפי שהוא יכול להיות השפעה משמעותית על Ca2 + ארעי15. חמצון של פתרון טעינת Fura-2AM מסובך על ידי הכללה הכרחית של pluronic-F127 פעילי שטח כדי לסייע טעינת צבע. כדי להילחם היווצרות בועה עודפת שנוצרה הנגרמת על ידי פעילי שטח זה, טיפה קטנה של אנטי קצף בפתרון הטעינה מאפשר למשתמש להגדיל את קצב חמצון, ובכך לשפר את הסיכוי כי trabecula שומר על כדאיות תפקודית לאורך כל תהליך הטעינה. לבסוף, מוקד ההדמיה חייב להיות אחיד לאורך השריר כדי למקסם את יחס האות לרעש של מידע Brightfield ופלואורסצנטיות.
ישנן שתי מגבלות שיש לקחת בחשבון עם השיטות המוצגות כאן. הראשון הוא הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות. בעוד שהרזולוציות המרחביות של הדמיית OCT ו- brightfield גבוהות, הרזולוציה של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות מוגבלת לאינטגרל של הפלואורסצנטיות מהנפח שנתפס בחלון הדמיה של 540 מיקרומטר על 540 מיקרומטר. יש היקף כדי להגדיל את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטיות באמצעות מצלמת התקן מצמיד טעינה גבוהה, במקום PMT, כדי ללכוד את אות הפלואורסצנטי על חשבון אות ליחס רעש16. השני הוא קוטר הטרבקולה שניתן ללמוד במונחים של אורך סרקומר מדיד ועומק גיאומטרי. גישת החלונות-FFT למחשוב אורך סרקומר מנצלת את היתרון של רזולוציה מרחבית משופרת אך קשורה לחוסן מופחת(איור 8D). במקרים שבהם יש לחקור טרבקולה קודרת או בקוטר גדול, פתירה מחדש של FFT תצטמצם מאוד בשל הניגודיות המופחתת הקשורה לרצועות סרקומריות בדגימות רקמות גדולות יותר. כמו כן, בתוך OCT, השתקפויות הגב מעומק הדמיה של יותר מ 300 מיקרומטר יהיה חלש מדי כדי להיפתר במהלך שלב הפילוח. לפיכך, הטכניקה שלנו מוגבלת trabeculae של קוטר פחות מ 300 מיקרומטר. עם זאת, לא מומלץ ללמוד דגימות קוטר גדול כמו ייתכנו בעיות עם חמצון מפוזר של ליבת השריר במהלך שיעורים גבוהים של גירוי17.
השיטה שלנו מאפשרת הערכה של תפקוד מכני יוני בשיתוף עם גיאומטריית שרירים בשרירים בריאים וחולים, ומספקת גישה חזקה להבנת פיזיולוגיה של שריר הלב, פתופיזיולוגיה ופרמקולוגיה. צינור עיבוד התמונה המתואר כאן מחלץ נתונים שיהיו מכריעים להבנה עמוקה יותר של הטרוגניות מתכווצת. אחת הדרכים למימוש מלא של הפוטנציאל של ערכת נתונים כה עשירה היא בבניית מודלים מתמטיים המשלבים ומפרשים נתונים אלה, ולבצע תחזיות שניתן לבחון באופן ניסיוני באמצעות המכשיר שלנו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מלגות דוקטורט מאוניברסיטת אוקלנד (הוענק ל- JD ו- MC), סר צ’ארלס הרקוס מלגות מחקר בריאות (20/011 ו-21/116) מהמועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד (הוענק ל- J-CH ל- KT, בהתאמה), מלגת דוקטורט שהוענקה על ידי קרן הלב הלאומית (הוענקה ל- AA), מענקי התחלה מהירה של מרסדן (UOA1504 ו- UOA1703) מהחברה המלכותית של ניו זילנד (הוענקה ל- J-CH ו- KT, בהתאמה), ומלגת מחקר של ג’יימס קוק מהחברה המלכותית של ניו זילנד (הוענקה ל- AT). הפיתוח המקורי של מכשיר זה מומן על ידי מענק מרסדן (11-UOA-199) מהחברה המלכותית של ניו זילנד (הוענק ל- AT ו- PN).
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
| Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
| Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
| Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
| D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
| DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
| Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
| Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
| FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
| Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
| Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
| Heparin | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
| Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
| Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | Data processing code | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
| Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
| Transimpedance amplifier | Custom | ||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
| Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
References
- Han, J. -. C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
- Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
- Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).
- Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
- Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record – IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
- Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
- Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
- Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).
- Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
- Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
- Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
- Taberner, A., et al. A dynamometer for nature’s engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
- Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
- Han, J. -. C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).
