A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in <em>Drosophila</em>

Joshua D. Walters; Jeffrey S. Hatfield; Brandon B. Baker; Trudy F. C. Mackay; Robert R. H. Anholt

doi:10.3791/62771

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Behavior

Un ensayo de alimentador de microplacas de alto rendimiento para la cuantificación del consumo en Drosophila

Published: June 14, 2021

doi:

10.3791/62771

Joshua D. Walters*¹, Jeffrey S. Hatfield*¹, Brandon B. Baker¹, Trudy F. C. Mackay¹, Robert R. H. Anholt¹

¹Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics,Clemson University

Summary

El ensayo de alimentación de microplacas ofrece un método económico y de alto rendimiento para cuantificar el consumo de alimentos líquidos en Drosophila. Un dispositivo impreso en 3D conecta una microplaca de 96 pozos en la que las moscas se alojan a una microplaca de 1536 pozos de la que las moscas consumen una solución de alimentación con un tinte trazador. La disminución del volumen de la solución se mide espectrofotométricamente.

Abstract

La cuantificación de la ingesta de alimentos en Drosophila se utiliza para estudiar los fundamentos genéticos y fisiológicos de los rasgos asociados al consumo, sus factores ambientales y los efectos toxicológicos y farmacológicos de numerosas sustancias. Pocos métodos implementados actualmente son susceptibles de medición de alto rendimiento. El Microplate Feeder Assay (MFA) fue desarrollado para cuantificar el consumo de alimentos líquidos para moscas individuales utilizando absorbancia. En este ensayo, las moscas consumen un medio alimenticio líquido de pozos seleccionados de una microplaca de 1536 pozos. Al incorporar un colorante trazador diluido en el medio alimentario líquido y cargar un volumen conocido en cada pozo, las mediciones de absorbancia del pozo adquirido antes y después del consumo reflejan el cambio resultante en el volumen (es decir, el volumen consumido). Para permitir el análisis de alto rendimiento con este método, se diseñó un acoplador impreso en 3D que permite clasificar las moscas individualmente en microplacas de 96 pozos. Este dispositivo orienta con precisión las microplacas de 96 y 1536 pozos para dar a cada mosca acceso a hasta 4 pozos para el consumo, lo que permite la cuantificación de la preferencia de alimentos además del consumo regular. Además, el dispositivo tiene tiras de barrera que alternan entre posiciones abiertas y cerradas para permitir la contención controlada y la liberación de una columna de muestras a la vez. Este método permite mediciones de alto rendimiento del consumo de soluciones acuosas por muchas moscas simultáneamente. También tiene el potencial de adaptarse a otros insectos y para detectar el consumo de nutrientes, toxinas o productos farmacéuticos.

Introduction

Drosophila melanogaster ha visto un amplio uso como un organismo modelo genético para estudiar los fundamentos biológicos de la ingesta de alimentos y los rasgos asociados con el consumo¹. Se estima que el 65% de los genes causantes de enfermedades humanas tienen homólogos funcionales en moscas, y una proporción significativa de ellos se expresan en tejidos funcionalmente equivalentes entre moscas y humanos². Además, el tamaño de D. melanogaster, el corto tiempo intergeneracional, el mantenimiento simple y la manejabilidad genética lo convierten en un modelo atractivo para estudios sobre el consumo de nutrientes^3,⁴ y los efectos toxicológicos y farmacológicos de una variedad de sustancias, incluidos insecticidas^5,contaminantes^6,productos farmacéuticos⁷y drogas de abuso^8,^9,¹⁰.

En muchos casos, el estudio de tales rasgos requiere una cuantificación precisa del consumo. Los métodos para cuantificar el consumo son diversos e incluyen el ensayo CApillary FEeder (CAFE)^11,el ensayo MAnual FEeding (MAFE)^12,el ensayo Proboscis Extension Response (PER)^{13, la}extracción de colorante trazador¹⁴^,¹⁵, la extracción del trazador de oligonucleótidos¹⁶y la extracción de radioisótopos⁵^,¹⁷. Los esfuerzos recientes se han centrado en mejorar el rendimiento de estos ensayos, como en el ensayo Expresso¹⁸ o el sistema FLat de alimentación animal entera (WAFFL) basado en^{placas 19}. A pesar de su utilidad, estos ensayos pueden ser complicados, costosos o laboriosos, lo que dificulta su uso en estudios de alto rendimiento.

