O ensaio alimentador de microplacos oferece um método econômico de alta produtividade para quantificar o consumo de alimentos líquidos em Drosophila. Um dispositivo impresso em 3D conecta uma microplaca de 96 poços na qual as moscas estão alojadas em uma microplaca de 1536 poços da qual as moscas consomem uma solução de alimentação com um corante rastreador. O declínio do volume da solução é medido espectrofotometricamente.
Quantificar a ingestão alimentar em Drosophila é usado para estudar os fundamentos genéticos e fisiológicos dos traços associados ao consumo, seus fatores ambientais e os efeitos toxicológicos e farmacológicos de inúmeras substâncias. Poucos métodos implementados atualmente são favoráveis à medição de alto rendimento. O Microplate Feeder Assay (MFA) foi desenvolvido para quantificar o consumo de alimentos líquidos para moscas individuais utilizando absorvância. Neste ensaio, as moscas consomem meio de alimentos líquidos de poços selecionados de uma microplaca de 1536 poços. Ao incorporar um corante de rastreador diluído no meio de alimentos líquidos e carregar um volume conhecido em cada poço, as medidas de absorção do poço adquirido antes e depois do consumo refletem a consequente mudança de volume (ou seja, volume consumido). Para permitir uma análise de alto rendimento com este método, um acoplador impresso em 3D foi projetado que permite que as moscas sejam classificadas individualmente em microplacas de 96 poços. Este dispositivo orienta precisamente microplacos de 96 e 1536 poços para dar a cada mosca acesso a até 4 poços para consumo, permitindo assim quantificação da preferência alimentar, além do consumo regular. Além disso, o dispositivo possui faixas de barreira que alternam entre posições abertas e fechadas para permitir a contenção controlada e a liberação de uma coluna de amostras por vez. Este método permite medições de alto rendimento do consumo de soluções aquosas por muitas moscas simultaneamente. Também tem o potencial de ser adaptado a outros insetos e ao consumo de nutrientes, toxinas ou produtos farmacêuticos.
Drosophila melanogaster tem visto amplo uso como organismo modelo genético para estudar os fundamentos biológicos da ingestão alimentar e características associadas ao consumo1. Estima-se que 65% dos genes causadores de doenças humanas tenham homólogos funcionais em moscas, com uma proporção significativa daqueles que estão sendo expressos em tecidos funcionalmente equivalentes entre moscas e humanos2. Além disso, o tamanho de D. melanogaster, o curto tempo intergeracional, a manutenção simples e a tratobilidade genética tornam-no um modelo atraente para estudos sobre o consumo de nutrientes3,4 e efeitos toxicológicos e farmacológicos de uma variedade de substâncias, incluindo inseticidas5, poluentes6,farmacêuticos7, e medicamentos de abuso8,9,10.
Em muitos casos, o estudo de tais características requer uma quantificação precisa do consumo. Os métodos de quantificação do consumo são diversos e incluem o ensaio CApillary FEeder (CAFE)11, o ensaio MAnual FEeding (MAFE)12,oensaio de Resposta à Extensão Proboscis (PER), a extração de corante rastreador14,15, extração do rastreador oligonucleotídeo16e extração de radio-isótopos5,17. Os esforços recentes têm se concentrado em aumentar o rendimento desses ensaios, como no ensaio Expresso18 ou no sistema Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) baseado emplacas 19. Apesar de sua utilidade, esses ensaios podem ser complicados, caros ou intensivos em mão-de-obra, dificultando seu uso em estudos de alto rendimento.
Figura 1: Componentes do ensaio do alimentador de microplacar. (A) renderização 3D do ensaio alimentador de microplato montado. A microplacão de 1536 poços é orientada pelo acoplador impresso em 3D de tal forma que cada poço da microplacão inferior de 96 poços tenha acesso a quatro poços da microplato superior de 1536 poços. O acesso aos poços pode ser controlado ajustando a posição das faixas de barreira ranqueadas através do acoalador. (B) Uma representação gráfica de cada poço do ensaio alimentador de microplacar. As soluções de consumo são retidas em cada poço usando uma haste de vedação que foi perfurada para permitir o acesso pela mosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral dos procedimentos no Ensaio do Alimentador de Microplatos. A figura mostra um diagrama de fluxo que corresponde às etapas 4.1-5.8 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para superar esses obstáculos, o Microplate Feeder Assay (MFA; Figura 1) foi desenvolvido. Neste ensaio, as moscas são alojadas individualmente em microplacas de 96 poços. Cada microplato é acoplado a uma microplacão de 1536 poços usando um dispositivo personalizado impresso em 3D. O dispositivo orienta precisamente as duas placas de tal forma que cada uma voe em seu respectivo poço da placa de 96 poços tem acesso a 4 poços da microplacão de 1536 poços. Usando uma placa sem fundo de 1536 poços e filmes de vedação, as soluções são distribuídas em poços selecionados e perfuradas com agulhas precisas de 0,25 mm de diâmetro para fornecer acesso às moscas. Criticamente, permitir o consumo diretamente de uma microplacão permite medições imediatas baseadas em absorvância usando um leitor de microplacão. Um corante rastreador diluído é incorporado ao meio de consumo, e a mudança na absorção após a exposição é usada para determinar o volume consumido(Figura 2 e Figura 3). Uma vez que o líquido em cada poço se aproxima de uma coluna de fluido, as diferenças volumosas se manifestarão como diferenças na altura da coluna. (Figura 3A) De acordo com a lei Beer-Lambert20:
onde A é a absorvância, ε é o coeficiente de absorção molar para o analito atenuante, l é o comprimento óptico do caminho, e c é a concentração do analito atenuante. Assim, com o coeficiente e concentração constante de absorção molar, as alterações na absorção devem-se unicamente a alterações no caminho da luz óptica, ou seja, o nível de fluido dentro de um dado poço. Medindo a absorvência antes e depois da exposição, a variação proporcional da absorvância reflete a variação proporcional do volume (Figura 3B).
