في وقت واحد برايتفيلد، فلورسينس، والتصوير الطبوغرافي التماسك البصري من التعاقد ترابيكولاي القلب السابق فيفو
Summary
يقدم هذا البروتوكول مجموعة من ساركومير والكالسيوم والبيانات الهندسية العيانية من ترابيكولا القلب المتعاقدة بنشاط مع الجسم الحي السابق. ويمكن إجراء هذه القياسات المتزامنة من خلال دمج ثلاث طرق للتصوير.
Abstract
في عضلة القلب، يقوم العابرون داخل الخلية Ca2+ بتنشيط العضلات العضلية المنقبضة، مما يسبب انكماشا وتقصيرا بالمنظار وتشوها هندسيا. كان فهمنا للعلاقات الداخلية بين هذه الأحداث محدودا لأننا لا نستطيع “الرؤية” داخل العضلة ولا تتبع بدقة الطبيعة الزمنية لديناميكيات الإثارة والانكماش. لحل هذه المشاكل، قمنا ببناء جهاز يجمع بين مجموعة من طرائق التصوير. على وجه التحديد ، فإنه يدمج المجهر مشرق لقياس التغيرات المحلية من طول الساركومير وسلالة الأنسجة ، ومجهر مضان لتصور Ca2 + عابرة ، ودموغرافيا التماسك البصري لالتقاط التغيرات الهندسية للأنسجة طوال الدورة الزمنية لدورة القلب. نقدم هنا البنية التحتية للتصوير وإطار جمع البيانات المرتبط به. يتم جمع البيانات من هياكل الأنسجة المعزولة الشبيهة بالقضبان المعروفة باسم trabeculae carneae. في أداتنا، زوج من السنانير البلاتينية التي تسيطر عليها الموقف عقد كل نهاية عينة العضلات فيفو السابقين في حين يتم فرضه باستمرار مع محلول ملحي الغنية بالمغذيات. السنانير تحت سيطرة مستقلة، مما يسمح السيطرة في الوقت الحقيقي من طول العضلات والقوة. تتيح الترجمة بالطول المسح الضوئي للعينة، والتغلب على القيود المرتبطة بالحجم النسبي لنافذة التصوير بالمجهر (540 ميكرومتر في 540 ميكرومتر) وطول ترابيكولا نموذجي (>2000 ميكرومتر). الأقطاب البلاتينية في أي من طرفي غرفة العضلات تحفز trabecula بمعدل يحدده المستخدم. نحن نستغل إشارة التحفيز كمحفز لمزامنة البيانات من كل نافذة تصوير لإعادة بناء العينة بأكملها في ظل ظروف ثابتة. تطبيق تقنيات معالجة الصور على هذه البيانات التصوير brightfield يوفر إزاحة الأنسجة وخرائط طول الساركومير. ومن شأن هذه المجموعة من البيانات، عند دمجها في خط أنابيب لنمذجة التجارب، أن توفر فهما أعمق لتجانس العضلات الانقباشية وعدم التجانس في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية.
Introduction
Superfusion من مستحضرات أنسجة عضلة القلب المعزولة هو بروتوكول قياسي ويستخدم على نطاق واسع لدراسة تنشيط القلب الأيونية والميكانيكا1. على وجه الخصوص ، فإن عزل trabeculae ، الهياكل الشبيهة بالقضبان من الجدران البطينية ، مكن من تقييم الظواهر بما في ذلك التنشيط المعتمد على الطول للانكماش2، والاستجابة المعتمدة على التمدد للانكماش3،4، واللزوجة الانبساطية 5 منأنسجة القلب. تير Keurs، البادئ من هذه التقنية من الترابكولا المعزولة superfusing، استخدمت في البداية مزيجا من التصوير الفلوري للقياسات Ca2 + والحيود الليزر لتحديد أطوال ساركومير2،5. منذ هذه الدراسات المبكرة ، أصبح من الشائع بشكل متزايد استخراج معلومات طول الساركومير بدقة مكانية أكبر باستخدام تقنيات تحويل فورييه السريعة 2D (FFT) المستندة إلى6 على صور المجهر المشرق. يسمح نظاما التصوير بتقييم جزئي للعلاقة الأساسية بين إطلاق Ca2+ وإنتاج القوة المعتمدة على طول الساركومير.
