النقل العابر للأشكال القوية من المشوكات الحبيبية
Summary
نحن نصف تقنية نقل عابرة سريعة في مراحل النمو المختلفة من Echinococcus granulosus باستخدام الجيل الثالث من ناقلات lentivirus.
Abstract
داء المشوكات الكيسي أو مرض الهيداتيد هو واحد من أهم الأمراض الطفيلية الحيوانية المنشأ التي تسببها المشوكات الحبيبية ، وهي دودة شريطية صغيرة تؤوي في أمعاء الأنياب. هناك حاجة ملحة للبحوث الجينية التطبيقية لفهم آليات التسبب في الأمراض ومكافحة الأمراض والوقاية منها. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نظام فعال لتقييم الجينات يعوق التفسير المباشر للوراثة الوظيفية لطفيليات cestode ، بما في ذلك أنواع Echinococcus . توضح هذه الدراسة إمكانات النقل الجيني العابر للفيروسات الخيطية في الأشكال الميتاسيستولية والقوية . تم عزل البروتوسكوليسيس (PSCs) من الخراجات الهيداتية ونقلها إلى وسائط استزراع ثنائية الطور محددة لتتطور إلى ديدان قوية. تم نقل الديدان مع الجيل الثالث من فيروس lentivirus الذي تم حصاده ، إلى جانب خلايا HEK293T كعنصر تحكم في عملية النقل. تم الكشف عن تألق واضح في الديدان القوية على مدار 24 ساعة و 48 ساعة ، مما يشير إلى انتقال فيروسي عابر في E. granulosus. يقدم هذا العمل المحاولة الأولى للنقل العابر القائم على فيروس lentivirus في الديدان الشريطية ويوضح النتائج الواعدة ذات الآثار المحتملة في الدراسات التجريبية على بيولوجيا الدودة المسطحة.
Introduction
داء المشوكات الكيسي (CE) هو واحد من أهم أمراض الديدان الطفيلية التي تسببها المشوكات الحبيبية ، وهي دودة شريطية صغيرة داخل عائلة Taeniidae 1,2. وقد أجريت دراسات مستفيضة عن التشخيص المناعي وتطوير اللقاحات للإشعاع الحبيبي. ومع ذلك ، فإن المعرفة غير الكافية حول الأساس الجزيئي لبيولوجيا الطفيليات تشكل قيودا كبيرة في تشخيص وإدارة والوقاية من مرض hydatid 3,4,5,6.
في السنوات الأخيرة ، بسبب تطور تسلسل الجينوم وطرق النسخ ، تم إجراء مجموعة واسعة من الدراسات الجزيئية على الديدان المسطحة من قبل العديد من المجموعات البحثية7،8،9. ومع ذلك ، في عالم الطفيليات ، لا يزال التقدم في تكنولوجيا نقل الجينات في الديدان المسطحة الطفيلية محدودا مقارنة بطرق النقل العابرة القابلة للتكرار للغاية والتي تم تطويرها لبعض البروتوزوا10،11،12.
وقد برز استخدام أنظمة التوصيل الفيروسي كأداة أساسية لتوصيل الجينات المحورة وتحقيقات الجينات / البروتين على مدى العقدين الماضيين13. يصيب فيروس Lentivirus كلا من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ، مما يجعل من الممكن إصابة الخلايا ما بعد الانقسام14،15،16. تشير الأدلة الحديثة إلى أن استخدام نظام نقل قائم على فيروس lentivirus في خلايا الثدييات يوفر القدرة على التغلب على معظم القيود المفروضة على تقنيات الضربة القاضية / الضربة القاضية السابقة. تم وصف تصميم وبناء ناقلات التعبير lentiviral مع علامات جزيئية مناسبة ، مثل تعبير GFP ، سابقا16. لذلك ، نقوم بتقييم النقل العابر للفيروسات اللينتيفيروسية لجين مراسل GFP في البروتوسكوليسيس والديدان القوية من E. granulosus.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن فهم الأساس الجزيئي للديدان الخيطية وبيولوجيا Platyhelminthes أمر بالغ الأهمية لفهم إمراض الطفيليات الحيوانية المنشأ27. يعد عدم وجود نظام فعال لتقييم الجينات عقبة رئيسية أمام التفسير المباشر لعلم الوراثة الوظيفي لطفيليات cestode ، بما في ذلك أنواع Echinococcus 12,27<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل لجنة منح الباحثين النخبة تحت رقم الجائزة 958680 من المعهد الوطني لتطوير البحوث الطبية (NIMAD) ، طهران ، إيران.
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A., Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