Figura 1: Componentes del ensayo del alimentador de microplacas. (A) Representación 3D del ensayo de alimentador de microplacas ensamblado. La microplaca de 1536 pozos está orientada por el acoplador impreso en 3D de tal manera que cada pozo de la microplaca inferior de 96 pozos tiene acceso a cuatro pozos de la microplaca superior de 1536 pozos. El acceso a los pozos se puede controlar ajustando la posición de las tiras de barrera ranuradas a través del acoplador. (B) Una representación gráfica de cada pozo del ensayo alimentador de microplacas. Las soluciones de consumo se retienen en cada pozo utilizando una película de sellado que ha sido perforada para permitir el acceso por la mosca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general de los procedimientos en el ensayo de alimentación de microplacas. La figura muestra un diagrama de flujo que corresponde a los pasos 4.1-5.8 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para superar estos obstáculos, el Microplate Feeder Assay (MFA; Figura 1) se desarrolló. En este ensayo, las moscas se alojan individualmente en microplacas de 96 pozos. Cada microplaca se acopla a una microplaca de 1536 pozos utilizando un dispositivo personalizado impreso en 3D. El dispositivo orienta con precisión las dos placas de tal manera que cada mosca en su respectivo pozo de la placa de 96 pozos tiene acceso a 4 pozos de la microplaca de 1536 pozos. Mediante el uso de una placa de 1536 pozos sin fondo y películas de sellado, las soluciones se dispensan en pozos seleccionados y se perforan con agujas precisas de 0,25 mm de diámetro para proporcionar acceso a las moscas. Críticamente, permitir el consumo directamente desde una microplaca permite mediciones inmediatas basadas en la absorbancia utilizando un lector de microplacas. Se incorpora un colorante trazador diluido en el medio de consumo, y el cambio en la absorbancia después de la exposición se utiliza para determinar el volumen consumido(Figura 2 y Figura 3). Dado que el líquido en cada pozo se aproxima a una columna de líquido, las diferencias volumétricas se manifestarán como diferencias en la altura de la columna. (Figura 3A) Según la ley Beer-Lambert²⁰:

donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de absorción molar para el analito atenuante, l es la longitud de la trayectoria óptica y c es la concentración del analito atenuante. Por lo tanto, con un coeficiente de absorción molar y una concentración constantes, los cambios en la absorbancia se deben únicamente a cambios en la trayectoria de la luz óptica, es decir, el nivel de fluido dentro de un pozo dado. Al medir la absorbancia antes y después de la exposición, el cambio proporcional en la absorbancia refleja el cambio proporcional en el volumen(Figura 3B).

Figura 3: Cuantificación basada en la absorbancia del volumen del pozo. (A) Luz incidente de intensidad de entrada conocida (I₀) atraviesa cada pozo. La atenuación de la luz en diferentes volúmenes de llenado produce diferentes intensidades de salida(I),exhibiendo una relación lineal entre volumen y absorbancia. (B) Medición empírica de absorbancia vs. volumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sobre la base del cambio en el volumen, la cantidad de cualquier compuesto ingerido se puede calcular a partir de su concentración conocida en la solución de alimentación. Las piezas necesarias para el ensayo son de bajo costo y tienen un alto grado de reutilización, lo que reduce sustancialmente el costo recurrente del ensayo. Por lo tanto, este procedimiento ofrece un método asequible y de alto rendimiento para cuantificar con precisión el consumo.