يتم إعادة محاولة عضلة القلب ، مع ربط مرئية المرتبطة سلسلة الكامنة وراء وحدات انقباش تتكون من خيوط سميكة وسميكة. التفاعل بين هذه خيوط المكونة التي تشكل sarcomeres يكمن وراء توليد القوة، والتي تبدأ على النحو التالي: إشارة كهربائية إزالة الاستقطاب، أو إمكانات العمل، ويسبب الجهد تعتمد على نوع L قنوات Ca2 + في غشاء الخلية لفتح؛ تدفق الخلوية التي تلت ذلك من Ca2 + يحفز الإفراج عن Ca2 + من reticulum الساركوبلازمي (ريال)، وهو مخزن Ca2 + داخل الخلية، في عملية تعرف باسم Ca2 +-المستحث Ca2 + الإصدار7؛ هذه الزيادة المفاجئة في تركيز Ca2 + داخل الخلية من نانومولار إلى نطاق الكائنات الدقيقة تمكن من إنتاج القوة. مضخات Ca2+ تقذف باستمرار Ca2+ من السيتوسول مرة أخرى إلى المقصورة SR وخارج الخلية؛ عندما يعود تركيز Ca2+ داخل الخلية إلى نطاق النانومولار ، يتوقف إنتاج القوة ، وتسترخي العضلات. أثناء إنتاج القوة، تنزلق خيوط سميكة ورقيقة مكونة فوق بعضها البعض. طول الساركومير يملي المدى النسبي للتداخل، وبالتالي، فإن إمكانية إنتاج القوة من العضلات بالمنظار.
في هذه الورقة، نقوم بتوسيع تقنيات التصوير الفلورية-برايتفيلد لتشمل التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). أكتوبر يستخدم المبدأ المادي للتدخل وقادرة على الحصول على تشوه هندسي من الأنسجة لفهم العضلات الانقباش التغايرية8. يستخدم جهازنا(الشكل 1)نظام OCT (SD-OCT) الطيفي. في SD-OCT، يقسم مقسم الحزمة الضوء من صمام ثنائي فائق الوميض قصير النطاق بطول التماسك إلى أذرع مرجعية وقياسية. الذراع المرجعية تحتوي على مرآة ثابتة، وذراع القياس يحتوي على مقياس 2D-galvanometer لتوجيه الضوء. يتم جمع ضوء backscattered من العينة ويتداخل مع الضوء المنعكس في الذراع المرجعية لتشكيل نمط التداخل. يتم ترميز معلومات العمق في تردد هامش الطيفية. لاستخراج المعلومات، يتم تمرير الإشارة من خلال مطياف ويتم تطبيق FFT معكوس على النتيجة. تمثل الإشارة 1D المقابلة الهياكل في أعماق مختلفة ، بما يتوافق مع التغيرات في مؤشر الانكسار9 (A-scan). من خلال توجيه الليزر في محور واحد ، يمكن للمرء بناء مقطع عرضي من عينة من الاهتمام (B – المسح الضوئي) ، وبالمثل ، عن طريق تكرار العملية في نمط خطوة الحكمة في المحور المتبقي ، يمكن إنشاء صورة ثلاثية الأبعاد (C – المسح الضوئي). وبالتالي ، يمكن للمرء أن جمع سلسلة من باء بمسح في شريحة واحدة لتكرار الوقت متفاوتة الموضوع على أساس الزناد الخارجي وتكرار لتوليد مسح ثلاثي الأبعاد ، وهو ما يمثل صورة مخطط متغيرة زمنيا10.
في دمج أنظمة التصوير الثلاثة، قمنا بالنظر في المبدأين التاليين. أولا، لا ينبغي لأجهزة استشعار التصوير أن تكتشف الضوء من طريقة تصوير بديلة، وثانيا، ينبغي أن يحتوي التصميم المادي على مساحة حرة لثلاث طائرات تصوير متزامنة على الأقل. لمعالجة المطلب الأول، يستخدم المجهر برايتفيلد الصمام الطول الموجي 660 نانومتر لإلقاء الضوء على العينة في تكوين مقلوب. المجهر الفلوري هو في تكوين epifluorescence حيث يتم استخدام نفس العدسة الموضوعية لكل من الإثارة وجمع الضوء المنبعث. ضوء الإثارة لديه الطول الموجي بين 340 نانومتر و 380 نانومتر، وأنبوب فوتوموليبير (PMT) يقيس الضوء المنبعث على طول موجي من 510 نانومتر. زوج من المرايا ديكهرويك تمكين هذين المسارين البصرية لتقاسم نفس البصمة المادية دون التدخل في القياس المعاكس(الشكل 2). وأخيرا، يستخدم OCT ضوء النطاق العريض (100 نانومتر عرض الطيفي) مع الطول الموجي المركزي من 840 نانومتر، متميزة عن الطريقتين الأخريين. ونظرا لطبيعة الإضاءة المستخدمة في أكتوبر منخفضة التماسك، فإن أي ضوء متناثر من مصادر التوهج الساطع لن يساهم في نمط التداخل الذي يشفر معلومات العمق. بالنسبة للشرط الثاني ، يحتوي تصميم السكن للأنبوب الشعري على مسارات بصرية يمكن الوصول إليها إلى الطائرات الأمامية والدنيئة والمتفوقة للعينة. خلال التجارب، يحمل خطان بلاتينيان ترابيكولا داخل أنبوب شعري متغلغل في محلول كريبس-هنسيليت (KH) المؤكسيج. رئيس galvanometer من أكتوبر هو موجه بشكل متعامد إلى مسار التصوير مشرق مضان للاستفادة من الطائرة البصرية المتعامدة الثالثة(الشكل 3).
