ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

1. 飢餓プレートの準備 アガロース1.5gを250mLガラスビーカーに計量します。 100 mLの蒸留H2Oをビーカーに加えます。 アガロースが完全に溶融するまで断続的にマイクロ波。注:アガロースは沸騰しやすいので、ビーカーを観察してください。 溶融アガロースを試薬トラフに注ぎ、多チャネルピペットを使用して96ウェルマイクロプレートの各ウェルに80 μLの溶融アガロースを分配します。室温で覆われながらプレートを治します。残ったアガロースを密閉した袋に入れ、再溶融してプレートを追加します。 2. フライソートと飢餓 バリアストリップチャンネルにバリアストリップを挿入してカプラーを準備します。バリアストリップが緩み過ぎる場合は、指の周りにそれらを巻き付けて、チャネルでそれらを保持するために曲率を与えます。 カプラーを飢餓プレートに貼り付けます。カプラーが滑り落ちる可能性があるため、カプラーを使用してプレートを操作しないでください。カプラーが正しく向きであることを確認します(つまり、カプラの角度付きコーナーがマイクロプレートの斜めのコーナーと一致していることを確認します)。 CO2麻酔(材料表)では、3-5日齢のハエを選別します。個々のハエを柱で飢餓プレートにロードします。注: ハエは列によってロードされますが、下段ではなくプレートの下の行にサンプルのグループを分散することをお勧めします(プレートレイアウトの例については 図 4 を参照)。 各列を閉じ、そのバリア ストリップを閉じた位置に調整して、塗りつぶしに合わせて閉じます。 図4:代表的な飢餓プレートレイアウト この図は、この研究で使用される96ウェルプレートの蒸発制御と男性と女性のハエの組織を示しています。また、行AとHに蒸発制御を有する男女の交互の列を含む代替構成も使用できます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 マイクロプレート内のサンプルレイアウトを注意深く記録します。飢餓プレートが満たされたら、ハエがCO2 を取り除いた後に自発的に回復し、最初の麻酔時間から6時間飢えさせます。 3. 液体食品の準備 注:毎日新鮮な液体食品を作ります。 蒸留したH2OでFD&Cブルー#1の染料ストック溶液10mg/mLを調製します。注:これは、6ヶ月まで室温で保存することができます。 10 mLの液体食品(4%スクロース、1%酵母エキス、FD&Cブルー#1の40 μg/mL)を15 mL円錐形チューブに15 mL円錐管に調製し、10mLのスクロースと0.1gの酵母エキスを10mLの蒸留H2O.Vortexで完全に溶解するまでチューブを溶解します。40 μLの染料ストック溶液を加え、チューブを繰り返し反転して溶液を均質化します。 液体食品を0.45 μmフィルターでチップした10 mLのシリンジに移します。1.7 mLマイクロ遠心分離チューブに一度に溶液の1.5 mLをフィルターします。溶液を含むシリンジを脇に置き、フィーダープレートの調製中に必要に応じて追加の溶液をフィルターします。 4.フィーダープレートの準備 注:充填後にフィーダープレートを優しく取り扱い、吸光度の測定値に影響を与える可能性のあるウェル内の泡や液滴の形成を防ぎます。 1536ウェルマイクロプレートの底部をシールフィルムで密封してフィーダープレートを準備します。シールパドルを使用してフィルムに完全に付着します。カミソリの刃で、左右の端から余分なフィルムをトリミングします。 濾過された液体食品の10 μLをカラム方向に分配し(図 5 を参照)、1536ウェルマイクロプレートの適切なウェルに塗布します。4 つのウェルの各クラスターの左上ウェルに分配します (図は 図 5 を参照)。 図5:1536ウェルフィーダープレートの充填順序と良好な位置 この図は、プロトコルのステップ 4.2 を示しています。矢印は、フィーダプレートに1列ずつ、1列から12列目までの送り液が導入される順序を示す。サンプルB1は、1選択および2選択アッセイのための供給溶液の位置の例を示すために拡大される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 すべての井戸が充填されたら、プレートの上部にシールフィルムを塗布します。シールパドルを使用してフィルムに完全に付着します。カミソリの刃で、左右の端から余分なフィルムをトリミングします。希望するプレート数に対して繰り返します。 プレートを200 x g で10 sで遠心して液体を沈着させます。