מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

1. הכנת צלחת רעב שוקלים 1.5 גרם של אגרוז לכוס זכוכית 250 מ”ל. הוסף 100 מ”ל של H2O מזוקקים לכלוב. מיקרוגל לסירוגין עד שאגרוז מותך לחלוטין.הערה: שימו לב לכלוב מכיוון שהאגורוז נוטה לרתוח. יוצקים את האגורוז המותך לתוך שוקת ריאגנט ולחלק 80 μL של אגרוז מותך לתוך כל באר של 96 היטב microplate באמצעות pipette רב ערוצי. אפשר צלחות לרפא בזמן מכוסה בטמפרטורת החדר. מקררים את שאריות האגרוז עד שבוע בשקית אטומה וממיסים אותה מחדש להכנת צלחות נוספות. 2. מיון זבובים ורעב הכן מצמדים על ידי החדרת רצועות מחסום לתוך ערוצי רצועת המכשול. אם רצועות המחסום רופפות מדי, סליל אותם סביב האצבע כדי לתת להם עקמומיות להחזיק אותם בערוצים. הצמיד את המצמד לצלחת רעב. אין להשתמש במצמד כדי לתפעל את הצלחת מכיוון שהמצמד עלול לחמוק. ודא כי המצמדים מכוונים כראוי (כלומר, להבטיח את הפינה הזוויתית של המצמד תואם את הפינה הזוויתית של microplate). תחתהרדמה CO 2(שולחן החומרים),סוג זבובים בני 3-5 ימים. טען זבובים בודדים על ידי עמודה לתוך צלחת הרעב.הערה: למרות שזבובים נטענים לפי עמודה, מומלץ לפזר קבוצות של דוגמאות לאורך שורות של הלוח ולא למטה בעמודות (ראה איור 4 לקבלת דוגמה לפריסת לוח). סגור כל עמודה כשהיא מתמלאת על-ידי התאמת רצועת המחסום שלה למיקום הסגור. איור 4: פריסת לוחית רעב מייצגת. התרשים מראה את הארגון של פקדי אידוי וזבובים זכר ונקבה בצלחת 96 באר המשמשת במחקר זה. תצורות חלופיות, כולל שורות לסירוגין של זכרים ונקבות עם פקדי אידוי בשורות A ו- H, ניתן להשתמש גם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. הקלט בזהירות את פריסת הדגימה בתוך המיקרו-לוח. לאחר צלחת הרעב מתמלא, לאפשר לזבובים להתאושש באופן ספונטני לאחר הסרת CO2 ולהרעיב אותם במשך 6 שעות החל מזמן ההחלמה הראשוני שלהם. 3. הכנת מזון נוזלי הערה: הפוך מזון נוזלי טרי כל יום. הכן 10 מ”ג / מ”ל של פתרון מלאי צבע של FD&C כחול #1 מזוקק H2O.הערה: ניתן לאחסן זאת בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים. הכן 10 מ”ל של מזון נוזלי (4% סוכרוז, 1% תמצית שמרים, 40 מיקרוגרם / מ”ל של FD&C כחול #1) בצינור חרוט 15 מ”ל על ידי המסת 0.4 גרם של סוכרוז ו 0.1 גרם של תמצית שמרים ב 10 מ”ל של Hמזוקק H 2O. מערבולת הצינור עד מוצקים להתמוסס לחלוטין. הוסף 40 μL של פתרון מלאי צבע ולהפוך את הצינור שוב ושוב כדי homogenize הפתרון. מעבירים את המזון הנוזלי למזרק של 10 מ”ל עם מסנן של 0.45 מיקרומטר. מסנן ~ 1.5 מ”ל של הפתרון בכל פעם לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ”ל. מניחים בצד את המזרק המכיל את הפתרון ומסננים את הפתרון הנוסף לפי הצורך במהלך הכנת צלחת ההזנה. 