تحدد هذه الورقة اعتبارات التصميم لبناء جهاز قادر على تصوير الكالسيوم وطول الساركومير وهندسة العضلات في وقت واحد. ولإثبات قدرات القياس هذه، فإننا نصف عملية عزل الترابيكولا البطينية، وإعداد الحلول العازلة اللازمة، إلى جانب الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها التعامل مع الترابيكولا في الجسم الحي السابق وتحميلها بفلور. وأخيرا، توضح هذه الورقة العمليات المطلوبة لترجمة مجموعة البيانات إلى مرئيات أكثر فائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، نقدم التكوين الذي يمكن تجميع ثلاثة أنظمة بصرية تجمع بين برايتفيلد، مضان، والتصوير أكتوبر لجمع البيانات من الترابكولا القلب السابقين التعاقد بنشاط(الشكل 1 والشكل 2). مثل هذا التكامل المنظم ممكن بسبب تصميم غرفة القياس (الشكل 3) لتمكين الترتيب المتعامد من أكتوبر إلى محور مشرق الفلورسينس. يلعب نظام تركيب العضلات دورا مهما بنفس القدر في نجاح التحديدات الكمية المتزامنة للمؤشرات الرئيسية في توصيف ديناميكيات انقباض عضلات القلب. تكمن حداثتها في تمكين إجراءات مسح العضلات دون أي اضطراب واضح في الأداء الميكانيكي للعضلات(الشكل 6). مع تكوين التصوير المشترك ونظام الخطاف الآلي لقياس القوة ، يمكن لهذا النظام تقييم التغايرية الإقليمية في Ca2 + عابرة ، والتشريد ، وطول الساركومير ، جنبا إلى جنب مع المعلومات الهندسية العيانية من trabecula التعاقد طوال الدورة الزمنية للارتعاش(الشكلين 7 والشكل 8).
وبالنظر إلى انتشار أنظمة التصوير الساطعة في مختبرات أبحاث القلب، يمكن تحقيق إعادة إنتاج هذه النتائج مع بعض الاعتبارات البسيطة للأجهزة. هنا ، نقدم مجموعة أدوات معالجة الصور للجمع بين برايتفيلد – epifluorescence و OCT ، وهو أمر ضروري في تحليل التغاير الانكماشي الأساسي. يتطلب تكامل OCT مسارا بصريا دون عائق ، في حين يتطلب التصوير المسور خط تشغيل خارجي بين التحفيز وكاميرا التصوير OCT و brightfield ، وخطافات تركيب العضلات القادرة على تحريك العينة في جميع أنحاء غرفة القياس. تتوفر البرامج والأساليب المطلوبة بعد المعالجة مجانا. على وجه الخصوص ، فإن برنامج التقسيم المستخدم ، WEKA14، مفتوح المصدر. تقنية تتبع بدون علامات من النقاط المادية8، طول الساركومير ، التصوير الحجمي المسور10، ورموز توليد الشبكة يمكن الوصول إليها بالمثل ويمكن توفيرها بناء على طلب المؤلف المقابل.
