Извлечение кофактора _F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

_F420 является широко распространенным, но часто игнорируемым кофактором, который функционирует как облигатный двухэлектронный гидридный носитель в первичных и вторичных метаболических процессах как архей, так и бактерий1,2. _F420 представляет собой 5-деазафлавин и структурно похож на флавины, благодаря чему его химические и биологические свойства более сопоставимы с свойствами NAD⁺ или NADP⁺. Благодаря замещению азота углеродом в положении 5 изоаллоксазинового кольца, он является сильным восстановителем, проявляя при этом низкий стандартный окислительно-восстановительный потенциал -340 ^мВ1,3. _F420 содержит 5-деазафлавиновое кольцо и 2-фосфо-L-лактатный линкер (_F420-0). Хвост олигоглутамата, содержащий мономеры глутамата n+1, может быть присоединен к молекуле (_F420-n+1)⁴.

Долгое время кофактор _F420 был связан исключительно с археями и актинобактериями. Это в значительной степени было отменено. Недавние анализы показали, что _F420 распределен среди различных анаэробных и аэробных организмов типа Протеобактерий, Хлорофлекси и потенциально Фирмикутов, населяющих мириады мест обитания, таких как почвы, озера и кишечник ^{человека1,5}. В 2019 году Braga et ^al.6 показали, что протеобактерия Paraburkholderia rhizoxinica производит уникальное производное _F420, содержащее 3-фосфоглицерат вместо 2-фосфолактатного хвоста, который может быть широко распространен в различных местах обитания. В пределах домена Archaea, _F420 был обнаружен в нескольких линиях, включая метаногенный7, метанотрофический8,9 и сульфатредуцирующий ^{порядки10}, и предполагается, что он производится в Thaumarchaeota11. _F420 наиболее известен как незаменимый окислительно-восстановительный коэнзим в гидрогенотрофном и метилотрофном метаногенезе. Восстановленная форма _F420 (_F420H2) функционирует как донор электронов для восстановления метилентетрагидрометаноптерина (метилен-H4MPT, Mer) и метенил-H4MPT12,13. Он также может быть использован в качестве носителя электронов в _{H2-независимых} путях переноса электронов метаногенов, содержащих цитохромы12,14. Более того, окисленная форма _F420 обладает характерной сине-зеленой флуоресценцией при возбуждении при 420 нм, что облегчает обнаружение метаногенов микроскопически (рис. 1). Благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу _F420 способствует (i) экзогенному восстановлению широкого спектра непокорных или токсичных органических соединений, (ii) синтезу тетрациклиновых и линкозамидных антибиотиков или фитотоксинов в стрептомицетах (тип актинобактерий) и (iii) устойчивости к окислительному или нитрозативному стрессу или другим неблагоприятным условиям у микобактерий (тип Актинобактерий)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Следовательно, _{F420-зависимые} оксидоредуктазы являются перспективными биокатализаторами для промышленных и фармацевтических целей, а также для биоремедиации загрязненных ^сред1,23. Несмотря на эти недавние результаты, точные роли кофактора _F420 все еще незначительно известны в актинобактериях или других бактериальных типах.

Существует, по крайней мере, три пути биосинтеза _F4202,6,24. Вначале путь биосинтеза расщепляется на 5-деазафлавиновый биосинтез и 2-фосфолактатную ветвь метаболизма. Реакционноспособную часть молекулы _F420 синтезируют через _{FO-синтазу} с использованием субстратов тирозина и 5-амино-6-рибитиламино-2,4(1H, 3H)-пиримидиндиона. Результатом является уровень рибофлавина хромофора _FO. В пределах принятой в настоящее время ветви метаболизма лактата L-лактат фосфорилируется до 2-фосфо-L-лактата L-лактат-киназой (CofB); 2-фосфо-L-лактат, в свою очередь, гуанилируется до L-лактил-2-дифосфо-5′-гуанозина 2-фосфо-L-лактат гуанилилтрансферазой (CofC). На следующем этапе L-лактил-2-дифосфо-5′-гуанозин связывается с _FO 2-фосфо-L-лактат-трансферазой (CofD) с образованием _F420-02. Наконец, фермент _F420-0:ɣ-глутамиллигаза (CofE) связывает мономеры глутамата до _F420-0, образуя конечный кофактор6 в различных ^{количествах23,25}. Различные организмы демонстрируют разные закономерности в количестве прикрепленных остатков глутамата, причем более короткие хвосты обнаруживаются для метаногенов, чем у микобактерий2,25,26. Как правило, метаногены показывают длину хвоста от двух до трех, с пятью в ацетокластическом метаногене, Methanosarcina sp., в то время как длина хвоста, обнаруженная в Mycobacterium sp., варьировалась от пяти до семи остатков глутамата2,25,26,27. Однако недавние результаты показали, что длинноцепочечный _F420 связывается с _{F420-зависимыми} оксидоредуктазами с более высоким сродством, чем короткоцепочечный _F420; кроме того, связанный длинноцепочечный _F420 увеличивает сродство субстрата, но уменьшает скорость оборота соответствующих ^{ферментов23}.

Обнаружение кофактора _F420 часто основывается на его флуоресценции. Таким образом, его производные олиго глутамата были разделены с использованием обратной фазы (RP)-^HPLC27,28. Недавно Ney et al. использовали гидроксид тетрабутиламмония в качестве реагента ионного спаривания для отрицательно заряженного хвоста глутамата для успешного улучшения разделения на RP-HLPC5. Здесь мы представляем способ подготовки образцов, последующего лизиса, экстракции, очистки, разделения и количественной оценки кофактора _F420 не только из чистых культур, но и из различных образцов окружающей среды (т.е. почв и осадка реактора).