Protocol

1. Preparación del plato de inanición Pesar 1,5 g de agarosa en un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml. Añadir 100 ml de H2O destilado al beaker. Microondas intermitentemente hasta que la agarosa esté completamente fundida.NOTA: Observe el beaker ya que la agarosa es propensa a hervir. Vierta la agarosa fundida en un canal de reactivos y dispense 80 μL de agarosa fundida en cada pozo de una microplaca de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Deje que las placas se curen mientras están cubiertas a temperatura ambiente. Refrigere la agarosa sobrante hasta por una semana en una bolsa sellada y vuelva a derretirla para hacer placas adicionales. 2. Clasificación de moscas e inanición Prepare los acopladores insertando tiras de barrera en los canales de la tira de barrera. Si las tiras de barrera están demasiado sueltas, enrollarlas alrededor del dedo para darles curvatura para mantenerlas en los canales. Coloque el acoplador en una placa de inanición. No use el acoplador para manipular la placa, ya que el acoplador puede deslizarse. Asegúrese de que los acopladores estén correctamente orientados (es decir, asegúrese de que la esquina en ángulo del acoplador coincida con la esquina en ángulo de la microplaca). Bajo anestesia de CO2 (Tabla de Materiales),claseste moscas de 3-5 días de edad. Cargue moscas individuales por columna en la placa de inanición.NOTA: Aunque las moscas se cargan por columna, se recomienda distribuir grupos de muestras en las filas de la placa en lugar de columnas hacia abajo (consulte la Figura 4 para ver el ejemplo de diseño de la placa). Cierre cada columna a medida que se llena ajustando su tira de barrera a la posición cerrada. Figura 4:Diseño representativo de la placa de inanición. El diagrama muestra la organización de los controles de evaporación y las moscas macho y hembra en una placa de 96 pomos utilizada en este estudio. También se pueden utilizar configuraciones alternativas, incluidas filas alternas de machos y hembras con controles de evaporación en las filas A y H. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Registre cuidadosamente el diseño de la muestra dentro de la microplaca. Una vez que la placa de inanición esté llena, permita que las moscas se recuperen espontáneamente después de eliminar el CO2 y matarlas de hambre durante 6 h a partir de su tiempo de anestesia inicial. 3. Preparación de alimentos líquidos NOTA: Haga que los alimentos líquidos sean frescos todos los días. Preparar una solución de 10 mg/ml de colorante de FD&C Blue #1 en destilado H2O.NOTA: Esto se puede almacenar a temperatura ambiente por hasta 6 meses. Prepare 10 ml de alimento líquido (4% de sacarosa, 1% de extracto de levadura, 40 μg / ml de FD&C Blue # 1) en un tubo cónico de 15 ml disolviendo 0,4 g de sacarosa y 0,1 g de extracto de levadura en 10 ml de H2O destilado. Vórtice el tubo hasta que los sólidos se disuelvan por completo. Agregue 40 μL de solución de material de colorante e invierta el tubo repetidamente para homogeneizar la solución. Transfiera el alimento líquido a una jeringa de 10 ml con una punta de filtro de 0,45 μm. Filtre ~ 1.5 ml de la solución a la vez en un tubo de microcentrífuga de 1.7 ml. Deje a un lado la jeringa que contiene la solución y filtre la solución adicional según sea necesario durante la preparación de la placa de alimentación. 4. Preparación de la placa de alimentación NOTA: Manipule las placas de alimentación suavemente después del llenado para evitar la formación de burbujas o gotas en el pozo que podrían influir en las lecturas de absorbancia. Prepare una placa alimentadora sellando el fondo de una microplaca de 1536 pozos con una película de sellado. Use una paleta de sellado para adherirse a la película a fondo. Recorte el exceso de película de los bordes izquierdo y derecho con una cuchilla de afeitar. Dispensar 10 μL del alimento líquido filtrado en función de la columna (ver Figura 5 para ilustración) en los pozos apropiados de la microplaca de 1536 pozos. Dispensar en el pozo superior izquierdo para cada grupo de cuatro pozos (ver Figura 5 para ilustración). Figura 5:Orden de llenado y ubicación del pozo para la placa alimentadora de 1536 pozos. El diagrama ilustra el paso 4.2 del protocolo. Las flechas muestran el orden en que la solución de alimentación se introduce en la placa de alimentación una columna a la vez desde la columna 1 hasta la 12. La muestra B1 se magnifica para mostrar un ejemplo de la ubicación de las soluciones de alimentación para ensayos de 1 y 2 opciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Una vez que todos los pozos estén llenos, aplique una película de sellado en la parte superior de la placa. Use una paleta de sellado para adherirse a la película a fondo. Recorte el exceso de película de los bordes izquierdo y derecho con una cuchilla de afeitar. Repita para el número deseado de placas. Centrifugar las placas a 200 x g durante 10 s para asentar el fluido. No permita que la placa se enfríe, ya que esto puede hacer que se acumule condensación en los pozos, oscureciendo las lecturas de absorbancia. 