Développement d’une bande immunochromatographique à flux latéral pour la détection rapide et quantitative de composés de petites molécules
Abstract
Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour l’autodiagnostic à faible coût et ont été appliquées efficacement à la détection des toxines, de l’indice physiologique et des biomarqueurs cliniques. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée des étapes de développement d’un immunodosage rapide, sensible et quantitatif à flux latéral (en utilisant les AuNPs comme marqueur et les mAbs comme sonde). La procédure décrit la préparation et la caractérisation de l’or colloïdal, la synthèse du conjugué AuNP-mAb, l’assemblage de la bande immunochromatographique et l’étude méthodologique du test. Les résultats ont montré que les bandelettes finales peuvent être utilisées pour l’autodiagnostic rapide et pratique d’une petite molécule, ce qui peut fournir un outil alternatif dans l’analyse rapide et précise des indices physiologiques et biologiques.
Introduction
Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour une détection rapide et à faible coût. La membrane de nitrocellulose en tant que support et l’or colloïdal en tant que marqueurs des réactifs de diagnostic rapide par chromatographie immunitaire sont la méthode POCT (point of care testing) la plus couramment utilisée, et la portée des tests du projet est plus large. Depuis leur application initiale dans la surveillance pendant la grossesse, leur utilisation a été étendue pour surveiller l’état de coagulation sanguine1,2, les lésions myocardiques3, la médecine vétérinaire4, les résidus de pesticides5, les maladies infectieuses6 et les concentrations de médicaments. D’autres types d’échantillons peuvent être évalués, y compris l’urine, la salive, le sang total, le sérum et d’autres fluides corporels7,8,9.
Au cours des dernières années, de nombreux nouveaux tests ont été développés pour détecter les biomarqueurs dans le diagnostic des troubles, y compris HPLC, UPLC, LC-MS et ELISA, qui sont sensibles et précis, crédibles et spécifiques. Cependant, ces méthodes nécessitent une instrumentation sophistiquée, un prétraitement complexe et des traitements chronophages9. Par conséquent, le développement d’une stratégie de diagnostic au point de service plus rapide et plus pratique pour la détection en temps réel et en temps réel des composés actifs médicinaux est urgent10,11.
La popularité des ICS, en particulier pour les tests courants, est motivée par leur facilité d’utilisation, car ils ne nécessitent pas de professionnels ou de configurations instrumentales élaborées12. En d’autres termes, les personnes qui n’ont pas de formation spéciale peuvent utiliser des bandelettes ou des auto-tests13. Les résultats du test peuvent être obtenus en 5 minutes, ce qui signifie qu’il peut être utilisé pour des inspections de site14. De plus, selon nos calculs, le coût des bandes pourrait être inférieur à 1 RMB15, ce qui signifie que les tests sont peu coûteux pour promouvoir16. Par conséquent, l’ICS est un appareil jetable relativement précis, simple et peu coûteux. Les ICS basés sur l’or colloïdal17,18 sont également appliqués dans la détection rapide de la COVID-19.
Le principe de l’ICS peut être divisé en ICS sandwich et ICS compétitif. La figure 1A est un diagramme schématique du SCI sandwich, qui est principalement utilisé pour détecter les substances macromoléculaires telles que les protéines, y compris les marqueurs tumoraux, les facteurs inflammatoires et la gonadotrophine chorionique humaine (HCG, antigène de grossesse précoce). Dans cette méthode, des anticorps appariés ciblant différents épitopes de l’antigène sont utilisés, et l’anticorps de capture est séché sur la membrane NC comme ligne de test. L’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué et l’anticorps secondaire est utilisé comme ligne de contrôle.
La figure 1B est un diagramme schématique des SCI concurrents, qui est principalement utilisé pour détecter les substances à petites molécules (MWCO < 2000 Da). L’antigène de revêtement est fixé sur la membrane NC comme ligne de test, et l’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué. Au cours de la détection, l’échantillon et l’anticorps marqué circulent à travers la ligne de détection sous action capillaire, et l’antigène enrobé se lie de manière compétitive à l’antigène libre dans l’échantillon et développe une couleur rouge sur la ligne de détection.
Récemment, nous avons décrit la procédure de génération d’anticorps monoclonaux contre des produits naturels19. Dans ce travail, nous avons développé un nouveau test immunologique à flux latéral basé sur l’anti-SSD mA20 préparé pour une détection rapide sur site. Les résultats indiquent que le test d’immunochromatographie est un outil indispensable et pratique pour détecter les composés naturels dérivés de produits.
Figure 1 Schéma du test d’immunochromatographie (A) Bandelettes de test immunochromatographiques sandwich. (B) Bandelettes de test immuno chromatographiques compétitives indirectes. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.,201821. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, nous présentons un protocole pour la préparation de mAbs contre de petites molécules dérivées de produits naturels. Les étapes essentielles et les questions nécessitant une attention particulière dans la procédure ont été décrites, et nous avons démontré l’utilité de ce protocole en utilisant le SSD à petite molécule comme exemple. Des exemples de spectres, d’images TEM, de résultats quantitatifs et d’investigations méthodologiques sont présentés dans des données représentati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Fonds spéciaux pour la recherche fondamentale des établissements d’enseignement supérieur affiliés aux départements centraux. Nous apprécions le soutien de l’équipe de recherche fondamentale sur la prescription classique de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