إن قابلية العضلات للحياة، والتحميل الأمثل ل Fura-2، وتركيز الصورة هي الركائز الثلاث التي تشكل أسس تجربة ناجحة. باستخدام محلول تشريح يحتوي على BDM لمنع انقباط ، ونقل العضلات في حقنة ، والأوكسجين المستمر للمحلول ، وإعداد حلول تجريبية جديدة في يوم التجربة ، وكلها تسهم في ارتفاع معدل صلاحية العضلات. قبل تحميل trabecula مع Fura-2AM، يجب أن يتم جمع autofluorescence لكل شرط واحد مهتم في دراسة كما يمكن أن يكون لها تأثير كبير على قياس Ca2 + عابرة 15. إن أكسجة محلول التحميل Fura-2AM معقد بسبب الإدراج الضروري ل pluronic-F127 المتفاعلة على السطح للمساعدة في تحميل الصبغة. لمكافحة تكوين الفقاعة الزائدة الناتجة عن هذا السطحي ، يتيح قطرة صغيرة من الرغوة المضادة في محلول التحميل للمستخدم زيادة معدل الأكسجين ، وبالتالي تحسين فرصة أن يحافظ trabecula على الجدوى الوظيفية طوال عملية التحميل. وأخيرا، يجب أن يكون تركيز التصوير موحدا بطول العضلات لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمعلومات brightfield و fluorescence.
هناك نوعان من القيود للنظر مع الأساليب المعروضة هنا. الأول هو الاستبانة المكانية للمجهر الفلوري. في حين أن القرارات المكانية للتصوير OCT و brightfield عالية ، فإن دقة المجهر الفلوري تقتصر على جزء لا يتجزأ من الفلورسينس من الحجم الذي تم التقاطه داخل نافذة تصوير 540 ميكرومتر في 540 ميكرومتر. هناك مجال لزيادة الدقة المكانية للمجهر الفلوري باستخدام كاميرا جهاز ذات زيادة عالية ، بدلا من PMT ، لالتقاط إشارة الفلورسينس على حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء16. ثانيا هو قطر trabecula التي يمكن دراستها من حيث طول ساركومير قابلة للقياس وعمق هندسي. نهج نافذة -FFT لحساب طول ساركومير يستغل الاستفادة من تحسين الدقة المكانية ولكن يرتبط مع انخفاض متانة(الشكل 8D). في الحالات التي يكون فيها ترابيكولاي عكر أو كبير القطر لدراسة, سيتم تخفيض قابلية حل FFT إلى حد كبير بسبب انخفاض التباين المرتبطة ربط الساركومريك في عينات الأنسجة أكبر. وبالمثل، داخل أكتوبر، فإن الانعكاسات الخلفية من عمق التصوير أكبر من 300 ميكرومتر تكون أضعف من أن يتم حلها خلال مرحلة التقسيم. وبالتالي، يقتصر أسلوبنا على trabeculae قطرها أقل من 300 ميكرومتر. ومع ذلك، فإنه لا ينصح لدراسة عينات قطرها كبيرة كما قد يكون هناك مشاكل مع الأوكسجين نشرها من قلب العضلات خلال معدلات عالية من التحفيز17.
تمكن طريقتنا من تقييم الوظيفة الميكانيكية الأيونية بالتعاون مع هندسة العضلات في العضلات السليمة والممرضة ، مما يوفر نهجا قويا لفهم فسيولوجيا عضلة القلب ، والفيزيولوجيا المرضية ، وعلم الصيدلة. يستخرج خط أنابيب معالجة الصور المبين هنا بيانات ستكون محورية للحصول على فهم أعمق للتغايرية الانقبالية. أحد السبل لتحقيق إمكانات مجموعة البيانات الغنية هذه بشكل كامل هو بناء نماذج رياضية تدمج هذه البيانات وتفسرها ، وإجراء تنبؤات يمكن اختبارها تجريبيا باستخدام جهازنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من منح الدكتوراه من جامعة أوكلاند (التي منحت لJD وMC)، السير تشارلز هيركوس زمالات البحوث الصحية (20/011 و 21/116) من مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا (منحت لJ-CH إلى KT، على التوالي)، منحة دكتوراه تمنحها المؤسسة الوطنية للقلب (تمنح إلى AA)، منح مارسدن للبدء السريع (UOA1504 و UOA1703) من الجمعية الملكية في نيوزيلندا (تمنح إلى J-CH و KT، على التوالي) ، وزمالة أبحاث جيمس كوك من الجمعية الملكية في نيوزيلندا (منحت لمنظمة AT). تم تمويل التطوير الأصلي لهذه الأداة من منحة مارسدن (11-UOA-199) من الجمعية الملكية في نيوزيلندا (تمنح لجمعية AT وPN).
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
| Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
| Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
| Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
| D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
| DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
| Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
| Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
| FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
| Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
| Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
| Heparin | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
| Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
| Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | Data processing code | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
| Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
| Transimpedance amplifier | Custom | ||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
| Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
References
- Han, J. -. C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
- Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
- Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).
- Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
- Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record – IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
- Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
- Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
- Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).
- Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
- Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
- Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
- Taberner, A., et al. A dynamometer for nature’s engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
- Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
- Han, J. -. C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).