4. הכנת צלחת מאכילה הערה: לטפל בלוחות המאכיל בעדינות לאחר המילוי כדי למנוע היווצרות של בועות או טיפות בבאר שיכול להשפיע על קריאות הספיגה. הכן צלחת מאכילה על ידי איטום החלק התחתון של מיקרו-לוח 1536-well עם סרט איטום. השתמש במשוט איטום כדי לדבוק בסרט ביסודיות. גזור סרט עודף מהקצה השמאלי והיומי עם סכין גילוח. יש לחלק 10 μL של עמודת המזון הנוזלי המסוננת (ראה איור 5 להמחשה) לבארות המתאימות של המיקרו-לוח 1536-well. יש לחלק לבאר השמאלית העליונה כל אשכול של ארבע בארות (ראו איור 5 להמחשה). איור 5: מלאו סדר ומיקום טוב לצלחת ההזנה 1536-well. הדיאגרמה מדגימה את שלב 4.2 של הפרוטוקול. החצים מציגים את הסדר שבו מוצג פתרון ההזנה בלוח המאכיל עמודה אחת בכל פעם מעמודה 1 עד 12. מדגם B1 מוגדל כדי להציג דוגמה למיקום פתרונות הזנה לבדיקות של בחירה אחת ו-2 אפשרויות בחירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. לאחר כל בארות הם מלאים, להחיל סרט איטום על החלק העליון של הצלחת. השתמש במשוט איטום כדי לדבוק בסרט ביסודיות. גזור סרט עודף מהקצה השמאלי והיומי עם סכין גילוח. חזור על הפעולה לקבלת מספר הצלחות הרצוי. צנטריפוגות את הצלחות ב 200 x g עבור 10 s כדי ליישב את הנוזל. אל תאפשר את הצלחת להיות צונן מאז זה יכול לגרום עיבוי להצטבר בבארות, טשטוש קריאות ספיגה. 5. חשיפה ברגע הזבובים מוכנים לבדיקת הצריכה, לנקב את בארות על פני השטח העליון של הצלחת עם כלי בדיקה מחט מצויד מחט בקוטר 0.25 מ”מ. השתמש באותו סדר כדי לנקב כפי שהיה בשימוש בעת חלוקת הפתרונות. הופכים את הצלחת ומנקבים את הבארות בתחתית. לנגב את המחט בין פתרונות כדי למנוע זיהום צולב. היזהר לא לגעת ניקובים כמו זה מנדף את הפתרון מן הבארות. קרא את ספיגת הצלחת ב 630 ננומטר ללא מכסה. מניחים מכסה פנימי על סרט האיטום העליון כדי להבטיח שטבעות ה עיבוי יכתרו את בארות המחוררות. מניחים את המכסה החיצוני על הצלחת. מניחים את צלחת המאכיל עם הפנים כלפי מעלה על המצמד כך שהמדריכים מיישרים את החורים המתאימים של צלחת ההזנה וצלחת הרעב. ודא כי המצמד והצלחות מכוונים כראוי (כלומר, להבטיח את הפינה הזוויתית של המצמד ואת הצלחות תואמות). עוטפים רצועות אלסטיות סביב הלוחות העליונים והתחתונים כדי להחזיק את המצמד יחד. בדוק אם יש יישור ורווחים בין לוחית המאכיל למצמד. לאחר שכל לוחות המאכילים נטענים על המצמדים, פתחו את בארות הלוחות על ידי התאמת רצועות המחסום במצמד. מניחים את מכלולי המצמד/הצלחת במיכל המשני. כל מיכל משני יכול להכיל עד שש מכלולים. מניחים את החצי התחתון של קופסת פיפטה המכילה מגבות נייר ספוגות בכל מיכל משני כדי לספק לחות. סגור את המכסה של המיכלים