5. Exposición Una vez que las moscas estén listas para el ensayo de consumo, perfore los pozos en la superficie superior de la placa con la herramienta de sonda de aguja equipada con una aguja de 0,25 mm de diámetro. Utilice el mismo orden para perforar que se utilizó al dispensar las soluciones. Voltee la placa y perfore los pozos en la parte inferior. Limpie la aguja entre las soluciones para evitar la contaminación cruzada. Tenga cuidado de no tocar las perforaciones, ya que esto absorbe la solución de los pozos. Lea la absorbancia de la placa a 630 nm sin tapa. Coloque una tapa interna en la película de sellado superior para asegurarse de que los anillos de condensación rodeen los pozos perforados. Coloque la tapa externa en la placa. Coloque la placa de alimentación boca arriba en el acoplador de modo que las guías alineen los orificios apropiados de la placa de alimentación y la placa de inanición. Asegúrese de que el acoplador y las placas estén correctamente orientados (es decir, asegúrese de que la esquina en ángulo del acoplador y las placas coincidan). Envuelva bandas elásticas alrededor de las placas superior e inferior para mantener el acoplador unido. Compruebe si hay alineación y espacios entre la placa de alimentación y el acoplador. Una vez que todas las placas de alimentación estén cargadas en los acopladores, abra los pozos para las placas ajustando las tiras de barrera en el acoplador. Coloque los conjuntos de acopladores/placas en el recipiente secundario. Cada contenedor secundario puede acomodar hasta seis ensamblajes. Coloque la mitad inferior de una caja de pipetas que contenga toallas de papel empapadas en cada recipiente secundario para proporcionar humedad. Cierre la tapa de los contenedores secundarios y transfiéralos a un ambiente controlado (25 °C, humedad controlada, ciclos de luz:oscuridad de 12 h). Deja que las moscas consuman durante 22 h. Después de la exposición de 22 h, verifique cada placa en busca de moscas muertas y actualice el diseño de la placa en consecuencia. Después de revisar todas las placas, anestesia las moscas en masa bombeando CO2 dentro del contenedor secundario. Después de ~ 60 s, asegúrese de que todas las moscas estén inmovilizadas. Apisona suavemente las moscas en la placa de inanición y reemplaza las tiras de barrera de plástico. Retire las placas de alimentación para su lectura. Vuelva a leer la absorbancia de la placa a 630 nm. Repita hasta que se hayan leído todas las placas. 6. Análisis de datos NOTA: El análisis se puede realizar con el paquete de software preferido del investigador. Omita cualquier mosca que haya muerto durante la exposición de 22 h. Para cada pozo, calcule el volumen consumido como:C – Volumen consumido (μL)V – Volumen inicial del pozo (es decir, 10 μL)ABS0 – Absorbancia previa a la exposiciónABS1 – Absorbancia posterior a la exposiciónNOTA: El consumo se denota como un volumen positivo en el cálculo. Para tener en cuenta la evaporación, reste el volumen medio de evaporación de los valores de consumo de mosca dentro de las placas respectivas. Para las pruebas de 2 opciones/preferencias, ajuste cada pozo por su respectiva solución, por ejemplo, ajuste lospolosde “elección 1” por “opción 1” en los controles de evaporación. Después de ajustar por evaporación, deje caer cualquier muestra con un valor de consumo inferior a cero. Para las pruebas de 2 opciones, calcule la preferencia para cada pozo como:P – Índice de preferencias (la dirección positiva indica preferencia)FA – Volumen de alimentos líquidos consumidos que contienen aditivo (Opción 2)FN – Volumen de alimentos líquidos normales consumidos (Opción 1) 7. Protocolo de lavado de microplacas y acopladores. NOTA: Tenga cuidado de evitar daños en la parte inferior de las microplacas, ya que el daño puede afectar el sellado. Retire las películas y las etiquetas de las microplacas de 1536 pozos. Separe los acopladores y las tiras de barrera. Coloque las tiras de barrera en un recipiente sellable, como una botella. Lave las tiras de barrera agitando vigorosamente en una serie de agua tibia del grifo, solución de detergente suave, agua tibia del grifo y luego destila H2O. Enjuague las microplacas y acopladores de 1536 pozos con agua tibia del grifo. Para las microplacas, pase el agua del grifo a través de los pozos de cada microplaca para limpiar la mayor cantidad de solución y escombros como sea posible. Si es necesario, use una punta de pipeta para desalojar los escombros; no use utensilios de metal o vidrio en los platos. Cubra cada plato y acoplador con una solución detergente suave (por ejemplo, Aquet al 1% v/v). Para las placas, frote las superficies con una mano enguantada. Para los acopladores, use un cepillo. Enjuague bien cada plato con agua del grifo y luego con H2O destilado. Asegúrese de que los pozos se enjuaguen específicamente bajo el flujo de agua. Deje que las placas y los acopladores se sequen al aire cubiertos a temperatura ambiente. Guarde en un contenedor de almacenamiento limpio hasta su uso.NOTA: Nunca manipule las microplacas de 1536 pozos sin guantes. Los aceites residuales de la piel pueden dificultar el sellado, lo que lleva a fugas y evaporación del pozo.