Figura 3: Quantificação baseada em absorvência de volume de poço. (A) A luz incidente da intensidade de entrada conhecida (I0) atravessa cada poço. Atenuação da luz em diferentes volumes de enchimento produz diferentes intensidades de saída(I),exibindo uma relação linear entre volume e absorvância. (B) Medição empírica da absorvância versus volume. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Com base na mudança de volume, a quantidade de qualquer composto ingerido pode ser calculada a partir de sua concentração conhecida na solução de alimentação. As peças necessárias para o ensaio são de baixo custo e têm um alto grau de reutilização, reduzindo substancialmente o custo recorrente do ensaio. Assim, este procedimento oferece um método acessível e de alto rendimento de quantificar precisamente o consumo.
O estudo descreve um novo protocolo para quantificar o consumo em Drosophila: o Ensaio alimentador de microplato (MFA). Neste ensaio, as moscas consomem de poços selados de uma microplaca de 1536 poços através de perfurações de tamanho controlado(Figura 1, Figura 2; Vídeo suplementar S.1). Uma vez que o alimento líquido é tingido e fornecido via microplape, as medidas da absorção óptica do alimento podem ser obtidas por meio de um espectrômetro microplato(Figura 3). Dessa forma, o consumo é determinado comparando a absorvância antes e depois do consumo e, em seguida, aplicando essa proporção ao volume conhecido dispensado antes do consumo. Isso foi verificado empiricamente medindo a absorvância de diferentes volumes do meio tingido(Figura 3B).
Para desenvolver este ensaio, foi necessário um dispositivo que pudesse alavancar a quantificação de consumo baseada em absorvência. O teste voa em formato de microplaca é atraente porque complementa a microplaca usada para dispensar alimentos e permite flexibilidade na seleção de vários formatos de placa (por exemplo, formatos de 6, 12, 48 ou 96 bem) ajustando a geometria do acoplador. Um formato de microplacão de 96 poços foi escolhido para permitir a cultura de moscas individuais.
O dispositivo impresso 3D (Figura 1) orienta precisamente a placa alimentadora de 1536 poços com a placa de cultura de 96 poços, dando a cada mosca acesso a até 4 poços da placa alimentadora para consumo. Além disso, para fornecer tempo adequado para distribuir moscas na placa de habitação e controlar a iniciação do ensaio, o dispositivo inclui faixas de barreira de toggling contendo as moscas em seus respectivos poços e prevenindo violações. Os arquivos necessários para a aquisição ou modificação dessas peças sãofornecidos (Arquivos Suplementares S.2–S.3),bem como as instruções de fabricação necessárias para as peças relevantes(Arquivo Suplementar S.4).
O MFA fornece um método simples de alta produtividade que complementa métodos mais elaborados para monitorar o comportamento alimentar de Drosophila18,21,22. O MFA oferece múltiplas vantagens em relação a outros métodos usados para quantificar a ingestão de alimentos. O rendimento é aumentado quantificando o consumo usando um leitor de placas. Isso elimina as medidas manuais e evita a entrada manual de dados. Os dados também são favoráveis à extração e processamento programáticos. Além disso, o maior rendimento aumenta o número viável de réplicas biológicas, particularmente em comparação com os projetos alimentares comunitários, o que aumenta substancialmente o poder de detectar pequenas diferenças no consumo. Usando o MFA, um único experimentador pode quantificar o consumo ou a preferência de mais de 500 moscas por corrida durante a noite do ensaio. Ao sobrepor as corridas do ensaio, mais de 2.000 moscas podem ser testadas em um período de 5 dias. Por fim, há redução de custos de longo prazo devido à reutilização de microplacas e acopladores(Arquivo Suplementar S.5). Usando o MFA, o custo estimado por ensaio pode ser tão baixo quanto US $ 14,80, com um custo adiantado de US $ 127,60 para o equipamento. Usando o clássico ensaio CApillary FEeder (CAFE), que requer microcapillaries de precisão dispendiosos, o custo estimado por ensaio para um número comparável de réplicas é de US$ 46,08. Assim, embora haja um investimento inicial na aquisição dos equipamentos necessários, a redução dos custos recorrentes pode levar a uma economia substancial, especialmente em casos em que são realizados testes repetidos.
Como em todos os ensaios, o MFA tem certas limitações. Principalmente, requer acesso a um espectrômetro de microplape capaz de ler microplatos de 1536 poços. Além disso, a dependência de medidas de absorção para quantificação torna o método suscetível a interferência óptica. Isso se manifesta como valores de consumo negativos para um pequeno subconjunto de amostras testadas. Nutrientes, medicamentos, fármacos ou toxinas de interesse também devem ser solúveis em água para serem compatíveis com o ensaio.
Apesar de suas limitações, este método oferece um método de alta produtividade de quantificar comportamentos de consumo em Drosophila. Além disso, o dispositivo de acoplamento poderia ser facilmente modificado para aceitar muitos formatos de placa, permitindo-o acomodar uma variedade de espécies de insetos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Nacional de Abuso de Drogas (U01 DA041613) à TFCM e à RRHA.
0.25 mm Diameter Needers | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | – | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | – | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | – | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
Polystyrene, Bottomless, 15396-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
Rubber Bands | |||
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |