מדידות העברת אנרגיה תהודה Förster בתאי צמח חיים
Summary
פרוטוקול מסופק להגדרת מיקרוסקופ סטנדרטי לסריקת לייזר קונפוקלית למדידות העברת אנרגיה תהודה של vivo Förster, ולאחריו הערכת נתונים.
Abstract
ניסויי העברת אנרגיית תהודה (FRET) מבוססי פליטה רגישים נעשים בקלות אך תלויים במערך המיקרוסקופי. מיקרוסקופי סריקת לייזר קונפוקליים הפכו לסוס עבודה לביולוגים. מערכות מסחריות מציעות גמישות גבוהה בהתאמת כוח לייזר וברגישות לגלאיים ולעתים קרובות משלבות גלאים שונים כדי להשיג את התמונה המושלמת. עם זאת, ההשוואה של נתונים מבוססי עוצמה מניסויים והגדרות שונות היא לעתים קרובות בלתי אפשרית בשל גמישות זו. נהלים ידידותיים לביולוגים הם יתרון ומאפשרים התאמה פשוטה ואמינה של הגדרות לייזר וגלאי.
יתר על כן, כמו ניסויי FRET בתאים חיים מושפעים השונות ביטוי חלבון ויחסי מקבל תורם, רמות ביטוי חלבון חייב להיחשב להערכת נתונים. מתואר כאן פרוטוקול פשוט למדידות FRET אמינות ושחזוריות, כולל שגרות להערכת ביטוי חלבון והתאמה של עוצמת הלייזר והגדרות הגלאי. הערכת נתונים תבוצע על ידי כיול עם היתוך פלואורופור של יעילות FRET ידועה. כדי לשפר את הפשטות, גורמי תיקון הושוו כי הושגו בתאים ועל ידי מדידת חלבונים פלואורסצנטיים רקומביננטיים.
Introduction
העברת אנרגיית תהודה Förster ((F)RET) הוא נצפה בדרך כלל על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית, אם כי התהליך עצמו אינו מוגבל להתרחש בין פלואורופורים. צימוד הדיפול-דיפול הבסיסי פשוט דורש מולקולת תורם פולטת אור ומקבל סופג אור. זה נגזר מהחופה הספקטרלית הנדרשת אינטגרל J של פליטת התורם מנורמל וספקטרום ספיגת מקבל1. עם זאת, מכיוון ש-RET מתחרה בפלואורסצנטיות, העברת האנרגיה הופכת למדידה על ידי שינויים בפליטת פלואורסצנטיות: RET גורמת להרוות תורמים ולפליטת קבלים רגישה.
RET מבוסס פלואורופור זכה לכינוי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי להפריד אותו מהעברת אנרגיית תהודה ביו-לומינציה (BRET). RET תלוי מאוד על המרחק בין התורם ומקבל, אשר נמצא באופן נרחב בטווח של 0.5-10 nm2 ולכן, באותו טווח כמו מידות החלבונים והמתחמים שלהם. שנית, RET תלויה בקאפה בכיוון דיפול-דיפול בריבוע. בשילוב עם העובדה כי חופש סיבובי של פלואורופורים הקשורים לחלבון ניתן להזניח בשל המשקל המולקולרי ואת הרפיה סיבובית איטית, RET מאפשר ניתוח של שינויים קונפורמיים3.
מה שמכונה רדיוס Förster מבוסס על אינטגרל החפיפה הספקטרלית וטווח אורך הגל של החפיפה, כך שכרומופורים סופגי אור אדום גורמים לראדי Förster ארוך יותר מאשר צבעים סופגי אור כחולים. מכיוון שהטווח הדינמי של מדידות FRET מוגבל ב- 0.5 × R0 ו- 1.5 × R0, לזוג FRET ECFP-EYFP יש טווח דינמי של 2.5-7.3 ננומטר בשל R0 של 4.9 nm4.
הבהירות של פלואורופור ניתנת על ידי תוצר מקדם ההכחדה הטוחנת שלו והתשואה הקוונטית שלו. עבור מדידות FRET, כדאי לבחור פלואורופורים של בהירות כמעט דומה. זה משפר את הזיהוי של מרווה תורם ופליטת קבלה רגישה. זה גם מעדיף את הכיול של מערכת המיקרוסקופיה. כשמסתכלים על זוגות FRET הנפוצים של חלבוני ציאן ופלואורסצנטי, הבהירות הנמוכה יותר של חלבוני הציאן פלואורסצנטיים הופכת לברורה (איור 1A).
עם זאת, אורך החיים של המקבל חייב להיות נמוך יותר מחייו של התורם, הבטחת הזמינות של הקבלן להעברת אנרגיה. אם חייו של המקבל עולים על חייו של התורם, המקבל עשוי עדיין להיות במצב הנרגש כאשר התורם מתרגש שוב. חלבונים פלואורסצנטיים ציאן מתקדמים כגון mTurquoise מראים אורך חיים ממושך ובכך תורמים להסתברות מוגברת של FRET (איור 1B). ההסתברות של FRET תלויה גם במקדם ההכחדה הטוחנת של המקבל.
Protocol
Representative Results
Discussion
מרווה תורם ופליטת קבלה רגישה מאופיינים במערכת יחסים ליניארית המאפשרת חישוב מבוסס תורם או קבלה של FRET. הגורמים המתאימים של ליניאריות נקראים גורם G (תורם לקבל) או xi (מקבל לתורם), שהם ערכים הדדיים4. מדידת FRET בין חלבונים פלואורסצנטיים על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטית דורשת לעתים קר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הניסויים בוצעו בפלטפורמה הטכנולוגית ליור מיקרוסקופיה (LiMiTec) של הפקולטה לביולוגיה, אוניברסיטת בילפלד. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת בילפלד.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