Representative Results

Para determinar si existen correlaciones entre los pozos de placas individuales, se cuantificó la evaporación para cada pozo (n = 96 pomos/placa para tres placas). Se encontró que la evaporación era de -0.036 μL ± 0.003 μL (media ± SEM en todo momento). (Figura 6A) Las correlaciones de Pearson se calcularon para evaluar las tendencias entre la evaporación y la ubicación de los pozos. El coeficiente de correlación (Figura 6B,C) para la evaporación frente a las filas fue de -0,04 (p = 0,4949) y para la evaporación frente a las columnas fue de -0,23 (p = 0,0001). Posteriormente, los grupos se distribuyeron entre columnas para mitigar las correlaciones leves pero estadísticamente significativas entre columnas. Figura 6: Evaporación en el MFA. (A) Distribución de densidad de los cambios de evaporación con media ± SD indicada por la línea discontinua. Correlaciones entre evaporación y filas (B) o columnas (C) con el coeficiente de correlación de Pearson y el valor p como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para establecer la validez del protocolo, se cuantificó el consumo de moscas Canton-S B de 3-5 días de edad (n = 36/sexo/placa y n = 24 controles de evaporación/placa para tres placas) (Figura 7). La evaporación entre los pozos de control fue significativamente diferente de cero (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6;una muestra t-prueba vs cero). Se omitieron dos muestras (ambas masculinas) del conjunto de datos, una debido a la muerte durante la exposición durante la noche y la otra debido al valor de consumo negativo después del ajuste por evaporación. Esto produjo una tasa de retención de muestras > del 99%. Figura 7: Cuantificación del consumo utilizando el MFA. (A) El consumo se visualizó utilizando una cámara de vidrio fabricada a medida. Se observaron moscas bebiendo de pozos perforados y exhibieron manchas abdominales azules después de la ingestión de la solución teñida. Véase también el vídeo complementario S.1. (B) Valores de consumo (media ± SEM) entre los controles de evaporación, las moscas macho y las moscas hembra. Se realizó una prueba t post hocpor pares con varianza desigual para las comparaciones estadísticas, con significación indicada por barras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Posteriormente, se construyó un modelo de Análisis de Varianza (ANOVA) descrito por Y = μ + S + P + SxP + e, con Y como media del grupo, μ como media general, S como el efecto fijo del sexo, P como el efecto fijo de la placa, SxP como la interacción entre sexo y placa, y e como la variabilidad residual. ANOVA no mostró variabilidad significativa de placa a placa (p = 0,671) o interacciones específicas del sexo con placas (p = 0,104) para el consumo, mientras que el sexo por sí solo contribuyó significativamente a la variación observada en el consumo (p = 4,17 x 10-18). Una prueba t post hocmostró que los hombres consumieron significativamente menos que las mujeres (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17,dos muestras t-testcon varianza desigual). Para demostrar que el ensayo se puede utilizar para la cuantificación de preferencias de dos opciones, se dio a las moscas la opción entre una solución de sacarosa al 4% con extracto de levadura al 1% y una solución de sacarosa al 4% suplementada con etanol al 15% y extracto de levadura al 1%. Tanto los hombres como las mujeres mostraron una preferencia abrumadora por la solución con etanol y extracto de levadura con índices de preferencia de 0,974 ± 0,026 para los hombres y 0,876 ± 0,06 para las mujeres (promedio ± SEM) (Figura 8). Figura 8: Cuantificación de preferencias utilizando el AMF. Consumo de sacarosa al 4% frente a sacarosa al 4% suplementada con etanol al 15% y extracto de levadura para moscas macho y hembra (n = 33 para cada sexo). Las moscas macho consumieron más de la solución de etanol que la solución de sacarosa de control (0,511 μL ± 0,029 μL frente a 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10;prueba tde dos muestras). Las moscas hembra también consumieron más solución de etanol que la