Summary

Transiente Transduktion der strobatierten Formen von Echinococcus granulosus

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Wir beschreiben eine schnelle transiente Transduktionstechnik in verschiedenen Entwicklungsstadien von Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation.

Abstract

Die zystische Echinokokkose oder Hydatiden-Krankheit ist eine der wichtigsten zoonotischen parasitären Erkrankungen, die durch Echinococcus granulosus , einen kleinen Bandwurm, der im Darm von Hunden untergebracht ist, verursacht wird. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung, um die Mechanismen der Pathogenese und der Krankheitsbekämpfung und -prävention zu verstehen. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems behindert jedoch die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich der Echinococcus-Spezies . Die vorliegende Studie zeigt das Potenzial der transienten Transduktion des lentiviralen Gens in den Metazestoden und strobilierten Formen von E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) wurden aus Hydatidenzysten isoliert und auf spezifische biphasische Kulturmedien übertragen, um sich zu strobilierten Würmern zu entwickeln. Die Würmer wurden mit geerntetem Lentivirus der dritten Generation transfiziert, zusammen mit HEK293T-Zellen als Transduktionsprozesskontrolle. Eine ausgeprägte Fluoreszenz wurde bei den strobierten Würmern über 24 h und 48 h nachgewiesen, was auf eine transiente lentivirale Transduktion in E. granulosus hinweist. Diese Arbeit präsentiert den ersten Versuch einer lentivirusbasierten transienten Transduktion in Bandwürmern und zeigt die vielversprechenden Ergebnisse mit möglichen Implikationen in experimentellen Studien zur Plattwurmbiologie.

Introduction

Die zystische Echinokokkose (CE) ist eine der wichtigsten Helminthenerkrankungen, die durch Echinococcus granulosus, einen kleinen Bandwurm innerhalb der Familie Taeniidae 1,2, verursacht wird. Umfangreiche Studien zur Immundiagnostik und Impfstoffentwicklung für E. granulosus wurden durchgeführt. Unzureichende Kenntnisse über die molekularen Grundlagen der Parasitenbiologie stellen jedoch große Einschränkungen bei der Diagnose, Behandlung und Prävention der Hydatidenkrankheitdar 3,4,5,6.

In den letzten Jahren wurden aufgrund der Entwicklung von Genomsequenzierungs- und transkriptomischen Methoden eine breite Palette von molekularen Studien an Plattwürmern von mehreren Forschungsgruppendurchgeführt 7,8,9. In der Welt der Parasiten sind die Fortschritte in der Gentransfertechnologie bei parasitären Plattwürmern jedoch im Vergleich zu den hochreproduzierbaren transienten Transduktionsmethoden, die für einige Protozoen entwickelt wurden, immer noch begrenzt10,11,12.

Der Einsatz viraler Abgabesysteme hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem wesentlichen Instrument für die Transgenabgabe und Gen-/Proteinuntersuchungen entwickelt13. Lentivirus infiziert sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen, wodurch es möglich wird, postmitotische Zellen zu infizieren14,15,16. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung eines Lentivirus-basierten Transduktionssystems in Säugetierzellen das Potenzial bietet, die meisten Einschränkungen früherer Knock-in/Knock-down-Techniken zu überwinden. Das Design und die Konstruktion von lentiviralen Expressionsvektoren mit geeigneten molekularen Markern, wie der GFP-Expression, wurden bereitsbeschrieben 16. Daher untersuchen wir die lentivirale transiente Transduktion eines GFP-Reportergens in den Protoscoleces und strobilierten Würmern von E. granulosus.

Protocol

Diese Studie wurde vom National Institute for Medical Research Development und dem Research Ethics Review Committee, Nr. 958680, genehmigt. Lentiviren werden als BSL-2-Organismen klassifiziert; Daher wurden alle Laborkulturverfahren in diesem Protokoll unter Verwendung steriler Laborpraktiken durchgeführt und unter einer laminaren Durchflusshaube gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Studienprotokolls für die verschiedenen E. gra…

Representative Results

Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente transiente Transduktionstechnik in E. granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Wir kultivierten PSCs in einem biphasischen Kulturmedium, um strobazierte Würmer zu erhalten, wie zuvor beschrieben25,26. Protoscoleces entwickeln sich nach 6 Wochen in vitro zu strobilierten Würmern. Im biphasischen Kulturmedium wurden verschiedene Stadien von E. granulosus</…

Discussion

Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Nematoden und Platyhelminthesbiologie ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenität zoonotischer Parasiten27. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems ist ein großes Hindernis für die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich Echinococcus-Spezies 12,27. Die vorliegende Studie zeigt das ausgezeichnete Potenzial von Lenti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Elite Researcher Grant Committee unter der Preisnummer 958680 des National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran, unterstützt.

Materials

12-well culture plates SPL Life Sciences 30012
25 cm2 culture flask SPL Life Sciences 70325
6-well culture plates SPL Life Sciences 30006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C4901-500G Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium Thermo Fisher Scientific 11530037
CO2 incubator memmert ICO150
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
DMEM Life Technology 12100046
Dog bile Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y Sigma-Aldrich E4009-5G prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS) DNAbiotech DB9723-100ml Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Bovine Serum (FCS) DNAbiotech DB9724-100ml Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells BONbiotech BN_0012.1.14 Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS) Sigma-Aldrich 51558-50ML 2x concentrate
Inverted fluorescence microscope OLYMPUS IX51
Penicillin Sigma-Aldrich P3032-10MU Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin Roche 10108057001 Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS) DNAbiotech DB0011 This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent) Sigma-Aldrich TR-1003-G
RPMI medium BioIdea BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761-1KG
Streptomycin Sigma-Aldrich S9137-25G Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) SBI System Biosciences (BioCat GmbH) CD513B-1-SBI Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) Invitrogen (Life Technologies) K4975-00 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) Addgene Plasmid 12259 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE) DNAbiotech DB9713-100ml
Trypsin Sigma-Aldrich T9935-50MG 1x working solutions (pH 7.4–7.6)

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Mohammadi, M. A., Afgar, A., Faridi, A., Mousavi, S. M., Derakhshani, A., Borhani, M., Fasihi Harandi, M. Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus. J. Vis. Exp. (187), e62783, doi:10.3791/62783 (2022).

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