Methanojenik Saf Kültürlerden ve Çevre örneklerinden Poliglutamat Kuyruk Uzunluğunun Analizi için Cofactor _F420 Ekstraksiyonu

_F420, hem Archaea hem de ^{Bacteria1,2’nin} birincil ve ikincil metabolik süreçlerinde zorunlu iki elektronlu hidrit taşıyıcısı olarak işlev gören yaygın ancak genellikle ihmal edilen bir kofaktördür. _F420, 5 deazaflavindir ve yapısal olarak flavinlere benzer, böylece kimyasal ve biyolojik özellikleri NAD⁺ veya NADP ⁺ ile daha karşılaştırılabilir. İzoalloksiazin halkasının 5 pozisyonunda karbonlu azot ikamesi nedeniyle, güçlü bir redüktanttır, böylece -340 ^mV1,3 düşük standart redoks potansiyeli sergiler^. _F420, 5-deazaflavin halkası ve 2 fosfo-L-laktat bağlayıcıdan (_F420-0) oluşur. Moleküle (_F420-n+¹⁾4 n+1 glutamat monomerleri içeren bir oligaoglutamat kuyruk takılabilir.

Uzun zamandır, cofactor _F420 sadece Archaea ve Actinobacteria ile ilişkilendirilmiştir. Bu büyük ölçüde devrildi. Son analizler, _F420’nin phyla Proteobacteria, Chloroflexi ve potansiyel olarak Firmicutes’in çeşitli anaerobik ve aerobik organizmaları arasında dağılmayan toprak, göl ve insan bağırsağı gibi sayısız habitatta yaşadığını ortaya ^koydu1,5. 2019’da Braga ve ^ark.6, proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica’nın çeşitli habitatlarda yaygın olabilecek 2 fosfolactate kuyruk yerine 3 fosfolycerat içeren benzersiz bir _F420 türevi ürettiğini gösterdi. Archaea etki alanında, _F420 metanojenik7, metanotrofik8,9 ve sülfat azaltıcı ^{siparişler10} dahil olmak üzere çeşitli soylarda bulunmuştur ve Thaumarchaeota11’de üretilmesi beklenmiştir. _F420 en iyi hidrojenotrofik ve methylotrofik metanogenezde temel bir redoks koenzim olarak bilinir. _F420’nin (_F420H2) azaltılmış formu, metilennetetrahydromethanopterin (metilen-H4MPT, Mer) ve metilen-H4MPT12,13’ün azaltılması için bir elektron donörü olarak işlev görse de işlev ^görsedir. Sitokrom içeren metanojenlerin _H2 bağımsız elektron taşıma yollarında elektron taşıyıcı olarak da ^{kullanılabilir12,14}. Ayrıca, _F420’nin oksitlenmiş formu, metanojenlerin mikroskobik olarak tespitini kolaylaştıran 420 nm’de eksize edilen karakteristik bir mavi-yeşil floresan vardır (Şekil 1). Düşük redoks potansiyeli nedeniyle, _F420 (i) aksi takdirde recalcitrant veya toksik organik bileşiklerin geniş bir spektrumunun eksojen azaltılmasını kolaylaştırır, (ii) streptomisitlerde (phylum Actinobacteria) tetrasiklin ve linkozarit antibiyotiklerinin veya fitokoksinlerin sentezi ve (iii) mikobakterilerde oksidatif veya nitrosatif strese veya diğer elverişsiz durumlara karşı direnç (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, _F420 bağımlı oksidoreductases, endüstriyel ve farmasötik amaçlar için ve kontamine ortamların biyo-işletimi için biyokatalistler vaat ^ediyor1,23. Bu son bulgulara rağmen, kofaktör _F420’nin kesin rolleri Actinobacteria veya diğer bakteriyel phyla’da hala marjinal olarak bilinmektedir.

_F420 biyosentezi için en az üç yol vardır2,6,24. Başlangıçta, biyosentez yolu 5-deazaflavin biyosentez ve 2 fosfolactate metabolizma dalı olarak ayrılır. _F420 molekülünün reaktif kısmı, tirozin ve 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione substratları kullanılarak FO-synthase yoluyla sentez edilir. Sonuç riboflavin seviyesi kromofor _FO’dur. Şu anda kabul edilen laktat metabolizması dalında, L-laktat bir L-laktat kinaz (CofB) tarafından 2 fosfo-L-laktata ile fosforilasyon edilir; 2-fosfor-L-laktat, sırayla, 2-fosfor-L-laktat guanylyltransfeaz (CofC) tarafından L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine guanylated edilir. Bir sonraki adımda, L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine, _F420-02’yi oluşturmak için 2 fosfo-L-laktat transferaz (CofD) ile _FO’ya ^bağlanır. Son olarak, _F420-0:ɣ-glutamil ligaz (CofE) enzimi glutamat monomerlerini _F420-0’a bağlar ve son kofaktör6’yı değişen sayılarda ^{oluşturur23,25}. Farklı organizmalar, ekli glutamat kalıntılarının sayısında farklı desenler gösterir ve metanojenler için mikobakterilere göre daha kısa kuyruklar bulunur2,25,26. Genellikle, metanojenler kuyruk uzunluklarını iki ila üç arasında gösterir, asetoklastik metanojende beşe kadar, Methanosarcina sp., Mycobacterium sp.’de bulunan kuyruk uzunlukları ise beş ila yedi glutamat kalıntısı arasında değişmektedir2,25,26,27. Bununla birlikte, son bulgular, uzun zincirli _F420’nin kısa zincirli _F420’den daha yüksek bir benzeğe sahip _F420 bağımlı oksitodikozlara bağlandığını göstermiştir; ayrıca, bağlı uzun zincirli _F420, substrat benzeşimini arttırır, ancak ilgili enzimlerin ciro oranını ^azaltır23.

Kofaktör _F420’nin tespiti genellikle floresansına dayanır. Böylece, oligo glutamat türevleri ters faz (RP)-^HPLC27,28 kullanılarak ayrıldı. Son zamanlarda, Ney ve arkadaşları RP-HLPC’deki ayrımı başarıyla artırmak için negatif yüklü glutamat kuyruğu için iyon eşleştirme reaktifi olarak tetrabutylammonium hidroksit ^{kullandılar5}. Burada, sadece saf kültürlerden _değil, aynı zamanda farklı çevresel örneklerden (yani topraklar ve digester çamuru) numunelerin hazırlanması, sonraki liziz, ekstraksiyon, saflaştırma, ayırma ve koordinasyon için bir yöntem sunuyoruz.