Förster Resonanz-Energietransfermessungen in lebenden Pflanzenzellen
Summary
Es wird ein Protokoll für die Einrichtung eines konfokalen Standard-Laser-Scanning-Mikroskops für in vivo Förster-Resonanzenergieübertragungsmessungen mit anschließender Datenauswertung bereitgestellt.
Abstract
Experimente mit sensibilisierter Emissionsbasis des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) sind einfach durchzuführen, hängen jedoch vom mikroskopischen Aufbau ab. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskope sind zu einem Arbeitstier für Biologen geworden. Kommerzielle Systeme bieten eine hohe Flexibilität bei der Laserleistungsanpassung und Detektorempfindlichkeit und kombinieren oft verschiedene Detektoren, um das perfekte Bild zu erhalten. Der Vergleich von intensitätsbasierten Daten aus verschiedenen Experimenten und Aufbauten ist aufgrund dieser Flexibilität jedoch oft unmöglich. Biologenfreundliche Verfahren sind von Vorteil und ermöglichen eine einfache und zuverlässige Anpassung der Laser- und Detektoreinstellungen.
Da FRET-Experimente in lebenden Zellen von der Variabilität der Proteinexpression und des Spender-Akzeptor-Verhältnisses beeinflusst werden, müssen Proteinexpressionsniveaus für die Datenauswertung berücksichtigt werden. Beschrieben wird hier ein einfaches Protokoll für zuverlässige und reproduzierbare FRET-Messungen, einschließlich Routinen zur Abschätzung der Proteinexpression und Anpassung der Laserintensität und der Detektoreinstellungen. Die Datenauswertung erfolgt durch Kalibrierung mit einer Fluorophorfusion bekannter FRET-Effizienz. Um die Einfachheit zu verbessern, wurden Korrekturfaktoren verglichen, die in Zellen und durch Messung rekombinanter fluoreszierender Proteine erhalten wurden.
Introduction
Der Förster-Resonanzenergietransfer ((F)RET) wird typischerweise durch Fluoreszenzspektroskopie beobachtet, obwohl der Prozess selbst nicht auf die Durchführung zwischen Fluorophoren beschränkt ist. Die zugrunde liegende Dipol-Dipol-Kopplung erfordert lediglich ein lichtemittierendes Donormolekül und einen lichtabsorbierenden Akzeptor. Dies leitet sich aus dem erforderlichen spektralen Überlappungsintegrat J der normierten Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren1 ab. Da RET jedoch mit der Fluoreszenz konkurriert, wird der Energietransfer durch Änderungen der Fluoreszenzemission messbar: RET induziert Donorabschreckung und sensibilisierte Akzeptoremission.
Fluorophor-basierte RET wurde als Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) bezeichnet, um sie von der Biolumineszenz-Resonanz-Energieübertragung (BRET) zu trennen. Die RET hängt stark vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor ab, der weit im Bereich von 0,5-10 nm2 liegt und damit im gleichen Bereich wie die Abmessungen von Proteinen und ihren Komplexen liegt. Zweitens hängt die RET von der Dipol-Dipol-Orientierung kappa im Quadrat ab. In Kombination mit der Tatsache, dass die Rotationsfreiheit von proteingebundenen Fluorophoren aufgrund des Molekulargewichts und der langsamen Rotationsrelaxation vernachlässigt werden kann, ermöglicht RET die Analyse von Konformationsveränderungen3.
Der sogenannte Försterradius basiert auf dem spektralen Überlappungsintegral und dem Wellenlängenbereich der Überlappung, so dass rotlichtabsorbierende Chromophore zu längeren Försterradien führen als blaulichtabsorbierende Farbstoffe. Da der Dynamikbereich der FRET-Messungen durch 0,5 × R0 und 1,5 × R0 begrenzt ist, hat das FRET-Paar ECFP-EYFP aufgrund seines R0 von 4,9 nm4 einen Dynamikbereich von 2,5-7,3 nm.
Die Helligkeit eines Fluorophors ist durch das Produkt seines molaren Extinktionskoeffizienten und seiner Quantenausbeute gegeben. Für FRET-Messungen ist es vorteilhaft, Fluorophore mit nahezu ähnlicher Helligkeit zu wählen. Dies verbessert den Nachweis von Donorabschreckung und sensibilisierter Akzeptoremission. Es begünstigt auch die Kalibrierung des Mikroskopiesystems. Betrachtet man die häufig verwendeten FRET-Paare von Cyan- und fluoreszierenden Proteinen, wird die geringere Helligkeit der cyanfluoreszierenden Proteine deutlich (Abbildung 1A).
Die Lebensdauer des Akzeptors muss jedoch niedriger sein als die Lebensdauer des Spenders, um die Verfügbarkeit des Akzeptors für die Energieübertragung sicherzustellen. Wenn die Lebensdauer des Akzeptors die Lebensdauer des Spenders überschreitet, befindet sich der Akzeptor möglicherweise noch im angeregten Zustand, wenn der Spender erneut angeregt wird. Fortschrittliche cyan fluoreszierende Proteine wie mTurquoise zeigen eine verlängerte Lebensdauer und tragen somit zu einer erhöhten WAHRSCHEINLICHKEIT von FRET bei (Abbildung 1B). Die Wahrscheinlichkeit einer FRET hängt auch vom molaren Extinktionskoeffizienten des Akzeptors ab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Donorabschreckung und die sensibilisierte Akzeptoremission zeichnen sich durch eine lineare Beziehung aus, die eine donor- oder akzeptorbasierte Berechnung der FRET ermöglicht. Die entsprechenden Faktoren der Linearität werden entweder G-Faktor (Donor zu Akzeptor) oder xi (Akzeptor zu Donor) genannt, die reziproke Werte sind4. Die Messung des FRET zwischen fluoreszierenden Proteinen mittels Fluoreszenzmikroskopie erfordert aufgrund der breiten Absorptions- und Emissionsspektren der fluoreszi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Experimente wurden an der Technologieplattform Lichtmikroskopie (LiMiTec) der Fakultät für Biologie der Universität Bielefeld durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Universität Bielefeld gefördert.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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