solución de sacarosa de control (0,939 μL ± 0,044 μL frente a 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17;prueba tde dos muestras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Video complementario S.1: El video muestra una mosca alimentándose del pozo perforado y acumulando manchas abdominales azules mientras ingiere la solución teñida. Una imagen fija se muestra en la Figura 7A. Haga clic aquí para descargar este video. Expediente Complementario S.2: Acoplador de ensayo alimentador de microplacas. Esta es una construcción imprimible en 3D del acoplador utilizado en el MFA. Se utilizó material de impresión Nylon PA12 para el MFA. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente Complementario S.3: Tira barrera de ensayo alimentador de microplacas. Esto contiene el diseño de las tiras de barrera de plástico utilizadas para alternar la exposición de las moscas a la placa de alimentación. Un solo acoplador puede utilizar hasta doce tiras de barrera. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario S.4: Instrucciones de desembalaje y fabricación para el ensayo del alimentador de microplacas. Se incluyen instrucciones para desempacar el acoplador y las tiras de barrera. Se incluyen instrucciones de fabricación para la tapa interior, la tapa exterior y el recipiente secundario utilizados para limitar la evaporación durante la exposición. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente complementario S.5:Comparación de costos del ensayo de alimentación de microplacas (MFA) y un ensayo de FEder auxiliar de una sola mosca (CAFE) de 1 elección. Probar 72 moscas/sexo para una sola línea requeriría dos juegos de equipos MFA (acopladores + placas + tiras de barrera), mientras que el CAFE solo necesitaría 1 capilar para cada vial de cultivo. A pesar de la gran diferencia en la inversión inicial para el MFA, la gran diferencia en los costos recurrentes ($ 14.80 vs $ 46.08, respectivamente) permitiría recuperar los costos iniciales después de probar solo 4 líneas (punto de equilibrio). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El estudio describe un nuevo protocolo para cuantificar el consumo en Drosophila:el Microplate Feeder Assay (MFA). En este ensayo, las moscas consumen de pozos sellados de una microplaca de 1536 pomos a través de perforaciones de tamaño controlado(Figura 1, Figura 2; Video complementario S.1). Dado que los alimentos líquidos se tiñen y se proporcionan a través de microplacas, las mediciones de la absorbancia óptica de los alimentos se pueden obtener utilizando un espectrofotómetro de microplacas (Figura 3). De esta manera, el consumo se determina comparando la absorbancia antes y después del consumo, y luego aplicando esta proporción al volumen conocido dispensado antes del consumo. Esto se verificó empíricamente midiendo la absorbancia de diferentes volúmenes del medio teñido (Figura 3B).

Para desarrollar este ensayo, se necesitaba un dispositivo que pudiera aprovechar la cuantificación del consumo basada en la absorbancia. Probar moscas en un formato de microplaca es atractivo porque complementa la microplaca utilizada para dispensar alimentos y permite flexibilidad en la selección de múltiples formatos de placa (por ejemplo, formatos de 6, 12, 48 o 96 pozos) ajustando la geometría del acoplador. Se eligió un formato de microplaca de 96 pozos para permitir el cultivo individual de moscas.

El dispositivo impreso en 3D(Figura 1)orienta con precisión la placa alimentadora de 1536 pozos con la placa de cultivo de 96 pozos, dando a cada mosca acceso a hasta 4 pozos de la placa alimentadora para el consumo. Además, para proporcionar el tiempo adecuado para distribuir moscas en la placa de alojamiento y controlar el inicio del ensayo, el dispositivo incluye tiras de barrera de alternado que contienen las moscas en sus respectivos pozos y la prevención de brechas. Se proporcionan los archivos necesarios para adquirir o modificar estas piezas (Archivos complementarios S.2–S.3), así como las instrucciones de fabricación necesarias para las piezas pertinentes (Archivo complementario S.4).