これは、吸収度の測定値を隠し、凝縮を引き起こす可能性があるため、プレートを冷やすようにしないでください。 5. 露出 ハエが消費アッセイの準備ができたら、直径0.25mmの針を装備した針プローブツールでプレートの上面の井戸を穿孔します。溶液を分配する際に使用したのと同じ順序で穿フォーを行います。プレートをめくり、底の井戸を穿穿けます。クロスコンタミネーションを防ぐために、溶液間の針を拭き取ります。これは井戸からの解決策をウィックとして穿けに触れないように注意してください。 蓋なしで630 nmでプレートの吸光度を読み取ります。 上部のシールフィルムに内部蓋を置き、凝縮リングが穿光井戸を囲むよう確認します。外蓋をプレートに置きます。 ガイドがフィーダープレートと飢餓プレートの適切な穴を揃えるよう、ボンプラーの上にフィーダープレートを向けて配置します。カプラーとプレートが正しく向きであることを確認します(つまり、カプラーの角とプレートが一致していることを確認します)。上部と下部のプレートの周りに弾性バンドをラップし、カプラーを一緒に保持します。フィーダープレートとカプラの間の位置合わせとギャップを確認します。 すべてのフィーダープレートがカプラーにロードされたら、カプラーのバリアストリップを調整してプレートの井戸を開きます。カプラー/プレートアセンブリを 2 次コンテナに配置します。各セカンダリ コンテナは最大 6 つのアセンブリを収容できます。 浸したペーパータオルを入れたピペットボックスの下半分を各二次容器に入れて湿度を提供します。二次容器の蓋を閉じ、制御された環境(25°C、湿度制御、12時間光:暗いサイクル)に移します。ハエが22時間消費することを許可します。 22時間の露出後、各プレートに死んだハエがないか確認し、それに応じてプレートのレイアウトを更新します。すべてのプレートをチェックした後、二次容器の中にCO2をポンピングすることによって、ハエを一斉に麻酔します。~60s後、すべてのハエが固定されていることを確認してください。ハエを飢餓プレートにそっと踏み込み、プラスチック製のバリアストリップを交換します。読み取り用のフィーダープレートを取り外します。 プレートの吸光度を630 nmで再読み込みしてください。すべてのプレートが読み取られるまで繰り返します。 6. データ分析 注: 調査員の推奨ソフトウェア パッケージで分析を実行できます。 22時間の暴露の間に死んだハエを省略する。 各井戸について、消費されるボリュームを次のように計算します。C – 消費されるボリューム (μL)V – 初期ウェルボリューム(すなわち、10 μL)ABS0 – 曝露前吸光度ABS1 – ポストエクスポージャー吸光度注: 消費は計算で正のボリュームとして示されます。 蒸発を考慮するには、それぞれのプレート内のフライ消費量値から平均蒸発量を減算します。2選択/好みのテストの場合は、それぞれの溶液(例えば)によってすべての井戸を調整し、蒸発制御の「選択1」によって「選択1」ウェルを調整します。 蒸発を調整した後、消費値がゼロ未満のサンプルをドロップします。 2 選択テストの場合は、各々の設定を計算します。P – 好み指数(正の方向は好みを示す)FA – 添加物を含む液体食品の消費量(選択肢2)FN – 通常の液体食品の消費量 (選択肢 1) 7.マイクロプレートとカプラー洗浄プロトコル。 メモ:マイクロプレートの底部の損傷がシーリングに影響を与える可能性がありますので、注意してください。 1536ウェルマイクロプレートからフィルムとラベルを取り除きます。カプラとバリアストリップを分離します。ボトルなどの密閉可能な容器にバリアストリップを入れます。一連の温かい水道水、中性洗剤溶液、温かい水道水で激しく揺れ、次いでH2Oを蒸留してバリアストリップを洗います。 暖かい水道水の下で1536ウェルマイクロプレートとカプラーをすすいでください。マイクロプレートの場合は、各マイクロプレートの井戸を通して水道水を流し、できるだけ多くの溶液と破片を取り除きます。必要に応じて、ピペットチップを使用してデブリを取り除きます。プレートに金属やガラスの道具を使用しないでください。 各プレートとカプラーを中性洗剤溶液(例えば、1%対/v Aquet)で覆います。プレートの場合は、手袋をはめた手で表面をこすります。カプラーの場合は、ブラシを使用します。 各プレートを水道水で十分に洗い流し、蒸留したH2O.で井戸が水の流れの下で具体的に洗い流されていることを確認します。 プレートとカプラを室温で乾燥させておきます。使用するまで清潔な保管庫に保管します。メモ:手袋なしで1536ウェルマイクロプレートを扱うことはありません。皮膚からの残留油は密封を妨げ、漏れや蒸発を引き起こす可能性があります。