המשניים והעביר אותם לסביבה מבוקרת (25 °C (25 °C (25 °C), מבוקר לחות, 12 שעות אור:מחזורים כהים). אפשר לזבובים לצרוך במשך 22 שעות. לאחר החשיפה של 22 שעות, בדקו כל צלחת עבור זבובים מתים ועדכנו את פריסת הצלחת בהתאם. לאחר כל הצלחות נבדקים, למרדים את הזבובים בהמוניהם על ידי שאיבת CO2 בתוך המיכל המשני. לאחר ~ 60s, ודא כי כל הזבובים משותקים. יש לדחוס בעדינות את הזבובים לתוך צלחת הרעב ולהחליף את רצועות מחסום הפלסטיק. הסר את לוחות המאכיל לקריאה. קרא מחדש את ספיגת הצלחת ב-630 ננומטר. חזור על הפעולה עד שכל הצלחות נקראו. 6. ניתוח נתונים הערה: ניתן לבצע ניתוח באמצעות חבילת התוכנה המועדפת על החוקר. השמט את כל הזבובים שמתו במהלך החשיפה של 22 שעות. עבור כל באר, חשב את אמצעי האחסון הנצרך כ:C – נצרך אמצעי אחסון (μL)V – נפח באר ראשונית (כלומר, 10 μL)ABS0 – ספיגה לפני חשיפהABS1 – ספיגה לאחר חשיפההערה: הצריכה מסומנת כאמצעי אחסון חיובי בחישוב. כדי להסביר אידוי, הפחת את נפח האידוי הממוצע מערכי צריכת זבובים בתוך לוחות בהתאמה. לבדיקת 2 אפשרויות/העדפות, התאימו כל באר לפי הפתרון המתאים לה,למשל, התאימו את בארות “בחירה 1” לפי “בחירה 1” בפקדי האידוי. לאחר ההתאמה לאידוי, שחררו את כל הדגימות עם ערך צריכה קטן מאפס. לבדיקות של 2 אפשרויות, חשב את ההעדפה עבור כל אחד מהן וכן:P – אינדקס העדפות (כיוון חיובי מציין העדפה)FA – נפח של מזון נוזלי הנצרך המכיל תוסף (בחירה 2)FN – נפח של מזון נוזלי רגיל נצרך (בחירה 1) 7. פרוטוקול שטיפת מיקרופלסטים ומצמדים. הערה: יש להקפיד למנוע נזק לתחתית המיקרו-לוחות, שכן נזק עלול להשפיע על האיטום. הסר את הסרטים והתוויות מהמיקרו-לוחות של 1536 באר. הפרד את המצמדים ואת רצועות המחסום. מניחים את רצועות המכשול במיכל אטום, כגון בקבוק. לשטוף את רצועות המכשול על ידי רועד במרץ בסדרה של מי ברז חמים, פתרון דטרגנט קל, מי ברז חמים, ולאחר מכן מזוקק H2O. יש לשטוף 1536 מיקרו-לוחות ומצמדים במי ברז חמים. עבור מיקרו-לוחות, הפעל מי ברז דרך הבארות של כל מיקרו-לוח כדי לפנות כמה שיותר פתרונות ופסולת. במידת הצורך, השתמש בקצה פיפטה כדי להעביר פסולת; אין להשתמש בכלי מתכת או זכוכית על הצלחות. מכסים כל צלחת ומצמד עם פתרון דטרגנט קל (למשל, 1% v / v Aquet). עבור הצלחות, לשפשף את המשטחים עם יד בכפפה. למצמדים, יש להשתמש במברשת. לשטוף כל צלחת ביסודיות עם מי ברז, ולאחר מכן עם מזוקק H2O. להבטיח כי בארות נשטפות במיוחד מתחת לזרימת המים. אפשרו לצלחות ולזוגות להתייבש בטמפרטורת החדר. יש לאחסן בסל אחסון נקי עד לשימוש.הערה: לעולם אל תטפל במיקרו-לוחות 1536-well ללא כפפות. שאריות שמנים מהעור עלולים לעכב איטום, מה שמוביל לדליפת בארות ואידוי.