El MFA proporciona un método simple de alto rendimiento que complementa los métodos más elaborados para monitorear el comportamiento de alimentación de Drosophila¹⁸^,²¹^,²². El MFA ofrece múltiples ventajas sobre otros métodos utilizados para cuantificar la ingesta de alimentos. El rendimiento se incrementa cuantificando el consumo utilizando un lector de placas. Esto elimina las mediciones manuales y evita la entrada manual de datos. Los datos también son susceptibles de extracción y procesamiento programático. Además, el mayor rendimiento aumenta el número factible de réplicas biológicas, particularmente en comparación con los diseños de alimentadores comunales, lo que aumenta sustancialmente el poder para detectar pequeñas diferencias en el consumo. Usando el MFA, un solo experimentador puede cuantificar el consumo o la preferencia de más de 500 moscas por ejecución nocturna del ensayo. Al superponer las ejecuciones del ensayo, se pueden probar más de 2,000 moscas en un período de 5 días. Por último, hay ahorros de costos a largo plazo debido a la reutilización de microplacas y acopladores (Expediente Suplementario S.5). Usando el MFA, el costo estimado por ensayo puede ser tan bajo como $ 14.80, con un costo inicial de $ 127.60 para el equipo. Utilizando el clásico ensayo CApillary FEeder (CAFE), que requiere costosos microcapilarios de precisión, el costo estimado por ensayo para un número comparable de réplicas es de $ 46.08. Por lo tanto, si bien hay una inversión inicial en la adquisición del equipo necesario, la reducción de los costos recurrentes puede conducir a ahorros sustanciales, particularmente en los casos en que se realizan pruebas repetidas.

Al igual que con todos los ensayos, el MFA tiene ciertas limitaciones. Principalmente, requiere acceso a un espectrofotómetro de microplacas capaz de leer microplacas de 1536 pozos. Además, la dependencia de las mediciones de absorbancia para la cuantificación hace que el método sea susceptible a la interferencia óptica. Esto se manifiesta como valores de consumo negativos para un pequeño subconjunto de muestras analizadas. Los nutrientes, medicamentos, productos farmacéuticos o toxinas de interés también deben ser solubles en agua para ser compatibles con el ensayo.

A pesar de sus limitaciones, este método ofrece un método de alto rendimiento para cuantificar los comportamientos de consumo en Drosophila. Además, el dispositivo de acoplamiento podría modificarse fácilmente para aceptar muchos formatos de placa, lo que le permite acomodar una variedad de especies de insectos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (U01 DA041613) a TFCM y RRHA.

Materials

0.25 mm Diameter Needers	Rave Scientific	RS-MN-52-001012
0.45 µm Syringe Filters	Olympus Plastics	25-245
10 mL Disposable Syringe	EXELINT	26200
Agarose	Fisher Scientific	BP1600
Barrier Strips (Laser Cut)	Ponoko	–	Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File:
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625501
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets	Eppendorf	22638041
FD&C Blue #1	Spectrum Chemical Mfg Corp	FD110
Film Sealing Paddle	Fisher Scientific	50-563-280
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	#59-114 and #59-119	CO₂Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate
Microplate Coupler (3D Printed)	Shapeways	–	Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File:
Microplate Lids	Greiner Bio-One	656170
Molecular Devices SpectraMax iD5	Molecular Devices	–	Any microplate reader with 1536-well resolution will do.
Needle Probe Holder	Rave Scientific	RS-MN-52-001000
Polyester Sealing Film	Excel Scientific, Inc.	100-SEAL-PLT
Polystyrene 96-well microplates	Greiner Bio-One	655101
Polystyrene, Bottomless, 15396-well microplates	Greiner Bio-One	783000	Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing.
Rubber Bands
Sucrose	Sigma	S7903
Weather Stripping			1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422

References

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Walters, J. D., Hatfield, J. S., Baker, B. B., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila. J. Vis. Exp. (172), e62771, doi:10.3791/62771 (2021).

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